Summary
방법에 의한 하와이의 꼬리 자른 오징어 절차를 간략하게 설명
Abstract
특정 박테리아는 동물 조직을 1-5으로 협회에서 발견된다. 이러한 호스트 세균성 협회는 (symbioses) (병원성) 해로운가 될 수없고 피트니스 결과 (공생)가없는, 또는 (mutualistic) 유익합니다. 많은 관심은 병원성 상호 작용 부여되어 있지만, 거의가 환경에서 공생 / 유익한 박테리아의 재현성 인수를 지시하는 프로세스에 대해 알려져 있습니다. 해양 그람 음성 세균 사이의 가벼운 장기 mutualism V. fischeri와 하와이 꼬리 자른 오징어, E. scolopes는 하나의 호스트 (E. scolopes)는 자사의 일생 6,7의 과정 전반에 걸쳐 하나의 세균 종 (V. fischeri)와 공생 관계를 수립하는 매우 구체적인 상호 작용을 나타냅니다. V. 제작한 Bioluminescence 이 상호 작용하는 동안 fischeri는 엑스타시의 안티 육식 혜택을 제공합니다 야행성 활동 8,9 중 scolopes 반면영양이 풍부한 호스트 조직을 제공 V. 보호 틈새 10과 fischeri. 각 호스트 생성하는 동안,이 관계는 따라서 공생 발전의 다양한 단계에서 세부 평가 수있는 예측 가능한 프로세스를 대표 recapitulated있다. 첫 번째 30~60분 내에 수집 symbiont없는 물로 전송하는 경우 실험실에서 청소년 오징어 해치 aposymbiotically (uncolonized), 그리고는, 실험 inoculum 6에 의한 경우를 제외하고 식민지하실 수 없습니다. 이 상호 작용함으로써 환경 11,12의 공생 미생물의 특정 취득으로 이어질 개별 단계를 평가하는하는 유용한 모델 시스템을 제공합니다.
여기 새로 aposymbiotic E.을 꾸몄다고 때 발생하는 식민지의 정도를 평가하는 방법을 설명 scolopes는 (인공)이 포함된 해수에 노출되는 V. fischeri 있습니다.이 간단한 분석은 접종, 자연 감염 및 복구에 대해 설명E.의 초기 조명 장기에서 세균성 symbiont의 scolopes. 케어는 특히 수질과 라이트 단서와 관련하여, 공생 개발하는 동안 동물을위한 일관된 환경을 제공하기 위해 가져옵니다. 설명 공생 인구를 특성화하기위한 방법은 bacterially-파생 bioluminescence (1) 측정 및 회복 symbionts의 계산 (2) 직접 식민지를 포함합니다.
Protocol
1. 세균성 Inocula의 작성
- 데이 0
오징어 접종, 접시 LBS에 관련된 박테리아 변종 13 한천 이전 이틀. - 25-28 ° C에서 하룻밤 사이에 박테리아를 품어.
- 1 일
각 V. 중 하나를 식민지로 유리 문화 튜브의 중간 세 ML LBS의 예방 감염 fischeri 변형. 백업으로 튜브를 복제 준비합니다. - 날 2
(오징어 단계 3.7-3.10와 세균 단계 1.4-1.6 조정)
이전 접종 1 H, subculture 박테리아 유리 문화 튜브 3 ML의 LBS에 1:80 (37.5 μl)와 폭기 : 1 개 H 위해 성장. - 접종 이전 시료의 OD 600을 측정합니다. 일반적인 측정은 0.3-0.6 변형에 따라 있습니다.
- Inoculum 볼륨 (μl) = 1.25 / OD 60 : 3-5 X의 대상 inoculum 내용 10 3 CFU / ML은 다음과 같이 inoculum 볼륨을 계산0 (예 : OD 600 = 0.5, 계산 inoculum 볼륨 = 1.25/0.5 = 2.5 μl).이 금액은 단계 4.1 오징어를 포함하는 바닷물에 직접 추가됩니다. 이 계산 V.의 여러 변종에 따라 조정해야 할 수도 있습니다 fischeri 또는 여기에 지정된 것보다 낮은 또는 높은 수준의 접종입니다.
2. Inocula의 열거를위한 한천 플레이트의 작성
- 각 치료 단계 4.1 inoculum의 플레이트 샘플에 대한 레이블 LBS 플레이트 (대우 당 2).
- 판 당 5 멸균 도금 구슬을 추가합니다.
3. 오징어 점이 모음집
- 굴절계를 사용하여 인스턴트 바다의 염분을 측정하는 35 ‰로 조정합니다.
- 필터 - 살균 인스턴트 오션 (FSIO)를 생성하는데, 여과 장치와 연결된 진공 라인 또는 진공 펌프를 사용하여 인스턴트 오션 1 패을 필터링합니다. 각 분배에 적극적으로 사전에 소용돌이에 의해 산소를 물. 일전자 필터 유닛은 2 일 동안 활용할 수 있습니다.
- 두 (2) 일회용 샘플 그릇의 각으로 나누어지는 FSIO의 40-50 ML합니다. 라벨 earlies 같은 하나 timelies 같은 하나.
- 피펫에게 가장 낮은 산등성이 위에 팁을에서 약 1 센티미터, (그림 3 참조) 절단하여 청소년 오징어 취득을위한 플라스틱 전송 pipettes의 초과를 준비합니다. 이것은 오징어 수령시 합격 할수있는 넓은 공간을 용이하게합니다. 거친 노출된 표면이있는 모든 전송 pipettes 폐기하십시오.
- 준비된 전송 pipettes 사용하여 E. 수집 하룻밤 사이에 부화하고 FSIO의 earlies 그릇에 전송되는 scolopes. 조기 hatchlings 1 이상 H 위해 계란 시스템에 왔고 오염에 의해 식민지로 감염될 수 있습니다했습니다 V. 계란 시스템의 fischeri. 민감한 식민지 실험을 위해 earlies를 사용하지 마십시오.
- 계란 탱크에게 새로운 hatchlings 때마다 30-45 분를 확인하십시오. 모든 hatchlings는 각 사용자 동안 해제되는 것을 보장도대체. FSIO의 timelies 그릇으로 전송 피펫, 그리고 예금과 hatchlings를 제거합니다. 적시에 수집 동물 식민지 실험에 사용할 수 있습니다.
- 수집이 완료되면 (~ 45 분 황혼 이후), 주요 연구실로 오징어를 전송합니다. 경험적으로 그것은 3 시에 예방 접종에 대한 중단 실험실 조명 조건 하에서 동물을 식민지에 유리합니다.
- 각각의 치료, 40 ML FSIO와 그릇을 준비합니다. (최대 N = 40 그릇 당) 분석을위한 그릇에 오징어를 추가합니다.
- aposymbiotic (부정적) 제어로 추가 그릇을 준비합니다.
- 각 치료 전용 전송 피펫을 준비합니다.
- 2 %의 에탄올에 추가 오징어를 안락사.
4. 오징어 콜로니
- 주 2 - P10 Pipetman를 사용하여, 각 치료를 위해 각 오징어 덮밥 (3.8 단계)로 박테리아의 계산 나누어지는 (단계 1.5) 분배. 즉시 3 시에 타이머를 시작합니다첫 번째 접종.
- 각 치료의 경우 그릇의 가장자리 근처에 피펫을 넣어 약 10 초 동안 물 오징어를 섞어 반복하고 아래까지 pipetting하여 전용 전송 피펫과 그릇 "소용돌이"를 만듭니다. 혼합 철저한가 중요합니다.
- 2.2 단계에서 LBS 한천 플레이트를 향해 각 그릇의 플레이트 50 μl가 (기술에 대한 치료 당 번호판이 50 μl 번호판을 복제합니다.) 25-28 ° C에서 하룻밤 사이에 알을 품다.
- 각 치료 세차 그릇 (100 ML FSIO / EA)를 준비합니다.
- 각 오징어에 대한 Drosophila 튜브를 (4 ML FSIO / EA) 준비합니다.
- 정확히 3 시에 후, 각각의 세차 그릇 (모든 치료 완료)로 오징어를 전송합니다. 이것은 접종 중지됩니다.
- FSIO와 자체 Drosophila의 유리병에 각각 오징어를 전송 진행합니다. 각 치료 지정 전송 피펫을 사용합니다.
- 일 / N로 돌아가려면 오징어 시설에 Drosophila 유리병의 쟁반으로 이동항공 라이트 사이클 동물 embryogenesis 동안 경험했다.
- 3 일 - 각 오징어를 준비 Drosophila 튜브 (4 ML FSIO / EA).
- 22-24 H 포스트 - 접종시 황혼에 앞서, 새로운 Drosophila의 병을 각 오징어를 전송합니다. 각 치료 지정 전송 피펫을 사용합니다.
- 일 4 - 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 (1/squid)를 분류 준비합니다.
- 이전 46-48 H 포스트 접종, 측정의 황혼과 Drosophila의 유리병 (6의 통합 및 뚜껑 폐쇄에 자동으로 읽기위한 luminometer 세트)의 각 오징어의 발광을 기록합니다.
- 배경 발광에 대한 부정적인 통제 마찬가지로 모든 오징어를 포함하지 않는 FSIO있는 유리병을 측정합니다.
- 단계 4.12에서 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 대략 700 μl의 볼륨의 각 오징어를 전송합니다. 판지 냉동실 상자로 이동합니다. 뚜껑이있는 상자에 배치되면, 아, 아닌 박테리아의 퇴학에 대한 가벼운 단서로 제거하지 마십시오L-이해.
- -80 ° C에서 하룻밤 사이에 microcentrifuge 튜브를 고정.
5. 콜로니 레벨의 결정
- 각 오징어 들어, 475 μl FSIO (또는 70% 인스턴트 오션을 autoclaved)로 두 (2) microcentrifuge 튜브, 각각 준비합니다.
- 먼저 유봉을 청소하고 총 부스러기 및 / 또는 조직을 제거하는 Kimwipe를 사용하여 pestles을 준비합니다.
- 장소는 95 % 에탄올을 포함하는 50 ML의 비커에 팁 다운 pestles. 에탄올은 약 3cm의 높이에 추가되어 있어야합니다.
- 각 유봉 들어, 비커에서 제거하고 Kimwipe와 팁을 닦아냅니다.
- 에탄올 욕조로 다시 유봉 수영 제거하고 삽입 (최대 팁) microcentrifuge 튜브 랙에 약 15 분 동안 완전히 건조한을 발표하실 수 있습니다.
- microcentrifuge 튜브 랙에 해동의 오징어 (최대 N = 8).
- 필요한 경우, 700 μl로 볼륨을 조정합니다.
- 단계 5.5에서 유봉을 사용하여 잉크 SAC RUP 때까지 동물의 조직을 혼란tures (물이 어두운 회색 색상을 설정합니다.)
- 유봉을 제거하고 모든 조직은 튜브에 남아 보장합니다.
- 정확히 10 초 (타이머를 사용)의 소용돌이 조직 간단히합니다.
- 조직이 10 분 동안 휴식을 허용합니다. 조직이 정착되고 박테리아와 잉크 용액에 남아 있습니다. 따라 계산은 박테리아 / 잉크 솔루션은 [] 희석 (즉, 700 μl의 E. scolopes 조명 장기 homogenate)입니다. 시리얼 1시 20분의 dilutions ([B] [C]) 아래에 설명되어 있습니다.
- [B] 희석 들어, 단계 5.1에서 준비 microcentrifuge 튜브 중 25 μl []를 추가합니다. 와동.
- [C] 희석의 경우, 25 μl를 추가 [B] 단계 5.1에서 준비 microcentrifuge 튜브 중 하나. 와동.
- LBS 한천 배지를 향해 각 희석의 플레이트 50 μl, 2는 치료에 따라 복제합니다.
- 25-28 ° C에서 하룻밤 사이에 번호판을 품어.
6. 데이터 분석
- CFU / 조명 기관 (LO), coun을 계산하려면각 치료 접시 t 식민지가되는 10-400 식민지가 존재하고, 적절한 수식을 사용 :
CFU / LO = ([] 접시 식민지) × 14, 또는
CFU / LO = ([B] 접시 식민지) × 280, 또는
CFU / LO = ([C] 접시 식민지) × 5,600. - 대수 규모의 개별 데이터 포인트와 medians 잡아.
- 데이터는 종종 일반적으로 다른 차이와 함께 배포되지 않은, 그리고 outliers는 의미 생물 학적 정보를 포함할 수 있습니다. 따라서 비 파라메 트릭 테스트는 치료가 크게 차이가 있는지 여부를 결정하는 유용한 방법을 제공합니다.
- 통계 분석을 위해 GraphPad 프리즘 소프트웨어를 사용합니다. 이 치료법은 윌콕슨이 순위 합 테스트를 사용합니다. 보다보다 두 요법 간의 비교 들어, 적절한 사후 검사와 Kruskal-월리스 테스트를 사용합니다.
7. 대표 결과
샘플 식민지 분석의 결과는 그림 4에 표시됩니다. 두 변종
식민지 절차의 그림 1. 플로우 차트. 박테리아와 오징어가 지정한 inoculum에서 혼합 후, 별도로 수확한다. 오징어는 씻어되고 나서 3 시에, 24 H, 4에서 새로운 물로 전송 8 H 포스트 접종. 48 H에서 발광 측정되고 동물 얼었어,이 동물을 표면 소독을 제공합니다. 라이트 - 장기 박테리아가 -80에서 가능한 남아있는 식민지 ° C을 한쪽 해동 (별도의 냉동 해동 사이클)를 통해.
균질화 및 박테리아의 희석 도금을 보여주는 그림 2. 플로우 차트. 직렬 20 배 dilutions 식민지가 박테리아의 열거에 적절한 다이나믹 레인지를 제공합니다.
그림 3. 청소년 오징어를 손상시킬 수있는 좁은 구멍 ()에 적절하게 좁은 샤프트 테이퍼와 pipettes을 전송합니다. 가위 또는 면도날과 좁은 부분을 없애 버리려하고 전처리가 (B) 청소년 오징어를 전송하는 적절한 도구를 얻을.
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그림 4. 식민지 분석을위한 샘플 데이터입니다. inoculum 그릇에있는 박테리아의 (A) 수준. 개별 오징어의 (B) 발광. (C) 각 오징어의 식민지 카운트. 개별 오징어의 (D) 특정 발광. APO, Aposymbiotic (부정적인 제어를 uncolonized).
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Discussion
설명 식민지 분석은 통제된 실험실 환경에서 자연 공생 프로세스의 분석을 위해 수 있습니다. 따라서, 그것은 서로 다른 자연의 분리에 의한 돌연변이 종자에 의해 서로 다른 화학 정권 아래에서 식민지를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 설명된 실험에서 유사 일반적 공생의 다양한 측면을 평가하는 데 사용됩니다. 식민지의 속도론은 우연 탐지기가 제거된있는 신틸레이션 계수기에서 자동으로 감지가 가능하다 첫 24 H, 동안 발광을 조사하여 측정할 수 있습니다. 또한 다른 상대 한 변형의 상대 식민지 능력은 동물의 집합의 두 계통의 출력 비율은 입력 비율 (별개의 항생제 저항에 의한 미분 검출, 형광으로 정상화되는, 경쟁력 식민지 분석하여 측정할 수 있습니다 또는 chromogenic [LacZ / Xgal] 마커). 마지막으로, 식민지는 공촛점 micr 직접 몇 군데하실 수 있습니다oscopy.
그것은 실험을 위해 건강한 청소년 오징어를 사용하는 것이 중요합니다. 가난한 오징어 건강의 행동 지표 (동물을 안락사) 원에 수영, 또는 흰색 남아 (치료와 함께 사용) 어두운 표면에 갈색 설정하는 자신의 chromatophores을 변경하지 않는 동물을 포함합니다. 호스트 인구의 편차가 존재하는 동물 중 더 작은 숫자와 복제 실험의 큰 숫자는 종종 큰 샘플 크기와 복제 실험의 작은 숫자보다 더 가치가있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자 오징어 시설 지원이 원고에 대한 의견, 마이클 Hadfield 현장 수령시 도움 Kewalo 해양 연구소,이 프로토콜에 기여를위한 루비와 McFall-Ngai 실험실의 구성원에 대한 Gyllborg Mattias 감사드립니다. Mandel 연구소의 작품은 NSF IOS-0843633에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR international | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher Scientific | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega Corp. | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega Corp. | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster & Smith | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith | CD-16881 | Prepare at 35 ≥ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalge Nunc international | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼", lower diameter 2 ¼", height 3". Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR international | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
References
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