Summary
小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的质量取决于鼠标CF-1如正确的应变。全能性支持MEFs和条件培养基（厘米），从这些应该包含激活素A，小鬼和TGFβ1的最佳浓度为激活素/ Nodal和FGF通路所需的合作保持自我更新和全能性。
Abstract
在一般情况下，人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）和人类诱导多能干细胞（hiPSCs 1）可变量的条件下培养。然而，它是不容易的建立一个有效的制度，为培养这些细胞。由于文化条件可以影响基因表达，在胚胎干细胞和hiPSCs赋予全能性，培养方法的优化和标准化是至关重要的。
人类胚胎干细胞系的建立首次使用MEFs细胞作为饲养层细胞和胎牛血清（FBS），含培养基2。接下来，胎牛血清被替换Knockout血清替代品（KSR）和FGF2的，从而提高3胚胎干细胞的增殖。最后，馈线自由文化系统培养细胞使基底膜涂层板KSR-含条件培养基（MEFs细胞条件培养基）4。随后，胚胎干细胞培养条件化学defin馈线自由文化走向编辑条件5-7。此外，异种组件由病原体和动物蛋白培养方法，以避免潜在的污染已建立了8个 。
获得改善条件与人类细胞系（如胎儿肌肉和皮肤细胞9日，10成人皮肤细胞，包皮成纤维11-12，13羊膜间质细胞），小鼠饲养层细胞已被替换。然而，使用人包皮成纤维细胞源性饲养层保持未分化的胚胎干细胞的效率是不是只要从小鼠饲养细胞分泌激活素A 14的较低水平，由于高。显然，是在老鼠和人类饲养层细胞生长因子生产的明显差异。
老鼠和人类饲养层细胞的转录组的分析结果显示支持和不支持细胞之间的显着性差异。外源性FGF2的关键是maintai宁胚胎干细胞和hiPSCs自我更新，并已被确定为一个关键调节因子TGFβ1，激活素A和小鬼（骨形态发生蛋白受体拮抗剂）在饲养层细胞的表达。激活素A诱导的OCT4，SOX2和NANOG的在15-16人胚胎干细胞的表达已被证明。
长期培养，胚胎干细胞和hiPSCs可以生长分裂灭活MEFs细胞或基底膜涂层板在MEF-CM（MEF的条件培养基）馈线的条件下，以维持其未分化状态。两种培养条件下的成功完全取决于饲养层细胞的质量，因为它们直接影响了人类胚胎干细胞的生长。
在这里，我们提出了一个优化的分离和培养小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的方法，制备条件培养基（CM）和酶联免疫吸附试验（ELISA）评估各级激活素在媒体。
Protocol
1。分离的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）
非无菌条件下进行以下两个步骤。
- 颈椎脱位，牺牲在13或14 DPC（一天后coitum）怀孕鼠标（CF1的，哈伦，美国）。
- 剖析了子宫角，简单地在70％（V / V）乙醇和地方成猎鹰管无钙+镁 PBS冲洗+（GIBCO，Invitrogen公司）。
下面的步骤进行了组织文化罩在无菌条件下使用无菌文书。
- 培养皿放入子宫角分开，从每个胚胎的胎盘和胚胎囊。
- 解剖头部和红色机关，在PBS清洗，并放置在一个干净的培养皿的胚胎。细剁碎的组织，用消毒的刀片，直到它变成可能吸取。
- 加入1毫升的0.05％胰蛋白酶/ EDTA（GIBCO，Invitrogen公司），包裹体丁100 Kunitz型DNA酶I（USB）的单位，每胚胎。
- 转入50毫升猎鹰管组织和孵育15分钟，在37°C。孵化后每5分钟，移液器上下彻底分离的细胞。
- 加入新鲜制备的MEF的介质的体积约1灭活胰蛋白酶。
MEF培养基（组件使媒体的500毫升，混合所有的元件和过滤器）：
450毫升培养液，胎牛血清（50毫升10％（V / V）），200毫米L-谷氨酰胺（1/100（V / V））5毫升，5毫升的青霉素，链霉素（1/100（V / V））。 - 离心细胞与低速（300 XG），5分钟，小心地取出上清，重悬细胞沉淀在温暖的MEF的介质。
- 板约一个细胞的数量，这相当于在每个T150大掌柜（TPP）的烧瓶3-4涂有0.2％明胶（明胶从牛皮肤，B型，西格玛），2小时的胚胎。成纤维细胞（P0，通道0），是唯一有能力重视明胶涂层烧瓶细胞。 理想的情况下，细胞是80-90％汇合后24小时，在这个阶段的P0细胞的重要组成部分，是为将来使用冻结。
- 展开余下的T150大掌柜的P0到P3或P4细胞（瓶），然后灭活和使用馈线replate胚胎干细胞或生产条件培养基（CM）。
2。灭活和电镀MEFs细胞（饲养层细胞的制备）
所有步骤都是在无菌条件下进行组织培养引擎盖。
- 涂T150瓶明胶0.2％，在室温下孵育至少2小时。
- 在PBS稀释丝裂霉素C（1毫克/毫升）和过滤器。
- 吸MEFs中的媒体，用PBS洗的Ca 2 + Mg 2 +的 。
- 将20毫升含10微克/毫升丝裂霉素ÇMEFs中的介质。
- 在37℃孵育2小时Ç与丝裂霉素C含中，然后用PBS，trypsinize，离心（300 XG 5分钟），并在温暖的培养基重悬细胞两次。
- 计数细胞和板密度56.000细胞/在T150瓶厘米2厘米以下6天的生产和使用。
3。条件培养液（CM）的制备
所有步骤都是在无菌条件下进行组织培养引擎盖。
- 在56.000细胞/厘米2的密度灭活MEFs中电镀取代胚胎干细胞培养基（澳，无条件中等）（0.5毫升/厘米2）的MEF介质后的第二天，补充新鲜的FGF2的4纳克/毫升。
- 收集培养24 h后，从饲养瓶CM和补充新鲜胚胎干细胞中4纳克/毫升FGF2的进料器。
- 在接下来的6天里重复此过程。每天商店收集于-20°C CM
- 经过6天的混合介质和过滤器（康宁，0.22微米，PAS）的所有等分。 50毫升分装并储存于-80°C。
- <补充基底膜上种植的胚胎干细胞，然后加入额外的4纳克/毫升，FGF2的CM。/ LI>
4。测量条件培养基一个激活素（ELISA）15
- 将所有样品和试剂室温。
- 稀释捕获抗体（人力资源\鼠标\大鼠激活素A单克隆抗体，R＆D系统）1％BSA的PBS中，加入微孔板（100μL/孔）孵育在室温下过夜。
- 24小时后用PBST（PBS 0.05％吐温20）（300μL/孔）洗井三次，然后在室温下1小时块（1％的BSA / PBS，300μL/孔）。
- 在这段时间内，准备激活素A（R＆D系统）的标准曲线，其中包括7稀释（浓度低于30毫微克/毫升）和空白样品。线性工作范围的激活素A是介于0.25和32毫微克/毫升。
- 井（100μL/孔）的标准和样品的重复和孵化在室温下为2小时。
- 洗井的3倍（300μLPBST）。
- 新增二级（生物素）抗体（人/鼠/鼠生物素化单克隆抗体，激活素A R＆D系统）（0。25微克/毫升在1％的BSA / PBS）和孵化在室温下为2小时。
- 洗井的3倍（300μLPBST），加链霉亲和素-HRP（稀释1％BSA / PBS，研发系统）和孵化在室温为20分钟。
- 洗井的3倍（300μLPBST），加入100微升底物溶液（Quantikine，R＆D系统），在室温30分钟，在黑暗中孵育。
- 每孔加入100微升一站式解决方案（Quantikine，R＆D系统），轻轻混匀。
- 集酶标仪（分子器件的光谱最大250，全球医疗器械公司，明尼苏达州）至450纳米，在540或570 nm波长校正，确定每个光密度。
5。代表结果
在图1的隔离程序的总体方案。人类胚胎干细胞和培养hiPSCs不同条件下的典型形态呈现在图2。形态 图3给出MEFs和灭活馈线细胞用来准备厘米。在一般情况下，细胞应该合流隔离后24小时，并随时可以冻结或扩大。但是，有时可能需要2-3天才能获得融合文化。细胞在第4代，而不是后来的CM应准备。这是至关重要的，因为主细胞只能被扩大为4-5代衰老来临前。
细胞因子，激活素A，被认为是作为饲养层细胞分泌的支持14多能干细胞分化生长的最关键因素。厘米的激活素水平测量（ 图4）是一个非常方便的定量分析，以监测MEFs中的质量。
图1。MEFs细胞分离过程示意图。
图2。典型的未分化的胚胎干细胞培养（一）饲养层细胞（B）条件培养基（三）定义介质的存在形态。 hiPSCs中存在（D和E）饲养层细胞培养的典型形态。
图3典型形态的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）（A）通过电镀/隔离两天后，（B）在灭活密度56.000细胞/厘米，饲养层。2 0（P0）
酶联免疫吸附试验（ELISA）为基础的条件培养基（CM）公关一个激活素浓度的测量图4。epared与来自CF1的小鼠品系的小鼠胚胎成纤维细胞。公分为6天，然后汇总。厘米“1”和CM“2”是指不同的媒体和对无条件媒体的澳批次。由于功能的调节过程MEFs细胞，激活一个分泌到培养基激活素A是在澳大几乎无法察觉。
Discussion
这里的MEFs细胞分离过程，使建立一个标准化的培养条件下对人类胚胎干细胞和hiPSCs。此外，基于ELISA的系统，用于评估饲养层细胞的细胞因子生产的MEF派生的空调媒体质量的一个有用的指标。提供配套成纤维细胞的小鼠品系（CF1的）的日常维护是必要的，以避免批次到批次的培养基的变化。此外，建议隔离从几个小鼠胚胎细胞的同时获得一致的质量。当然新鲜分离MEFs细胞可以保持冻结在P0和P1。也灭活MEFs中可以保持在适当数额取决于细胞培养的要求等分冻结。一般应约250.000细胞接种在6孔板培养胚胎干细胞和iPS细胞的单井。建立和优化的方法可以经常使用，以尽量减少复合驱之间的变异租实验。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
特别感谢博士鲍里斯Greber的设立激活素A酶联免疫吸附试验协议在Greber 等2007年发表的。我们特别感谢莫妮卡Shevack夫人准备的图形概览。我们非常感谢所有帮助和拍摄之前和期间的宝贵建议Heiko福克斯博士。我们要感谢所有成员保持稳定供应MEFs和CM的的Adjaye实验室，尤其是伊丽莎白·索查。我们也承认我们的同事，在他们的永久支持MPIMG动物设施。这项工作是由马克斯 - 普朗克协会和[BMBF的部分资金;授权号0315717A]，伙伴的ERASysBio + ERA-NET的加在第七框架计划下，欧盟支持的倡议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | Biochrom | S0115 | |
| L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
| beta-Mercapt–thanol | Sigma | M7522 | |
| PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
| Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
| Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
| Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Amit, M. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Ludwig, T. E. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Yao, S. Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).
- Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. Defined culture conditions of human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).
- Skottman, H., Hovatta, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132, 691-698 (2006).
- Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
- Richards, M. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells. 21, 546-556 (2003).
- Amit, M. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).
- Inzunza, J. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Zhang, K. Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State. Cell Reprogram. , (2011).
- Eiselleova, L. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal. Stem Cells. 25, 455-464 (2007).
- Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).
