Summary
Belli koşullarda kültüre zaman Mycobacterium tuberculosis ilaç hoşgörülü biyofilm oluşturmaktadır. Burada kültür M. yöntemleri tarif tuberculosis biyofilmler ve ilaç tolerans persisters sıklığını belirlenmesi. Bu protokoller M. ilaç hoşgörü mekanizmalarına daha sonraki çalışmalar için faydalı olacaktır tüberküloz.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis, insan tüberküloz etyolojik ajan, antibiyotikler de dahil olmak üzere çevresel streslere karşı hayatta kalabilmek için olağanüstü bir yeteneği vardır. Rağmen M. stres toleransı tüberkülozu, tüm tüberküloz 1 6 aylık uzun kemoterapi olasılıkla katkıda biridir, patojen bu özelliği fenotip altında yatan moleküler mekanizmaları tam olarak bilinmemektedir. Birçok mikrobiyal türlerin biyofilm 2-4 olarak adlandırılan son derece organize, bağlı yüzey ve matris kapsüllü yapılarda kendine montaj tarafından stresli ortamlarda hayatta kalmak için evrildi. Topluluklarda Büyüme mikropların tercih edilen bir hayatta kalma stratejisi gibi görünüyor, ve yüzey eki, hücrelerarası iletişimi ve hücre dışı polimerik maddelerin sentezi (EPS) 5,6 düzenleyen genetik bileşenleri yoluyla elde edilir. Çevresel strese toleransı olasılıkla physiolo belki de EPS kolaylaştırdı ve birbiyofilmlerin 7 karmaşık mimarisi içindeki heterojen mikroçevrelerde bireysel basilinin cerrahi adaptasyonu.
Son kağıtları bir dizi biz kurduğu M. tüberküloz ve Mycobacterium smegmatis'in fazla 50 kez anti-tüberküloz ilaçlar izoniazid ve rifampisin 8-10 minimal inhibitör konsantrasyonları tolere edebilir biyofilm olarak adlandırılan organize çok hücreli yapılar büyümeye güçlü bir eğilimi, var. M. ortamı gibi bir atmosfer havası ile 9 arasında, sınırlı değişimi: tüberküloz, bununla birlikte, ilgi çekici tepe boşluğu özellikle 9:01 oranında olgun biyofilmlerde, oluşturmak için spesifik koşulları gerektirmektedir. Özel çevre koşullarının Gereksinimleri muhtemelen o M. gerçeği ile bağlantılı olabilir tüberküloz, zorunlu insan patojeni ve böylece doku ortamlara adapte olmuştur. Bu yayının biz kültür M. yöntemleri göstermek tüberkülozbir şişe ve bakteriyolojik yanı sıra genetik çalışmalar için uygun bir 12 de plaka biçiminde biyofilmler. Biz, M. olarak zayıflatılmış bir suş için protokol tanımlamışlardır patojen 9 in vivo büyüme için kritik olan iki lokus, panCD ve RD1, silinmek ile tüberküloz, mc 2 7000,. Bu şekil değiştirme güvenle ve böylece pahalı bir BSL-3 tesisinin ihtiyacı kaçınarak tuberculosis patojenin temel biyolojisi anlamak için bir BSL-2 çevreleme kullanılabilir. Yöntem diğer kültürleştirilebilir mikobakteriyel türlerin biyofilm büyümeye, medya uygun modifikasyon ile uzatılabilir.
Genel olarak, kültür mikobakteriyel biyofilm yeknesak bir protokol mikobakteri temel esnek özellikleri eğitim ile ilgilenen araştırmacılara yardımcı olacaktır. Ayrıca, büyüyen mikobakteriyel biyofilmlerin açık ve özlü bir yöntem de, klinik ve ilaç inv yardımcı olacaktırestigators potansiyel bir ilacın etkinliğinin test etmek için.
Protocol
1. M. yetiştirilmesi biyofilm Bir 250ml vida kapaklı şişe içinde tüberküloz
- Ortam hazırlanması: su içinde 900 ml gliserol 60mL, ferrik amonyum sitrat ve 0.05g MgSO 4 KH 2 PO 4, 0.5g, L-asparagin 4g, sitrik asit 2g, 0.5g eritilir. NaOH ile pH 7.0 'a ayarlanır. Otoklav, serin ve hemen önce deney başlamadan,% 0.1 w bir son konsantrasyon steril ZnSO 4 / ekleme v Mc 2 7000 pantothenat auxotroph olduğundan bu gerginlik de son konsantrasyon 10μg/mL az pantotenik asit gerektirir.
Not: Bu M. tüberküloz için kullanılan Sauton medya standart bir bileşimidir. Gerekirse Bununla birlikte, diğer özel ortam, aynı zamanda, diğer mikobakteriyel türler için de kullanılabilir.
- Mikroorganizma hazırlık: M. Grow 0.05% 0.7 ila 1.0 arası bir hafta boyunca Tween-80, veya OD 600 ile 7H9OADC tüberküloz. Culture doğrudan bir 1:100 azından aşı malzemesi olarak kullanılabilir.
- Bir 250ml vida kapaklı polistiren şişe (Corning) için Sauton medyasının 25mL dağıtın. Çok sıkı, orta kap şişe inokulum 250μl ekleyin ve 3 hafta boyunca nemli 37 ° C inkübatör içinde bozulmamış yerleştirin. Hiçbir kirlenme var olmasını sağlamak için her gün bir kez şişe gözlemleyin.
- Üçüncü haftanın sonunda, M. ve daha da büyüme izin vermek için şişe kap gevşetmek arayüzü de tüberküloz. Kap bu aşamada gevşek değilse o kapta yetersiz oksijen konsantrasyonu bakteri daha fazla büyümesini frenleyeceğini.
2. M. Büyüme 12-iyi plakaları tüberküloz biyofilm
- Kesitler A1 ve A2 açıklandığı gibi mc 2 7000, medya ve inokulum hazırlayın.
- Inokulum 600μl ile medya 60mL karıştırın. 4.5m DağıtmaPlakanın her oyuğuna karışımının L. Kapaklı Kapak plakası. Parafilm ile plakası birkaç kez kaydırmak. 5 hafta boyunca 37 ° C'de nemli inkübatörde rahatsız plaka inkübe edin.
3. M. ilaç tolerans persisters sıklığını belirlenmesi tüberküloz biyofilmler
- M. Grow B. Bu bölümde tarif edildiği gibi, bir 12-gözlü formata tüberküloz biyofilmler yaklaşık 5-hafta toplam alacaktır.
- Biyofilmler olgunlaştı edildikten sonra (kuluçka 5 hafta sonra), pipetle bir mikrotip kullanarak biyofilm altındaki medya içine istenen konsantrasyonda antibiyotik tercih enjekte.
Not: pellicles altındaki medya hacmi yaklaşık 3.0mL azaltır. Bu yüzden araştırmacılar buna göre ilaç miktarı hesaplamak gerekir.
- Girdap antibiyotik iyice ortamda yayılır yavaşça böylece plaka. Istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar için, antibiyotik enjektedört kuyu otik. Buna paralel olarak, antibiyotik diğer dört kuyu içinde eritildi içinde çözücünün aynı hacimde enjekte ve dokunulmamış plakasının son dört kuyu bırakın. Kapaklı Kapak plakası ve plaka etrafında parafilm taze katmanları koymak. Istenilen süre inkübatöre geri yerleştirin.
- İnkübasyon sonunda, plaka açmak ve kuyu her birinde% 0.1 nihai konsantrasyonu (hacim / hacim) ile Tween-80 ekleyebilir. Girdap deterjan üniform dağıtılması için hafifçe tüm plaka. 15 dakika oda sıcaklığında inkübe plakası. Ki tüm içerik üniform bir 15 mL konik tüpe aktarılır, böylece pipetle birkaç defa, her sıra içeriği karıştırılır.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4000rpm tüpün içeriği aşağı doğru dönmeye başlayacaktır. Taze yıkama tamponu (% 10 gliserol ve% 0.05 Tween-80 ile birlikte PBS) ile 5ml pelletini. Yıkama üç kez tekrarlayın. 5 ml'lik yıkama tamponu içinde pelletini. O için rocker üzerinde tutun4 azından vernight ° C.
Not: düşük sıcaklıkta başlangıçta M. smegmatis (dispersiyon sırasında büyümesini en aza indirmek üzere) için geliştirilen ve aynı zamanda M. Tuberculosis için kullanılabilir olmasına rağmen, yavaş büyüyen türler, büyük olasılıkla sonucu üzerinde bir etkisi olmaksızın, oda sıcaklığında sallandı edilebilir. BSL-3 tesisi çalışma durumunda, oda sıcaklığında sallanan gerekli olabilir.
- , Uygun boyuta geniş sonunda kesme şırıngaya oturtmadan ve parafilm ile sararak mikrotip (2-200μl) ile donatılmış steril bir şırınga hazırlayın. Ucuna takılmış şırınga yoluyla tüpün tüm içerik geçmesi ve yeni bir 15 mL tüpler birikir. Eğer oldukça homojen bir süspansiyon gözlemlemek kadar bu adımı 5 ila 6 kez tekrarlayın.
- Her iyi canlı koloni sayısını belirlemek için 7H11OADC plaka üzerine süspansiyon ve plaka dilüsyonları seri dilüe. 37 ° C inkübatör üç hafta süreyle inkübe edin. Frekanslar belirleyinÇözücü muamele plakalar üzerinde elde edilenler ile muamele antibiyotik olarak elde koloni sayısı oranı hesaplayarak biyofilm popülasyonda persisters arasında cy.
4. Temsilcisi Sonuçlar
M. bir şişe kültüre, büyüme tüberküloz ilk hafta sonuna Şişenin taban görülebilir. Hava-medya arayüzü de büyüme üçüncü haftasında (Şekil 1A) sonunda sürekli görünür olmasına rağmen ikinci haftanın sonunda, hava-medya arayüzü üzerinde bakteri yamalı büyüme görülebilir. Bu zamanda, kabın duvarına bakteri eki de gözlemlenmiştir. Bu noktadan itibaren kültür büyüme esas olarak hava arayüzü ortam üzerinde oluşur. Yüzey büyüme altında sıvı açıktır. Tipik olarak, yapının beşinci hafta (Şekil 1B) sonuna kadar olgunlaşır. İnkübasyon uzamış ise, yapılar kabın dibine çöker başlayacaktır. Şaşırtıcı,Üçüncü haftanın sonuna kadar kapak sıkma sürecinde önemli bir adım olduğunu ve bilinmeyen nedenlerle gevşek kapaklı şişe önemli arayüz 9 büyüme başlatılması geciktirir.
12-gözlü formata olarak, hava-ortam ara yüzeyde sağlam bir biyofilm beş haftalık (Şekil 2A) sonunda her bir kuyu görülür. Plakalar tamamen sarılmış değilse o diferansiyel biyofilm büyüme gözlenmektedir. En kötü durumda, önemli medya buharlaşma bakterilerin büyümesini (Şekil 2B) aksaklık olabilir. Böylece, her iki plakanın sarma buharlaşmasını önlemek için de biyofilm (önceki paragrafta bakınız) için bir ortam sağlamak için gereklidir.
Bu teknik ile belirlenen Biyofilmlererde canlı basil sayısı oldukça tekrarlanabilir olması. M. Tepki tüberküloz biyofilmlerin antibiyotiklerin doğa ile değişir. Örneğin, rifampisin gibi bakterisidal antibiyotik için, canlılık kaybı bipha takip sic eğilim 9. Nüfusun küçük bir yüzdesi ne olursa olsun antibiyotik veya maruz kalma süresi konsantrasyon antibiyotiklere tamamen inatçı kalan hangi kalıcı bir fazı izler ilk üç ile dört gün boyunca canlılık içinde hızlı bir düşüş. Şekil 3 rifampisin 50μg/mL için 7 günlük maruziyet (MIC göre 50 kat daha yüksek) sonra olgun Biyofilmlererde canlı basil sayısını gösterir.
M. Şekil 1A. Erken görünüm inkübasyon 3 hafta sonra bakterilerin hava-medya arayüzü tüberküloz basili.
Şekil 1B. M. biyofilm Vadesi inkübasyon beş hafta sonra hava-medya arayüzü tüberküloz.
820/3820fig2A.jpg "/>
M. Şekil 2A. 5 haftalık biyofilmler Tüberküloz 12-iyi biçimde büyüdü.
Şekil 2B. Parafilm olmadan 12-iyi plaka M. tuberculosis biyofilm büyümeye bir başarısız girişimi.
M. ilaç hoşgörülü persisters sıklığını gösteren 3. Bir temsilci arsa Şekil Tüberküloz 12-iyi biçimde büyüdü ve yedi gün boyunca Rifampisin ile 50μg/mL maruz Biyofilmler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonu nedeniyle tüberküloz (TB), küresel halk sağlığı için büyük bir tehdit olmaya devam etmektedir. Dünya nüfusunun yaklaşık üçte biri asemptomatik patojen ile enfekte olduğu tahmin edilmektedir, 9 milyon yeni vaka aktif verem ve enfeksiyonun yaklaşık 1,7 milyon kalıp her yıl 11 belirtileri ile her yıl klinikte göstermek. Hastalık büyük bir yük öncelikle bir aşı ve altı ile dokuz ay boyunca uygulanan bir ilaca rejimi içeren bir derece karmaşık kemoterapi eksikliği tarafından katkıda bulunulmuştur. Uzun süreli kemoterapi büyük ölçüde antibiyotik 12 uzun pozlama gerektirdiği patojen küçük bir subpopülasyonu fenotipik tolerans atfedilir. Bu persisters hedefleyen tüberküloz kısa ve etkili tedavi için kritik olsa da, bu persisters geliştirilmesinin altında yatan mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir.
En mikrobiyal specidoğal ortamlarında es kendiliğinden Kendi oluşturduğunuz büyümeye, yüzey ekli çok hücreli topluluklar antibiyotik 3 derece hoşgörülü biyofilm, denir. Son zamanlarda, birkaç mikobakteriyel türlerin, uyuşturucu hoşgörülü persisters 9,13-15 geliştirilmesini teşvik bir mikro sağlamak biyofilm, in vitro büyümeye güçlü eğilim olduğu gösterilmiştir. Hızlı gibi M. çevre türler büyürken smegmatis'in kolayca yavaş büyüyen patojen türlerin M., deterjan içermeyen ortamda biyofilm oluşturabilirler Tüberküloz çok hücreli yapılar 9 oluşturmak için spesifik koşullar gerektirir. Kültür M. beri biyofilmler tüberküloz ilaç hoşgörü ve sebat, yetiştiricilik için ayrıntılı bir protokol, bir açık kaynak aracılığıyla Biyofilmlererde patojen özellikle kaynak sınırlı ülkelerdeki, tüberküloz araştırma için değerli olacaktır yaygınlaştırılması mekanizmalarına önemli fikir verebiliry.
Burada M. büyüyen yöntemi tarif ayrıntılı Biyofilmlererde tüberküloz. Biz de biyofilm kırmak ve nüfus canlı basilinin sayısını belirlemek için bir protokol sağlar. Bu teknik, kültür ilaç tolerans persisters sayısının belirlenmesi için de kullanılabilir. Kültür Biyofilmlererde üç en önemli adımlar şunlardır: 1) uygun bir deterjan içermeyen ortam seçimi, ilk üç haftasında kültür kabını kapalı ve sonraki kuluçka açık konteyner. Dahası, nemlendirilmiş bir durumda kabın tutarak, aynı zamanda 5-hafta boyunca kuluçka ortam buharlaştırılmasından önlenmesi açısından çok önemlidir. Bu önemli sonuçların tekrarlanabilirliği engel olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
İş Sağlığı ve Amerikan Akciğer Derneği Ulusal Enstitüsü'nün mali desteği ile gerçekleştirilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | VWR international | Model # 1923/25 | |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
| 12-well tissue culture plate | VWR international | 62406-165 | |
| 50-mL conical tubes | VWR international | 89039-660 | |
| Rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
| Chromatographic refrigerator | VWR international | 55702-520 | |
| petri dish | VWR international | 25384-342 | |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| L-asparagine | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
| ferric ammonium citrate | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-5 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
| D-pantothenic acid | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 | |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 | |
| 12 well plates | Falcon BD | 353043 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| methanol | JT Baker | 9070-05 | |
| 10mlLsyringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 1-200μL pipet tips | VWR international | 89079-458 | |
| parafilm M | VWR international | PM-996 | |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 | |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | BD Biosciences | 283810 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
References
- Saltini, C. Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Henke, J. M., Bassler, B. L. Bacterial social engagements. Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).
- Kolter, R., Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Ojha, A. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
- Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).
- Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).
- Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
- Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
- Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).
- Alibaud, L. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).
