Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Summary

Um método para gerar células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) através de expressão retrovírus mediada ectópica de Oct4, SOX2, KLF4 e MYC é descrito. Uma maneira prática de identificar humanos colônias de IPSC com base na expressão de GFP também é discutida.

Abstract

Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) são pluripotentes e uma fonte de valor inestimável para celulares in vitro de modelagem de doenças e medicina regenerativa ^1. Já foi demonstrado que as células somáticas humanas pode ser reprogramado para pluripotência pela expressão ectópica dos quatro fatores de transcrição (Oct4, Sox2, KLF4 e Myc) e tornar-se células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ^2-4. Como hESCs, iPSCs humanas são pluripotentes e uma fonte potencial de células autólogas. Aqui nós descrevemos o protocolo de reprogramar células de fibroblastos humanos, com os quatro fatores de reprogramação clonados em GFP contendo backbone retroviral ^4. Usando o protocolo seguinte, geramos iPSCs humanos em 3-4 semanas sob condições de cultura humana ESC. Colónias humanos IPSC se assemelham hESCs na morfologia e exibir a perda de fluorescência da GFP como um resultado de silenciamento do transgene retroviral. IPSC colônias isoladas mecanicamente sob microscopia de fluorescênciaep comportar-se de uma maneira semelhante à hESCs. Nestas células, nós detectar a expressão de vários genes pluripotência e marcadores de superfície.

Protocol

1. Reprogramação por retrovírus Expressando Fatores Reprogramação

1. Fibroblastos humanos são cultivados em meio de fibroblastos (10% de FBS em meio DMEM com Pen / Strep).
2. Um dia antes da infecção, placa de 1x10 ⁵ fibroblastos humanos em um poço de uma placa de 6 poços.
3. Aspirar meio para remover células mortas e adicionar 2 ml de meio de fibroblastos fresco. Adicionar sulfato de protamina, na concentração final de 5 ug / ml.
4. Adicionar cuidadosamente a quantidade apropriada de cada vírus GFP-expressando o que corresponde a uma multiplicidade de infecção (MOI) ⁵ 5.
5. Um dia após a infecção, remover o sobrenadante viral, lavar três vezes com 2 ml de PBS, em seguida, adicionar 2 ml médio de fibroblastos.
6. Três dias após a infecção, verifique a fluorescência da GFP e repor o bem com 2 ml meio de fibroblastos.
7. Quatro dias após a infecção, placa de 1x10 cm ^4/2, de fibroblasto do rato irradiado embrionário (MEFs) células de alimentação, em meio de fibroblastos para um10-cm placa de Petri revestidas com 0,1% de gelatina. Incubar a 37 ° C durante a noite.
8. Cinco dias após a infecção, separar fibroblastos humanos infectados com 1 ml de 0,05% typsin / EDTA durante 5 minutos a 37 ° C, e centrifuga-se durante 5 minutos a 200 g. Aspirar o meio e ressuspender as células com 10 ml de meio de fibroblastos. Transferir as células em uma placa pré-revestida 10-cm.
9. Após 24 horas, substituir o meio com meio de cultura hESC (20% de substituição knock-out soro, DMEM/F12, 0,1 ml Non-aminoácidos essenciais, 4 ng / ml de bFGF, Pen / Strep / glutamato, beta merceptoethanol-). Alterar a média diária. ESC-colônias, como vão começar a aparecer durante o dia 20-27 após a infecção.

2. Isolamento e Expansão das iPSCs

1. Sob um microscópio de fluorescência, para verificar a ausência de GFP fluorescência em uma colónia que mostra uma morfologia semelhante à hESCs.
2. Usando uma pipeta de 10 ul, escolha colônias individuais da IPSC e colocá-los em um poço de uma gelatina e MEF-coated placa 12 poços e suplementado com meio de hESC. Alterar média diária.
3. Para passaging, lavar a placa com 1 ml de DMEM/F12, em seguida, adicionar 0,5 ml de colagenase, e incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
4. Lave as células duas vezes com DMEM/F12.
5. Adicionar 2 ml de meio fresco hESC. Usando um levantador célula, romper as colónias em pedaços pequenos e separar células restantes a partir da placa.
6. Transfira os pedaços de colónias ressuspensos em um poço de uma gelatina, e MEF-revestido placa de 6 poços.

3. Análise de marcadores de imunofluorescência pluripotentes

1. Lave as células três vezes com PBS e fixar com paraformaldeído a 4% durante 20 min à temperatura ambiente.
2. Suavemente lavar as células três vezes com PBS e permeabilizar com 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 30 min.
3. Bloquear a ligação não específica através da incubação de células com BSA a 3% em PBS durante duas horas.
4. Incubar as células com anticorpo primário durante a noite a 4 ° C.
<li> Lave as células três vezes com PBS e incubar as células com anticorpo secundário específico para uma hora à temperatura ambiente, protegendo da luz.
5. Lave as células três vezes com PBS e DAPI extra durante a última lavagem, seguido por incubação à temperatura ambiente durante 5 minutos.
6. Detectar a coloração com um microscópio de fluorescência.

4. Quantitativo em tempo real PCR para os marcadores pluripotentes

1. Isolar o RNA total a partir dos derivados de humanos iPSCs fibroblastos humanos usando o kit Qiagen RNeasy do.
2. Sintetizar o cDNA fita-primeiro usando SuperScript Transcriptase Reversa II.
3. Execute qPCR para detectar genes de pluripotência usando primers previamente relatados. ⁶

5. Os resultados representativos

1. Mudança morfológica durante a reprogramação
   Nós fibroblastos humanos infectados BJ1 e Detroit 551 com um coquetel de retrovírus que transportam Oct4, Sox2, KLF4 e MYC,e foram capazes de detectar alterações morfológicas durante reprogramação (Figura 1). Vinte e um dias após a infecção, reconhecemos pequenas colónias IPSC pela sua morfologia hESC-like. Além disso, reconhecemos iPSCs pela fluorescência da GFP. As células estaminais pluripotentes, tais como CES e iPSCs, expressam a maquinaria molecular para reprimir a expressão do gene proviral ^7-9. O nosso vector retroviral única expressa GFP em conjunto com genes de reprogramação por LTR retroviral. Assim, as células que expressam GFP continuamente são considerados expressar transgenes sem silenciamento do gene proviral. Fielmente reprogramadas colónias IPSC que adquirem a rede pluripotência molecular mostram a ausência de expressão da GFP (Figura 2) ^10.
   
2. Caracterização da pluripotência das iPSCs humanos
   Analisou-se as colónias derivadas de Detroit-551 fibroblastos através imuno-histoquímica com Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4 e anticorpos NANOG ( (Figura 3A). Foram também analisadas a expressão do gene através de análise quantitativa de RT-PCR. Observou-se que a expressão de Oct4, SOX2, KLF4, myc e NANOG foi significativamente aumentada em comparação com as células de fibroblasto parental mas em proporção com a de H9 hESCs (Figura 3B).

Figura 1. As alterações morfológicas de retrovírus infectados fibroblastos humanos. (AD) mudança morfológica Progressive em colônias de Detroit-551 fibroblastos infectados com fatores de reprogramação. Dia 5 (A), Dia 10 (B), Dia 14 (C), dia 21 (D). As células mostram a morfologia hESC-like após 21 dias.

Figura 2. Representante expressão da GFP fluorescente em células submetidas a reprogramação. 4, e incubadas em meio hESC durante quatro semanas. Fibroblastos BJ (A, B) e Detroit 551 (C, D) mostram semelhante morfológica. A partir do dia 21 de colônias GFP negativos começam a se formar, que representam as iPSCs de boa-fé ^10. (E, F) mostram transformada Detroit 551 células que não tenham sido submetidos a reprogramação adequada. (A, C, E) colónias sob visão de contraste de fase. (B, D) adequadamente reprogramado células que mostram o silenciamento GFP. (F) expressão GFP brilhante de colônia transformada.

Figura 3. Caracterização das células estaminais pluripotentes induzidas. (A) colónias Humanos 551-IPS-K1 de células expressam marcadores comuns para as células pluripotentes. Coloração DAPI indica o teor total de células por campo. (B) quantitativa em tempo real-PCR (RT-qPCR) para a expressão de Oct4, SOX2, KLF4, myc em f parentalibroblast e 551-iPS-K1 iPSCs e H9 células estaminais embrionárias humanas (hESCs). Os dados foram normalizados contra β-actina gene de limpeza e traçada em relação ao nível de expressão nas células de fibroblasto parental ^4.

Discussion

Expressão de quatro fatores de transcrição reprograma fibroblastos humanos para iPSCs. Muitas tentativas foram feitas para gerar iPSCs humanos utilizando abordagens não integradoras ou não-genética para gerar iPSCs clinicamente seguros. Até agora, esses métodos mostram eficiência extremamente baixa e exigem otimização para melhorar a reprodutibilidade ^11-14. Métodos de retro-ou lentiviral são prontamente utilizados para obter e aplicar iPSCs para o homem em modelos de doenças in vitro, que são menos dependentes das questões de segurança causadas pela integração viral. Reprogramação método descrito aqui está disponível para a derivação eficiente de iPSCs humanos. Seleção de iPSCs humanos é baseada principalmente na morfologia da colônia que se assemelha a CES humanos. Mais importante, o nosso método tira vantagem da característica de silenciar dos retrovirais repetições terminais longas (LTR) em células estaminais pluripotentes ^7,15. O vector retroviral utilizado neste protocolo contém o gene GFP ligada à reprogramaçãofactores por meio de uma sequência de entrada interno Ribossoma (IRES) e ^5. Expressão da GFP é accionado por LTR pró-viral. Os fibroblastos infectados com estes vírus inicialmente mostram a expressão da GFP brilhante. Uma vez totalmente reprogramado, iPSCs perderá expressão da GFP, que é facilmente visualizada sob um microscópio de fluorescência. Neste protocolo, descrevemos a geração de iPSCs de fibroblastos fetal e neonatal (Detroit 551 e BJ1). No entanto, este vector retroviral tem sido utilizado para gerar iPSCs a partir de fibroblastos adultos normais, bem como uma variedade de pacientes com distúrbios Mendelian e complexo ^4,16,17.

Anteriormente analisamos a mudança de marcadores de superfície celular durante a reprogramação de células somáticas humanas ^10. Há uma alteração progressiva na marcadores da superfície celular. Fibroblastos expressa CD13, que é reprimido pela expressão de reprogramação. Células em início de reprogramação para expressar SSEA4 juntamente com a GFP. Então, eles perdem a expressividadeem via de GFP silecing proviral e criador adicional expressa pluripotência TRA1-60 ^10. A expressão de TRA1-60 está bem correlacionada com a GFP silenciamento ea formação teratoma bem desenvolvida, sugerindo que TRA1-60 é um marcador para iPSCs fielmente reprogramadas. GFP silenciamento é o marcador alternativa para TRA1-60 de expressão e permite a identificação de colónias de IPSC sem coloração da célula laborioso vivo. Usando a perda de expressão da GFP como um marcador para iPSCs, resultam cientistas de células que não têm experiência prévia na reprogramação prontamente e de forma consistente isolar iPSCs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Knockout Serum Replacer	Invitrogen	10828-028	20%
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Nonessential Amino Acids (10 mM)	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, by Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
Table 1. Culture Medium
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Flur 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Flur 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Collagenase type IV	Invitrogen	17104019	1mg/ml
Gelatin, Porcine	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
MEF feeder cells	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter
Table 2. Reagents and equipment