Summary
胎児および新生児のマウスで左心室圧（LV）を測定することが記載されています。圧は超音波ガイド下のLVに液体で満たされたトランスデューサーに接続された針を挿入することによって測定されます。ケアは実験プロトコルの間に正常な心臓機能を維持するために注意する必要があります。
Abstract
血圧は、脊椎動物の胚及び生後発達の間に大幅に増加します。マウスにおいて、血流は、胚日（E）8.5約1最初に検出可能である。収縮期左心室（LV）の圧力はE9.5で2 mmHgとE14.5 2で11 mmHgである。肋骨と皮膚が完全に開発されていないため、これらの中期胚の段階で、LVは侵襲的な圧力測定のための胸壁を通してはっきりと見えるようになります。 E14.5および出生（約E21）の間の撮像方法は、LVを表示するために使用する必要があります。出生後、30日から動脈圧の上昇を意味する-生後から70 mmHgで（P）2 - 35 3。 P20を超えて、動脈圧は、ソリッド·ステート·カテーテル（すなわち、ミラーまたはScisense）で測定することができます。 P20の前に、これらのカテーテルは、マウスの動脈と動脈圧を開発するためには大きすぎるが液体で満たされた圧力変換器3またはガラスマイクロピペットATTに接続されているカスタム引っ張らプラスチックカテーテルを用いて測定する必要がありますサーボヌル圧力トランスデューサ4に痛んだ。
我々の最近の仕事は、血圧の最大の増加5-7マウスの出生後早期に後期胚の発生したことを示している。血圧のこの大幅な増加は、発展途上動脈の平滑筋細胞（SMC）表現型に影響を与え、重要なメカノイベントをトリガすることができる。開発動脈の機械的性質は、細胞外マトリックスタンパク質（すなわち、マルファン症候群8および大動脈弁上狭窄9）の欠陥によって侵害され、ヒトの疾患では、この期間中に血圧の急激な変化は、メカノの変化を介して疾患の表現型および重症度に貢献するかもしれない信号。したがって、ヒト疾患のマウスモデルの後期胚および新生児の期間中の血圧の変化を測定できるようにすることが重要です。
我々は後半にLV圧を測定する方法について説明します。胚（E18）と出生後早期（P1 - 20）マウス。液体で満たされた圧力変換器に接続されている針は超音波ガイド下LVに挿入されます。ケアは、特にマウス胎児のために、実験プロトコルの間に正常な心臓機能を維持するために取られます。代表的なデータが提示され、プロトコルの制限が議論されています。
Protocol
1。超音波と圧力システム
- メーカーの指示（VEVO 770、Visualsonics）に応じて超音波システムを起動します。蒸留水で超音波システムに接続する - 適切なプローブ（P7 =モデル708、年齢> P7 =モデル707B年齢E18）を記入してください。 LV頂点を射出アームに向かって指摘されるように、イメージングプラットフォームに搭載されたマウスのLV長軸像を得るために必要なおおよその方向に調節可能なスタンドにプローブを配置します。
- 圧力システムは、液体で満たされた圧力変換器、ブリッジ·アンプ、データ·アクイジション·システムとデータ記録ソフトウェア（LabChart）で構成されています。接続は、三方コック、チューブ、ルアーロックとホース棘で構成されています。 20mLの注射器は、一端にフラッシングの10％ヘパリン生理食塩水で満たされている。もう一方の端は、針に接続し、3 mLの注射器本体は、射出アーム（図1）針チューブを保持する筐体として使用するために変更されています。
- 超音波システムの注入群では針のチューブとケーシングをマウントします。イメージングプラットフォームのおおよその高さのリングスタンドに圧力変換器をクランプします。針管へ - マウスの年齢（P3 = 30G、年齢> P3 = 25G年齢E18）に適した針を取り付けます。小さい針が容易に詰まる、胸の壁を通って進むと、遅い応答時間を持つことが難しくなります。したがって、LV内腔に収まる最大の針のサイズは、各年齢のために使用されます。
- イメージング·プラットフォーム上で超音波ゲルのマウンドを置き、慎重に針をイメージングプローブ（図2）の中央下にゲルに直接進めることができるように、調節可能なスタンドを使用してプローブを並べる。針は十分プローブ以下はない穿刺プローブカバーしますが、プローブ焦点深度内であることに十分近くになければなりません。必要であれば、それが目に残るように、針は手で曲げることができるその旅行全体の電子正しい面。
- アライメントを維持し、針を撤回し、イメージングプラットフォームの上にマウスを配置するイメージングプローブを上げる。先端を入力した可能性があり、任意のゲルを除去するために針をフラッシュします。
2。マウスの準備
- このプロトコルに示されているすべてのメソッドは、動物実験及び利用委員会によって承認されました。イソフルラン1.5％の連続した吸入によって - タイミング妊娠中の母親（E18）または新生児マウス（20 P1）麻酔。チューブは、早期新生児マウス（ - 15 P1）の小さな頭を収容するために標準のノーズコーンに挿入することができます。
- LV頂点は、射出アーム側に向けて背臥位の位置に超音波システムのイメージングプラットフォームにマウスを固定します。妊娠中の母親については、添付の心電図の検出器で心拍数を監視し、体温のフィードバック制御のための直腸温度計を挿入するために超音波ゲルを適用します。新生児マウスは小さすぎるfはまたはこれらの検出器なので、心拍数は、圧力測定の間に監視され、体温は、外部からの熱ランプで維持されています。
- 脱毛クリームと若いマウスの妊娠中の母親や胸部の腹部から髪を削除します。新生児マウス（P1 - 10）は、任意の脱毛を必要としません。
- 妊娠中の母親のために、解剖ハサミと湾曲した鉗子を用いて腹部を切り開く。暖かい食塩水で湿らせたガーゼで1つ子宮角と場所を外部化します。慎重に超音波プローブを用いたLVの胸骨長軸像を得るための適切な位置に胚を操作します。他の子宮角を外部化する前に、この側のすべての胚内の圧力を測定します。すべての胚および暖かい生理食塩水を定期的に添加した湿った母親の腹部を保持します。
3。圧測定
- 場所は、胎児または新生児マウスの脱気超音波ゲルを温め。 Dされていない新生児マウスepilatedは、残りの超音波ゲルが結合を強化するために適用される前に、彼らの胸にこすり超音波ゲルの少量を持っている必要があります。イメージングプローブを下げ、最適な胸骨LV長軸像を得るためにイメージングプラットフォームの角度を調整します。針の配置が失われるため、プローブの角度を調整しないでください。
- 超音波画面でLVの画像をモニタリングしながら、プローブの底の近くになるまで、ゆっくり針を進めています。アラインメントのシフトを修正するために、必要に応じて、針とプローブの位置を調整します。静かに生理食塩水で針をフラッシュします。記録圧力データを起動し、LabChartソフトウェアと圧力変換器をゼロに。トランスデューサは、温度や位置に漂うので、各マウス内の圧力を測定する前に、それをゼロにすることが重要です。
- それは超音波画像の端に見られるが、まだLVにできるようになるまで、ゆっくり針を進めています。必要に応じてでLVを入力するには、針の位置を調整頂点。針の明確なイメージを維持するためにプローブの位置を、必要に応じて調整します。圧力データを記録し、超音波画像上の針の位置を監視しながら、LV内腔（図3）に針を進める。圧力トランスデューサからの拍動記録の開始は、LV内腔（図4）内の場所を確認します。
- 針は、LV内腔にあるように見えますが、圧力上昇が（約5から10μLボリューム）が検出された直前までの圧力の録音は、シリンジのプランジャーの光タップと同じ高さに拍動性ではない場合。これは、正確な読み取りを防止している可能性のある下駄をクリアする必要があります。圧力の測定値はまだ脈動ない場合は、針が正しい平面の上または下かもしれないとLV内腔に挿入されません。再び生理食塩水、事前にフラッシュ、針を撤回。拍動性の測定値はまだ得られない場合は、次のマウスに移動。各マウスの新しい針を使用しています。
- 成功した圧力の測定値は、75％から入手できます。胎児および新生児のマウスでは、試みた。測定値は、5を取るべきである - 心率が予想よりも大幅に異なっている場合は10分ごとおよびマウス用の圧力データが含まれるべきではありません（図5A）。心拍数は、心血管対策に大きな影響を持っており、変更された心拍数は心臓の苦痛を示すものである。胎児の苦痛は通常1が発生した - 1.5時間子宮の最初の外在化した後なので、速度が全体のごみの圧力を測定するために重要である。
4。代表的な結果
示されているすべての結果はC57BL6Jマウス用です。図3に示すようにP1マウスのLV内腔に針のイメージ。針は穿刺胸壁に必要であり、小型のLV内腔へのアクセスを得るが、それはかなりの圧力システムの応答時間を向上させます。圧力のおおよそのステップ増加が手動でシステムに適用されると、最大圧力の67％に達するまでの時間は0.067 SEです。唯一のチューブ（可能性が最も高い圧力のステップを適用するには、実時間を示す）と、30 Gの針で25 Gニードルと0.529秒と0.105秒最大圧力に達するの遅延は、図4Aおよび4Cに示すように、完全なトレーシングで見ることができます。応答時間は、30Gの針と遅くなりますが、心拍数は、マウス5で加齢とともに増加するため、波形が良く、胚と早期新生児の段階で捕捉されます。この制限にもかかわらず、収縮期血圧は、真のLV拡張期（最低）圧力がゼロであると仮定して計算し、収縮期（最大）LV圧力は2倍の定常状態での測定値（図4Bと4Dから決定される平均LV圧であることができます6）。これは、一般的に収縮期LVと動脈圧が等しいことを前提としています。 E18とP14の間に様々な年齢のための心拍数を測定し、計算されたLVの圧力は、図5に示されています。
図1：添付の三方活栓と圧力変換器の画像は、男性（M）と女性（F）ルアーロック接続、ホースバーブ、チューブ、注射器と針。
図2の画像イメージングプローブ（）を使って針を揃えるために設定します。イメージングプラットフォームは、マウスのLVの頂点は、射出アームに直面しているように回転させる。プローブは、LV長軸画像を得るために必要なおおよその方向に調節可能なスタンドにマウントされています。針管の筐体は、射出アームにマウントされています。針は、イメージングプローブ（B）に対して適切な角度と垂直方向と水平方向の位置を決定するためのイメージング·プラットフォーム上での超音波ゲルのマウンドに進出されています。
図3。針のイメージ（N）は（CW）胸壁を通って進めてP1マウスのLV腔へ。スケールバーは= 0.1 mmである。
針がE18のLV（）とP14（C）マウスに入ると、 図4の例脈動圧力の測定値。針を取り付けたシステムの応答時間に起因する定常状態に達するの遅れがあります。定常状態での測定値のズームビューが最小E18 LV圧力がゼロに近いですが、ゼロから最大圧力への完全な波形がP14マウスのより高い心拍数で記録することはできませんBとDの注に示されています。平均圧力が定常状態の測定値から測定され、それはLV収縮期圧= 2×測定した平均圧力と仮定します。
図5に測定された心拍数（A）と（B）E18のために計算された収縮期LV圧力- P14マウス。 P3はP1、22 E18のためにN = 7、5、P14のためのP7の23と16
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Discussion
ここで紹介するプロトコルは、後半の胚と早期新生児マウスのLV圧を測定する方法を提供する。このプロトコルの主な制限は、圧力システムの時間分解能である。それは器に針を通してLVから移動する、唯一の圧力値が記録されることを意味するように圧力信号が減衰されています。減衰は、可能な最大の針を使用することによって最小限に抑えることができますが、針は、さまざまな高齢者のマウスのLV内腔に収まる必要があります。拡張期血圧がゼロのように近似することができるので、LV、その結果、動脈の収縮期血圧は平均LV圧の測定値から計算することができます。追加の動脈変数（すなわち脈圧）が理想的ですが、収縮期血圧は、マウスの開発中に心臓や血管系に作用する力に関する貴重な情報を提供します。このプロトコルの利点は、高いthroughpuの測定のしやすさ、スピード、再現性です。様々なマウスの遺伝子型や治療プロトコルのT比較。重要な発達段階での収縮期血圧を測定することによって、我々は機械的な力と人間の病気の結果として心臓や血管系の構造と機能の間の相互作用を理解し始めることができます。
ソリッド·ステート·カテーテルは、圧力測定のゴールドスタンダードとみなされ、液体で満たされたトランスデューサーに比べて優れた時間分解能を持っています。ソリッド·ステート·マウスカテーテルの標準的なサイズは1.0F（0.33ミリメートル、ミラー）、1.2F（0.4ミリメートル、Scisense）または1.4F（0.47ミリメートル、ミラー）です。我々は、1.2F Scisenseカテーテルと1.4FミラーカテーテルとP30マウスを用いたP21よりも古いマウスの良い動脈圧の測定値を取得します。我々はP14マウスで1.0Fミラーカテーテルを試してみましたが、一貫性のある動脈圧の測定値を取得できませんでした。 P21マウスでは、我々は、1.2F Scisenseカテーテルから動脈の圧力で私たちの収縮期LV圧の測定を比較した。計算された収縮期左心室の血液すべてのマウスの圧力（67±5 mmHg）で収縮期動脈圧（87±9 mmHg）でより一貫して低かったと非常にソリッド·ステート·カテーテルで測定した平均動脈圧（65±8 mmHg）を近くにしましたが、両方のカテーテル遺伝子型5の間に有意な差を同定した。この理由のために、我々は唯一のE18へP20マウスで説明したLV圧力方法をお勧めします。プルプラスチック製のカテーテルは、流体で満たされた圧力変換器に接続し、動脈圧測定3を得るために頸動脈を介して進めることができます。しかし、このシステムはまだ唯一のレコードは、圧力測定を意味し、私たちの手でより多くの時間がかかりましたし、LV圧の測定は、ここで紹介するよりも高い故障率を持っていた。サーボヌル圧力システム（ワールド·精密機器）は、小型の圧力を測定するため、より高い解像度を持ち、優れた時間分解能4を持っています。しかし、サーボヌルシステムは、通常非導電性マイクロピペット、GLを必要とするお尻、古いマウスの胸壁を介して進めることができません。測定部位に挿入するために。
目を覚ましたマウスにこれらの圧力測定値を外挿する際に麻酔薬の影響を考慮する必要があります。それはイソフルランは心血管系への影響10を最小限にするための最良の選択であり、すべてのマウスが同じ方法で麻酔している場合、異なるグループ間の比較が有効になることが示されている。胎児および新生児のマウスは標準ECGおよびイメージングプラットフォーム上の温度プローブ用には小さすぎる。心拍数は、圧力の録音で、超音波画面上の鼓動LVの可視化による監視する必要があります。非常に遅い心拍数を表示し、任意のマウスは、心臓の苦痛であってよいと圧力の分析に含まれるべきではありません。マウスは、保温する必要があり、胚のマウスは、実験プロトコルを通して湿った保つ必要があります。他の研究者らは、温かい生理的なサリンに胚を浸漬する方法を設計しました撮像期間11を通して電子が、我々は熱ランプと温かい生理食塩水の定期的なアプリケーションは簡単な実験期間中に予想される心拍数との健全な胚を維持するのに十分であることを見出した。露光時間は約1時間に抑えられている限りとして、我々は、測定の最初と最後の胚との間に有意な変動を観察していませんが、測定値は、全体のごみに関するデータを収集するために迅速に実行する必要があります。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NIHの助成金HL087653とHL105314によって、部分的に資金を供給された。メソッドのいくつかは、医学のワシントン大学で博士ロバートMechamの研究室で開発されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High resolution ultrasound system | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | Or other appropriate ultrasound system |
| High frequency ultrasound probes | VisualSonics, inc. | 708 and 707B | |
| Imaging platform and injection arm | VisualSonics, inc. | Imaging Station 2 | With ECG and temperature feedback control of platform |
| Pressure transducer | ADInstruments | MLT 844 | |
| Bridge amplifier | ADInstruments | ML221 | |
| Data acquisition system | ADInstruments | ML866 | |
| Data recording software | ADInstruments | LabChart | |
| Ring stand and clamp | Various | To hold pressure transducer during measurements | |
| 3-way stopcocks with luer connections, male lock | Cole-Parmer | 30600-02 | |
| 1/16" ID Tygon Tubing | Cole-Parmer | 06408 | |
| Male and female luers w/ 1/16" hose barb | Cole-Parmer | 45510-50 45510-00 | |
| 24" tubing with male and female luer at each end | Cole-Parmer | 30600-60 | |
| 3 and 10 mL syringes | BD Biosciences | ||
| 30 and 25G needles | BD Biosciences | 1.5 inches in length | |
| Big Ben manometer | Riester | 1456-100 | |
| Saline | Various | ||
| Heparin | Various | ||
| Ultrasound gel | Parker Hannifin Corporation | Aquasonic 100 | |
| Hair remover lotion | Nair |
References
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