Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Resumo

Um método para gerar células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) através de expressão retrovírus mediada ectópica de Oct4, SOX2, KLF4 e MYC é descrito. Uma maneira prática de identificar humanos colônias de IPSC com base na expressão de GFP também é discutida.

Resumo

Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) são pluripotentes e uma fonte de valor inestimável para celulares in vitro de modelagem de doenças e medicina regenerativa ^1. Já foi demonstrado que as células somáticas humanas pode ser reprogramado para pluripotência pela expressão ectópica dos quatro fatores de transcrição (Oct4, Sox2, KLF4 e Myc) e tornar-se células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ^2-4. Como hESCs, iPSCs humanas são pluripotentes e uma fonte potencial de células autólogas. Aqui nós descrevemos o protocolo de reprogramar células de fibroblastos humanos, com os quatro fatores de reprogramação clonados em GFP contendo backbone retroviral ^4. Usando o protocolo seguinte, geramos iPSCs humanos em 3-4 semanas sob condições de cultura humana ESC. Colónias humanos IPSC se assemelham hESCs na morfologia e exibir a perda de fluorescência da GFP como um resultado de silenciamento do transgene retroviral. IPSC colônias isoladas mecanicamente sob microscopia de fluorescênciaep comportar-se de uma maneira semelhante à hESCs. Nestas células, nós detectar a expressão de vários genes pluripotência e marcadores de superfície.

Protocolo

1. Reprogramação por retrovírus Expressando Fatores Reprogramação

1. Fibroblastos humanos são cultivados em meio de fibroblastos (10% de FBS em meio DMEM com Pen / Strep).
2. Um dia antes da infecção, placa de 1x10 ⁵ fibroblastos humanos em um poço de uma placa de 6 poços.
3. Aspirar meio para remover células mortas e adicionar 2 ml de meio de fibroblastos fresco. Adicionar sulfato de protamina, na concentração final de 5 ug / ml.
4. Adicionar cuidadosamente a quantidade apropriada de cada vírus GFP-expressando o que corresponde a uma multiplicidade de infecção (MOI) ⁵ 5.
5. Um dia após a infecção, remover o s....

Discussão

Expressão de quatro fatores de transcrição reprograma fibroblastos humanos para iPSCs. Muitas tentativas foram feitas para gerar iPSCs humanos utilizando abordagens não integradoras ou não-genética para gerar iPSCs clinicamente seguros. Até agora, esses métodos mostram eficiência extremamente baixa e exigem otimização para melhorar a reprodutibilidade ^11-14. Métodos de retro-ou lentiviral são prontamente utilizados para obter e aplicar iPSCs para o homem em modelos de doenças in vitro,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Substituto de Soro Knockout	Invitrogen	10828-028	20%
L-Glutamina (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Aminoácidos Não Essenciais (10 mM)	Invitrogen	11140050	0,1 mM
β-Mercapt–etanol (14,3 M) ou MTG	Invitrogen	M-6250	0,1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, da Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicilina/Estreptomicina	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicilina/Estreptomicina	EMD Millipore	15140-122	1%
Tabela 1. Meio de Cultura
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Flur 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Flur 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Colagenase tipo IV	Invitrogen	17104019	1 mg/ml
Gelatina, Suína	Sigma-Aldrich	G 1890	0,1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0,2%
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
Células alimentadoras MEF	EMD Millipore	PMEF-N
Elevador de Células	Corning	3008
Microscopia de fluorescência: microscópio invertido com filtro GFP
Tabela 2. Reagentes e equipamentos