La méthode décrit la procédure par laquelle le calmar Hawaiian bobtail, Euprymna scolopes Et son symbiote bactérienne, Vibrio fischeri, Sont élevés séparément, puis introduit pour permettre la colonisation spécifique de l'orgue de lumière calmar par les bactéries. Détection de la colonisation par luminescence bactérienne dérivés et par le comptage de colonies directe sont décrits.
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Article de méthode
La colonisation de Euprymna scolopes Squid par Vibrio fischeri
Dans cet article
Résumé
Résumé
Bactéries spécifiques sont trouvés en association avec des tissus animaux 1-5. Ces associations hôte-bactérie (symbioses) peut être préjudiciable (pathogène), n'a pas de conséquence de remise en forme (commensal), ou être bénéfique (mutualiste). Alors que beaucoup d'attention a été portée aux interactions pathogènes, on sait peu sur les processus qui déterminent l'acquisition reproductible bénéfiques / bactéries commensales de l'environnement. Le mutualisme lumière organe entre le milieu marin bactérie Gram négatif V. fischeri et le Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, représente une interaction très spécifique dans lequel un hôte (E. scolopes) établit une relation symbiotique avec une seule espèce bactérienne (V. fischeri) tout au long de sa durée de vie 6,7. Bioluminescence produite par V. fischeri lors de cette interaction fournit un avantage anti-prédateurs à E. scolopes pendant les activités nocturnes 8,9, tandis quele tissu hôte riche en éléments nutritifs fournit V. fischeri avec une niche protégée 10. Au cours de chaque génération d'accueil, cette relation se résume, ce qui représente un processus prévisible qui peut être évaluée en détail à divers stades de développement symbiotique. Dans le laboratoire, le mineur calmars trappe aposymbiotically (non colonisés), et, si elles sont recueillies dans les 30-60 premières minutes et transféré à symbiote sans eau, ne peuvent être colonisés que par l'expérimentation inoculum 6. Cette interaction constitue donc un système modèle utile pour l'évaluation des différentes étapes qui mènent à l'acquisition d'un microbe spécifique symbiotique de l'environnement 11,12.
Nous décrivons ici une méthode pour évaluer le degré de colonisation qui se produit lorsque nouvellement éclos aposymbiotiques E. scolopes sont exposés (artificielle) d'eau de mer contenant des V. fischeri. Ce test simple décrit l'inoculation, l'infection naturelle, et la récupérationde la bactérie symbiote de l'organe de lumière naissante de E. scolopes. On prend soin de fournir un environnement cohérent pour les animaux en cours de développement symbiotique, en particulier en ce qui concerne la qualité de l'eau et signaux lumineux. Méthodes de caractérisation de la population symbiotique décrit incluent (1) de mesure de la bioluminescence des bactéries dérivés, et (2) de colonie directe comptage des symbiotes récupérés.
Protocole
1. Préparation des inoculums bactérien
- Jour 0
Deux jours avant l'inoculation calmars, plaque les souches bactériennes pertinentes sur LBS 13 gélose. - Incuber les bactéries à 25-28 ° C pendant la nuit.
- Jour 1
Inoculer 3 LBS ml de milieu dans un tube de culture en verre avec une colonie de chaque V. souche fischeri de l'infection. Préparer tubes en double que la sauvegarde. - Jour 2
(Coordonner les étapes 1.4 à 1.6 bactériennes avec des étapes de calmars 3.7-3.10)
1 h avant l'inoculation, les bact....
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Discussion
Le test décrit la colonisation permet l'analyse d'un processus naturel de symbiose dans un environnement de laboratoire contrôlé. En tant que tel, il peut être utilisé pour évaluer la colonisation par des souches mutantes, par différents isolats naturels, et sous des régimes différents produits chimiques. Variations sur les expériences décrites sont couramment utilisés pour évaluer différents aspects de la symbiose. La cinétique de la colonisation peut être mesurée en examinant la luminescence pendant les 24 pre.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier pour le soutien Mattias Gyllborg installation calmars et des commentaires sur ce manuscrit, Michael Hadfield et le Laboratoire Kewalo Marine pour l'assistance au cours de collecte sur le terrain, et les membres du Laboratoire de Ruby et McFall-Ngai pour ses contributions à ce protocole. Le travail dans le laboratoire Mandel est soutenu par la NSF IOS-0843633.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom de réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
| Les tubes de culture en verre, 16 mm de diamètre | VWR | 47729-580 | |
| Bouchons pour tubes de culture en verre | Pêcheur | NC9807998 | |
| Spectrophotomètre Visible pour la détermination de DO 600 | Biowave | CO8000 | Toute spectrophotomètre capable de mesurer DO 600 va fonctionner. Cet appareil peut mesurer la DO 600 de liquide directement dans les tubes de culture en verre. Un certain ajustement du calcul inoculum peut être nécessaire en fonction de l'instrument utilisé. |
| Glomax 20/20 monotube luminomètre | Promega | E5311 | Equivalent à la luminomètre Turner BioSystems 20/20n. Inclut le support microtube. |
| Glomax 20/20 Standard Light | Promega | E5341 | Pour l'étalonnage luminomètre. |
| Réfractomètre, ordinateur de poche | Foster et Smith Aquatics | CD-14035 | Calibrer avant chaque utilisation avec de l'eau déminéralisée. Rincer après chaque utilisation avec de l'eau déminéralisée pour éviter l'accumulation de sel. |
| Instantanée océan (artificielle concentré d'eau de mer) | Foster & Smith Aquatics | CD-16881 | Préparer à 35 ‰ dans l'eau déminéralisée, à l'aide du réfractomètre, puis filtrer à travers un filtre de 0,2 um SFCA. |
| Unité de filtration | Nalgene | 158-0020 | Sans tensioactif acétate de cellulose (SFCA) membrane, 0,2 um. Nous avons observé des résultats variables avec quelques filtres tensio-actif contenant du PSE. |
| Pipettes de transfert | Pêcheur | 13-711 -9 heures | L'aide de ciseaux ou lame de rasoir, couper la pointe proprement-dessus de la première arête d'augmenter le diamètre de l'embout de la pipette et d'éviter les serrant les nouveau-nés de calmars. |
| Bols jetables (exemples gobelets en plastique) | Comète | T9S (9 onces) | Bols pour l'inoculation, avec un diamètre supérieur de 3 ¼ ", diamètre inférieur de 2 ¼", hauteur 3 ". Bols de créer un environnement homogène car ils n'ont pas rebord inférieur, dans lequel le calmar peut se retrouvent piégés dans une niche à faible teneur en oxygène. La taille est optimisée pour 40 ml d'inoculum. Disponible à l'adresse webstaurantstore.com, # 619PI9. |
| Flacons Drosophila | VWR | 89092-720 | Diamètre correspond à l'ouverture Vial sur le PMT luminomètre. |
| 1,5 ml Microtubes à centrifuger | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Les tubes doivent s'adapter à la forme des pilons. |
| L'éthanol, 200 Proof | Pêcheur | BP2818-100 | |
| Pilons | Kimble Chase / Kontes | 749521-1500 | |
| Perles de placage, 5 mm de diamètre | Kimble Chase | 13500 5 | Préparer 5 par tube et placer en autoclave. |
Références
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacte....
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