Summary
후각 수용체 뉴런 (ORNs)는 수용체에 첫 소절에 후각 망울에서 두 번째 주문 뉴런에 전달 아르 액션 잠재력을 실행하는 현재의 냄새 신호를 변환합니다. 여기 동시에 odorant 유발 수용체 마우스 ORNs의 현재와 실천 가능성을 기록 할 수있는 흡입 피펫 기술을 설명합니다.
Abstract
동물은 비강에있는 chemosensory 시스템을 통해 주위의 향기가있는 환경을 드셔보세요. Chemosensory 신호는 식품 선택, 육식 동물, conspecific 및 동료 인식과 다른 사회적 관련 신호로 복잡한 동작에 영향을 미칩니다. 후각 수용체 뉴런은 (ORNs) 후각 상피에 포함 된 비강의 등 부분에 위치하고 있습니다. 이러한 양극성 뉴런은 (그림을 참조하십시오. 1, 원래 일반 생리학의 저널에 출판 Reisert & 조 1) 후각 망울에 축삭을 보내 후각을 커버 점액에있는 솜털의 방출에서 상피 국경에 하나의 dendrite를 확장 상피. 채널 (그림 1) - 속눈썹은 궁극적으로 ciliary 전달 채널, 순환 염기 - 게이트 (CNG) 채널 및 칼슘 2 + - 활성화의 망할 CIA를 통해 현재의 유입을 흥분성의로 연결 신호 전달 기기가 포함되어 있습니다. 다음의 depolarization는 전지 본체 2-4에서 행동 가능성 생성을 트리거합니다.
이 비디오에서 우리는 ORNs에서 odorant 유발 반응을 기록 할 수있는 '흡입 피펫 기술 "의 사용을 설명합니다. 이 방법은 원래로드 photoreceptors 5에서 기록하기 위해 개발되었으며,이 방법의 변형은 마우스 콘 photoreceptors 6 일부터 기록하도록 수정 jove.com에서 찾을 수 있습니다. 흡입 피펫 기술은 나중에도 ORNs 7,8에서 기록하도록 구성되었습니다. 간단히, 후각 상피 및 세포 분리의 분리에 따라, ORN의 전체 전지 본체는 기록 피펫의 끝으로 빨려 있습니다. dendrite과 속눈썹은 목욕 솔루션에 노출 예를 들어 odorant 또는 약리 차단 응용 프로그램을 활성화하는 솔루션 변경에 따라서 액세스 할 수 남아 있습니다. 이 구성에서, 세포 내 환경에 더 접근 얻은 없습니다 (NO 전체 셀 전압 클램프)와 세포 내 전압이 다를 무료로 남아있다. 이 모든속눈썹과 전지 본체 9 발사 빠른 작업 잠재력에 유래 속도가 느린 수용체 전류의 동시 녹음을 ows. 이 두 신호 사이의 속도론의 차이는 그들에게 서로 다른 필터 설정을 사용하여 분리 할 수 있습니다. 이 기술은 모든 야생 유형 또는 녹아웃 마우스에서 사용할 수 있습니다 또는도 ORNs의 특정 하위 집합에 라벨을 GFP를 표현 ORNs에서 선택적으로 기록하기 위해, 예를 들어 주어진 odorant 수용체 또는 이온 채널을 표현.
Protocol
1. 녹음 설정
녹음 챔버는 공기 테이블에 장착되어 전기적으로 패러데이 케이지를 사용하여 차폐되어 위상 대비 광학있는 니콘 TE2000U 이클립스 (Eclipse) 역 현미경에 장착되어 있습니다. 플렉시 글라스 기록 챔버는 두 부분 부분적으로 장벽에 의해 분리되어 silanized 유리 슬라이드에 접착으로 구성되어 있습니다. 챔버의 한 부분이 다른이 odorant에 조기 정착의 노출하지만, 아직 사용하지 않은 셀을 최소화하기 위해 녹화 중에 자극 - 노출에 사용되는 동안 세포를 해결하는 데 사용됩니다. 녹음 설정은 pelleted 피펫 홀더 및 접지 전극에 장착 흡입 피펫 (아래 참조)으로 구성되어 있습니다. 흡입 피펫은 micromanipulator를 사용하여 위치하고 있습니다. 자극 솔루션은 각각의 사각형 튜브가 0.7 mm X 0.7 mm거든요, 트리플 통 유리 사각형 튜브를 사용하여 적용됩니다. 트리플 배럴 유리는 머니퓰레이터에 장착 동력 빠른 단계 재관류 시스템 (Sut에 연결되었습니다적이 SF-77B, 워너 계측기)과 ~ 45 °의 각도로 녹화 챔버를 입력했습니다. 트리플 통 유리의 끝은 트리플 통 유리의 마지막 얼굴 (개방)은 피펫의 가까이에 위치하도록 허용하고, 수직이라고 같은 다시 45 °의 각도로 beveled되었습니다.
표준 포유류의 벨소리 솔루션과 접지 전극으로 가득 흡입 피펫 전극은 전압 클램프 모드에서 패치 클램프 증폭기의 1 GΩ의 headstage (PC-501A, 워너 악기)에 연결되어 있습니다. 앰프 (낮은 패스 5 kHz에서에서 필터링)에서 아날로그 신호는 실시간으로 신호를 모니터링하기 위해 디지털 오실로스코프에 표시되며 신호가 통과 필터링 낮은 8 극 베셀 필터 (Krohn-Hite)에 연결되어 50 Hz에서. 두 신호 (5 kHz에서 50 Hz에서 필터링 저역 통과) 데이터 수집을 위해 PC에 연결되어 A / D 컨버터 (캠브리지 전자 디자인 마이크로 1401의 mkII)에 공급하고 있습니다. 데이터 신호 3 acq를 사용하여 기록됩니다10 kHz에서의 샘플링 주파수에서 uisition 소프트웨어 (캠브리지 전자 디자인). 신호는 먼저 겹쳐 작업 가능성과 함께 현재의 수용체 후 혼자 전류 수용체를 (그림을 참조하십시오. 2) 기록하는 두 개의 서로 다른 대역폭에 기록됩니다. 재관류 시스템은 신호음 (제어) 솔루션과 odorant 자극 또는 원하는 구성의 솔루션을 사이에 빠르게 전환하는 데 사용되며 PC 및 신호 3 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 솔루션은 60 ML의 주사기에 포함되어 있으며 유량은 의료 수준의 정맥 흐름 규제에 의해 제어됩니다. 일반적으로 유량은 1 ML / 분으로 설정되어 있습니다.
녹음 피펫의 흡입은 다음과 같은 방법으로 제어됩니다 : 피펫 홀더의 측면 포트가 차례로 높이 조절 오일 저장조에 연결되어 오일 라인에 연결되어 있습니다. 높이거나 저수지를 낮추면 보장 그 P의 끝을 통해 피펫 압력, 따라서 벨소리 흐름ipette을 최소화하고 약간 긍정적이다. 추가 흡입 또는 압력은 녹음 피펫의 끝으로 격리 ORN의 전지 본체를 빨아 다른 끝에서 마우스 피스와 저수지의 영공에 연결된 튜브를 통하여 적용 할 수 있습니다.
실험 ° C 밀접하게 세포의 기본 생리 조건을 시뮬레이션하기 위해 37 수행됩니다. 온도는 솔루션을 포함하는 스테인리스 스틸 튜브는 10을 통과하는 통과 세라믹 저항기로 구성되어 주문 제작 난방 장치를 통해 솔루션을 전달하여 제어됩니다. 온도는 열전대 온도계 (우연)를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다.
2. 솔루션
포유류의 벨소리의 솔루션 (MM) : 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2, 0.01 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 HEPES, 10 포도당. 산도는 NaOH와 7.5로 조정되었습니다. 10 % 희석 벨소리의 솔루션은 접합 전류를 측정하기 위해 사용되었다. OdoraNT 솔루션 : 아세토 페논 및 유제 놀은 20 MM DMSO 주식에서 벨소리의 솔루션에서 매일 준비했다.
3. 전극을 만들기
- 셔터 P-97 micropipette의 풀러의 모세관 unfilamented 붕규산 유리를 놓고 긴 테이퍼와 micropipette를 당겨.
- 접안 렌즈와 무대에 탑재 된 이동식 다이아몬드 나이프의 십자선이 마련되어 차례에 니콘 E200 이클립스 현미경에 장착 주문 제작 micropipette 홀더에 피펫을 전송합니다.
- 20x 목적 아래 피펫의 팁을 관찰하고 reticle을 가이드로 사용하여, 부드럽게 서기 피펫은 10 μm 폭 (외경)입니다 맞춤 제작 다이아몬드 칼을 사용하여 90 ° 각도로 피펫.
- 끝으로 더 다이아몬드 칼을 이동하고 점차 다이아몬드 칼 끝에 압력을 적용 할 수 있습니다. 피펫 팁은이 scribed 된 시점에서 완전히 깨해야합니다.
또는 3.1로 단계를3.4이 결합 될 수 있으며 이러한 큰 팁 직경 깔끔하게 잘라 가장자리를 안정적으로 피펫을 끌어 어려워 증명할 수 있지만 피펫은 직접 피펫 팁을 잘라 할 필요없이 원하는 크기로 끌어 할 수 있습니다.
- 40x 목적에서 전기 온수 필라멘트를 사용하여 5 μm의 내부 직경 피펫의 끝을 연마 발사. 일단 완료, micropipette 마우스 ORNs에서 녹화 전류에 사용 할 준비가되어 있습니다. 벨소리로 가득 할 때 열려있는 피펫 저항은 MΩ 한 주변해야합니다.
4. 강한 수용체 뉴런의 절연
- 기관 지침 및 규정에 따라 마우스를 희생. , 머리를 제거 벗겨 버릴 피부는 두개골을 놓인하고 medially 중간 선을 따라 머리를 두 갈래로 갈라지다.
- 해부 stereomicroscope 아래 두 반의 뜻 헤드를 배치, 코 중격을 뽑아 후각 turbinates를 제거합니다. 포도당 (C)와 배양 접시에있는 모든 조직을 놓으십시오포유류의 벨소리 솔루션을 ontaining.
- 이 turbinates에서 기본 연골에서 후각 상피 껍질을 250 μl 벨소리를 포함하는 Eppendorf 튜브에 조직을 전송합니다. 우리는 우리의 기록 챔버의 크기에 셀의 오른쪽 밀도를 얻을이 turbinates에서 조직을 사용합니다. ° C 나중에 사용하기 위해 4에 남아있는 조직을 저장합니다.
- 중간 속도로 1 초에 두 번 짧게 후각 상피를 포함하는 소용돌이 Eppendorf 튜브. 이 단계는 상피에서 ORNs의 기계 분해로 연결됩니다.
- 녹화 실에서 dissociated ORNs를 포함하는 벨소리 솔루션을 놓으십시오. 고급 집게를 사용하여 정지도 현재 조직의 큰 조각을 제거합니다.
- ORNs은 벨소리와 함께 지속적으로 superfusion를 시작하기 전에 20 분에 정착하고 녹음을 계속하자.
5. 녹음
- 녹음 챔버와 regul에 오일 라인에 연결된 흡입 전극을 낮 춥니 다피펫 팁에 약간의 긍정적 인 압력을 수립 할 수있는 오일 탱크의 높이를 먹었다. 이것은 피펫에서 (긍정적 인 압력) 또는 (부정적인 압력)에 대한 멀어 예를 들어 세포 파편을 관찰하여 수행 할 수 있습니다. 셀 쓰레기와 피펫의 팁을 오염하지보십시오.
- 20 40x의 배율을 사용하여 전형적인 바이폴라 형태에 의해 인식 될 수있는 절연 ORN에 대한 기록 챔버를 검사합니다. ORN 전지 본체의 근접에 기록 전극을 이동합니다. 부드럽게 전지 본체는 피펫의 팁을 체결 있도록 빠는 시작합니다. 조심스럽게 천천히 전체 전지 본체는 목욕 솔루션에 노출 dendrite과 섬모가 부족해 남겨두고 흡입 피펫의 끝으로 그려 될 때까지 흡입을 적용하고 있습니다. 형편 ORNs 및 피펫 모양의 이미지 7,11를 참조하십시오. 더 흡입이 적용되지 않습니다되면, ORN은 피펫의에서 이동하거나하지 않습니다 있는지 확인하십시오. 그렇다면, 그에 따라 석유 저수지의 높이를 조정합니다.
- 를 사용하여마이크로은 챔버의 기록 섹션에 정착 ORNs를 포함하는 섹션에서 흡입 피펫 이동합니다. 솔루션 교환을위한 3 질주 관 앞의 흡입 피펫을 조심스럽게 넣습니다. ORN은 따라서 혼합 난류를 피 층류에 노출되어 있으며 빠른 솔루션 교환을 달성하기 위해되도록 흡입 피펫은 충분히 3 질주 튜브의 개통에 배치해야합니다. 솔루션 교환은 흡입 피펫의 끝에서 흐르는 솔루션의 병렬 스트림 사이의 인터페이스를 스테핑에 의해 달성된다. 솔루션 교환의 시간 코스는 일반적으로 서로 다른 이온 성분의 솔루션 사이의 셀을 (그림을 참조하십시오. 2) 스테핑에 의해 evoked 접합 전류에서 측정 약 20 밀리 초입니다. 솔루션은 중력에 의해 전달됩니다.
6. 대표 결과
그림 1. 후각 망울에서 A) 바이폴라 수용체 뉴런. B) 속눈썹의 신호 전달 기계는 궁극적으로 현재의 유입을 흥분성의로 연결됩니다. 다음의 탈분극은 전지 본체의 행동 가능성 생성을 트리거합니다.
그림 2는 솔루션 교류의 속도와 안정성을 보여줍니다. 피펫는 100 밀리와 비슷 이온 농도에 의한 접합 전류가 기록 된 10 % 희석 벨소리로 정상에서 내려올되었습니다. 블랙 추적 번가입니다5 시험의 분노를, 빨강은 SD를 추적. 솔루션 교환시 SD에서 약간의 변화는 시험에서 시험 및 솔루션 스트림 하나를 초과하는 소음의 부족으로 솔루션 교류의 신뢰성을 보여줍니다.
그림 3은 흡입 피펫 기술을 사용하여 ORN에서 유제 놀 유발 응답을 보여줍니다. 녹화 위의 막대로 표시로 ORN은 1 초 동안 100 μM의 유제 놀에 노출되었다. 그림합니다. 만 현재 수용체를 표시하려면 50 Hz에서 그림은 - 3A는 (검은 색 추적) 수용체 전류는 대역폭이 0에서 필터링되었습니다.. 5000 Hz에서 (빨간색 추적)도 작업 잠재력을 (화살표로 표시 APS) 표시 - 3B 지금은 0의 폭 넓은 대역폭에서 필터링 같은 기록을 보여줍니다. 삽입은 응답의 발병에 더 명확하게 APS를 시각적으로 확장 timescale에서 동일한 추적을 보여줍니다.
유제 놀 - 응답 ORN의 그림 4. 선량 반응 가족 (A). 유제 놀은 0.3 μM에서 100 μM에 이르기까지 다양한 농도에서 사용 된, 자극 기간은 1 초이고 흔적은 0에서 필터링 - 50 Hz에서. odorant 농도의 진보적 인 증가는 odorant 노출이 종료 된 후에는 더 많은 느리게 종료 크고 빠른 응답을 낳았다.
ORNs는 중간 odorant 농도 (그림 4B)에서 긴 stimulations 동안 왕복 응답 패턴을 표시 할 수 있습니다. 다음은 acetephenone (3 μM) 응답 ORN은 8 초 동안 자극했다. 자극의 발병에 신속하고 과도 피크 응답 후 작은, 반복 응답의 일련의 관찰됩니다. 50 Hz에서 - 녹화 대역폭은 0이었다.
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Discussion
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Disclosures
저자는 공개 할 수 없어요.
Acknowledgments
이 작품은 NIH DC009613, 인간 프론티어 과학 프로그램과 몰리 케어 휄로 십 (JR까지)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table | equipment | Newport Corp. | ||
| Air Pump | equipment | Newport Corp. | ACGP | |
| Pipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverted microscope | equipment | Nikon Instruments | TE2000U | Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least |
| Amplifier PC-501A | equipment | Warner Instruments | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond knife | Equipment | Custom Made | ||
| Digitizer Mikro1401 A/D | equipment | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter unit 3382 | equipment | Krohn-Hite Co. | ||
| Signal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Molded Ag/AgCl Pellet | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 64-1297 | |
| Pipette holder | equipment | Warner Instruments | 64-0997 | Custom modified to fit headstage |
| Recording chamber | Equipment | Custom Made | ||
| Micromanipulator MP85-1028 | equipment | Sutter Instrument Co. | Micromanipulator MP85-1028 | |
| Mineral oil | Solution | Sigma-Aldrich | 330779-1L | |
| Oscilloscope TDS 1001 | equipment | Tektronix, Inc. | ||
| Three-barreled square glass tube | Equipment | Warner Instruments | 64-0119 | 0.6 mm ID , 5 cm long |
| Valve | equipment | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | equipment | AutoMate Scientific, Inc. | ||
| SF-77B Perfusion fast step | equipment | Warner Instruments |
References
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