Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

İyonların ayrılması ve Nükleik Asit Saflaştırılması için on-chip Isotachophoresis

Published: March 2, 2012 doi: 10.3791/3890
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Mechanical Engineering, Stanford University

Summary

Isotachophoresis (ITP) toksini tanıma ve numune hazırlama kadar uygulamaları ile sağlam bir elektrokinetik ayırma ve zenginleştirme tekniktir. Ayırma ve küçük moleküller ve hücre kültürü lizatı nükleik asitlerin saflaştırılması tespiti: Biz ITP fiziksel prensipleri ve iki özel örnek uygulamalar için bu tekniği uygulayarak metodolojisi gözden geçirin.

Abstract

Elektrokinetik teknikleri, çünkü hiçbir hareketli parça ile basit, kompakt sistemlerde akışkan ve elektroforetik süreçlerinin çeşitli gerçekleştirmek için kendi benzersiz yeteneği mikro uygulamaların bir elyaf bulunmaktadır. Isotachophoresis (ITP) iyonik mobilite göre milyon kat önderiştirme 1,2 ve verimli ayırma ve çıkarma ulaşabiliriz basit ve çok sağlam elektrokinetik tekniktir. Örneğin, ayırma ve etiketsiz hassas tespiti için ITP uygulama göstermiştir 3 çok az veya hiç Numune hazırlama 4-8 ile ve hücre kültürü, idrar, kan gibi karmaşık bir matris gelen nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için iyonik molekülleri (örn. toksinler, DNA, rRNA, miRNA). 9-12

ITP odaklanma ve akıcı bir kanal sistemi içinde uygulanan bir elektrik alanı ve iki Tampon kullanan ayrılması başarır. Anyonik analitler için, önde gelen elektrolit (LE) tampon s seçilironun anyonlar sondaki elektrolit (TE) tamponu (Etkili hareketliliği bir iyon gözlemlenebilir sürüklenme hızı olarak açıklanmaktadır ve Persat ve arkadaşları tarafından detaylı olarak tarif dikkate iyon iyonizasyon durumuna alır ve anyon daha yüksek etkili elektroforetik hareketlilik olduğu uch . 13). TE ve LE arasında bir arayüz kurduktan sonra, bir elektrik alanı LE iyonlar TE iyonları tarafından işgal edilmiş bölgeden uzaklaşmaya böyle uygulanır. Öncesinde TE iyonlarının ama ara etkili hareketlilik yarış Örnek iyonları LE iyonları sollamak edemez ve böylece LE-TE arayüzü (bundan sonra "ITP arayüzü" olarak adlandırılır) de odaklanmak. Ayrıca, TE ve ITP arayüzüne dik bir elektrik alanı degrade kurmak sırasıyla düşük ve yüksek iletkenlik, LE form bölgeleri. Onlar odak olarak bu alanda degrade örnek türler preconcentrates. Uygun olmayan diğer odaklı türlerden odaklanan ve hedef türlerin arıtma TE ve LE sonuçları seçimi ve en sonunda bir ayrılıkörnek türlerin d ayrımı.

Biz burada fiziksel ilkeleri esas ITP gözden geçirmek ve iki çalışma standart modlar tartışmak: "zirve" ve "yayla" modları. Pik modunda, nispeten örnek iyonlar ITP arayüzü dar doruklarına örtüşen içinde birlikte ele sulandırın. Plato modunda, daha bol örnek iyonları bir kararlı durum konsantrasyonuna ulaşmak ve onların etkin hareketlilik tarafından sipariş komşu plato gibi bölgeleri içine ayırınız. Tepe ve yayla modları aynı temel fizik doğan, ancak ilk analit konsantrasyonu ve / veya örnek birikimi için ayrılan süreyi göre farklı farklı rejimleri temsil eder.

Biz ilk ayrıntılı bir model pik modunda deneyde tanımlamak ve sonra E. nükleik asitlerin ekstraksiyonu için bir zirve modu tahlil göstermek coli hücre kültürü. Biz ayrımı görselleştirmek için olmayan bir odak tracer (NFT) türleri kullandığınız yere, bir plato modu test sunarak başına ve sonuçlandırmakAmino asitlerin kantitatif oluştururlar.

Protocol

1. ITP Fizik

ITP gibi ücretten iyonlar arasında keskin bir hareketli sınır oluşturur. Teknik anyonik veya katyonik örnekleri ile yapılan, ama biz terzi bu anyonik ITP giriş ve not aynı ilkeler katyonik ITP için geçerli olabilir. Biz LE iyonları yüksek büyüklüğü etkili elektroforetik hareketlilik var böyle LE ve TE tampon seçin. Etkili elektroforetik mobilite, μ = U / E, uygulamalı elektrik alanı, E ve iyon sürüklenme hızı, U arasında sürekli orantı. 13. Biz LE ve TE arasında yaygın arabirim kurmak ve gelen yüksek yönettiği bir elektrik alanı uygulamak Düşük iletkenlik TE dilimine iletkenlik LE bölgesi. Sistem hızlı bir şekilde düzgün olmayan iletkenliği tercihe bağlı ITP arayüzeyde elektrik alanı kuvvetli bir gradyan, kurar. Adından başı olarak aynı, tek tip ve at, TE ve LE iyonları seyahat (Yunancadan, "isos" "takhos" "hızlı" anlamına gelen, "eşit" anlamına gelir)locity, düzgün olmayan elektrik alanı ve akım korunması bir sonucu olarak (bu sözde "ITP durumu" dir, bakınız Şekil 1).

ITP arayüzü kendini bilemektedir: TE bölgesi deneyimi içine güçlü bir geri akı, yaygınlaştırılması ve önde gelen bölge (ve LE bölgesinde TE iyonları için tam tersi) dönmelerini LE iyonları. Örnek iyonlar TE bölgesinde, kendi etkin hareketlilik TE co-iyonları daha büyükse bu arayüzden odaklanmak ve LE bölgesinde, kendi etkin hareketlilik LE co-iyonları (bkz. Şekil 1) daha az ise. Bu tekniğin sağlamlık katkıda bulunmak ve arayüz (örneğin bu kasılmalar, açılımlar ve dönüşler gibi basınç tahrikli akış veya geometri değişimleri nedeniyle) bozulmasi ITP nispeten duyarsız hale kendiliğinden bilenen ve ITP özellikleri duruluyor.

Pik modu ITP (Şekil 2a ve Videolar 1-2 bakın), örnek iyon konsantrasyonlarıher zaman LE ve TE iyon yoğunluğunun anlamlı olarak daha düşük ve bu nedenle yerel iletkenlik denecek katkıda bulunur. Örnek iyonların dağılımı komşu bölgeleri arasındaki kendiliğinden bilenen arayüzü (burada TE ve LE) ve bu bölgelerin göreli örnek etkili hareketlilik değeri tarafından belirlenir. Büyük ölçüde olarak 14 Çoklu numune iyonları aynı dar ITP arayüzü bölge içinde ele zirveleri örtüşen. Arabirim ve zirve genişlikleri gibi ilişkili deriştirme faktörü, uygulanan akım ile ters skala (Şekil 2b'de deneyler bakınız). 14

Yeterince yüksek ilk numune konsantrasyonu ve yeterli birikimi bir süre için, örnek iyonları bir eşik konsantrasyon değerine ulaşır. Tam-iyonize türler için, bu değer Kohlrausch regüle fonksiyonu (KRF) ile tespit edilir. Zayıf bir elektrolit için 15, bu Alberty ve Jovin fonksiyonlar ile belirlenir. Platoda 16,17modu, Şekil 3 ve örnek ionlar etkili hareketliliği tarafından belirlenen bir düzen içinde yerel olarak tekdüze ve sürekli konsantrasyon bölgeleri ayırmak ve saflaştırmak Video 3, tasvir. Çok seyreltik iyonları hala yayla bölgeleri arasında pik modunda odak noktası olabilir. İTP, örnek iyonlar TE ve LE (bkz. Şekil 3) arasında sonlu bir enjeksiyon getirilemeyecektir veya dönüşümlü TE ve / veya LE (bkz. Şekil 2) ile birlikte karıştırılır. Biz sürekli analit iyonları birikir için kullanılabilir "yarı-sonsuz" enjeksiyonu gibi TE bölgesinde karıştırma bakın. Sürekli örnek birikimi pik ve plato modunda deneyleri hem hassasiyetini artırır. Ancak, sonlu enjeksiyonları plato modunda daha sık görülür. Yarı-sonsuz enjeksiyon yüksek başlangıç ​​analit konsantrasyonlarının önemli ölçüde TE iletkenliği ve düşük odaklanarak oranlarını artırabilir, çünkü bu muhtemeldir. Ayrıca, tam arınma (orada Rema beri yarı-sonsuz enjeksiyonu mümkün değildirTE ins sonlu bir konsantrasyon).

2. Cihaz temizleme ve hazırlama

Bu protokol sunulan testlerde bir çapraz-kanal tasarımı (bkz. Şekil 1) ile izotropik (kabaca D-şekilli bir kesite) ıslak-kazınmış cam mikroakışkan çipleri kullanır. Aşağıdaki temizleme ve hazırlama protokolü borosilikat ve erimiş silis kanallar için optimize edilir, fakat, aynı zamanda cam / PDMS yongaları ile birlikte kullanılabilir. Run-to-çalıştırmak tekrarlanabilirlik ve elektroozmotik akış (EOF) bastırmak için gerekli dinamik kaplama başarılı bir uygulama sağlamak için önce deneyler için bu temizleme işlemi gerçekleştirin. Bu protokolün ihmal ITP arayüz kuvvetli dispersiyon ile sonuçlanabilir. 14

  1. Kanal dekontamine için,% 10 çamaşır suyu 10-20 uL ile Kuzey, Doğu, ve Güney rezervuarları doldurun ve 2 dakika süreyle Batı rezervuar, vakum uygulanır. Standart bir kaliper çip caddy kullanıyorsanız, vakum etkili basitçe attachin ile uygulanabilirg Geniş 200 ul sonu (filtresiz) çip rezervuara pipet ve 2 mm iç çapı tüpe vakum hattına bağlanıyor.
  2. Rezervuar boşaltır ve 2 dakika süre ile 1 M sodyum hidroksit ile kanalın (olarak adım 1) durulanır. Bu nazikçe üniform yüzey özellikleri kurulmasına yardımcı olmak, temiz bir borosilikat yüzey veren, kanal duvarları etches.
  3. Rezervuar boş ve de-iyonize su (DI) ile temiz, daha sonra ~ 2 dk LE ile kanal durulayın. Bu dönemde yüzey özellikleri ve dinamik kaplamalar kanal içindeki denge.

3. Fluorofor pik modunda ITP odaklanarak

  1. 100 mM HCI, 200 mM tris, ve% 1 PVP oluşan 1 mL LE hazırlayın.
  2. 100 mM HEPES oluşan 1 ml TE ve 200 mM tris hazırlayın. 1 uM Alexa Fluor 488 (AF488) 10 ul ile TE 90 ul birleştirin.
  3. LE ile iyice durulandıktan sonra boş olarak, Bölüm 2 Batı rezervuar açıklanan ve veya DI ile birkaç kez temizleyinder rezervuar içinde kalan LE sulandırmak için. 20 uL TE AF488 içeren bu doldurun.
  4. Doğu rezervuar pozitif elektrot ve Batı rezervuar yere (negatif) elektrot yerleştirin ve 2 uA (sabit akım) uygulanır. Örnek tepe Batı rezervuardan Doğu rezervuar (bkz. Şekil 1) ve düşük iletkenlik TE kanal dolguları bu rezervuarlar arasındaki gerilimi artıracak bir sabit hızda göç olacaktır.

4. Kültürlü E. gelen Ekstraksiyon ve nükleik asitlerin saflaştırılması coli

Seçici iyonik türler odaklanma yeteneği biyolojik numune hazırlama için ideal bir tekniktir ITP yapar. Etkili bir hareket büyüklüğü, hedef nükleik asit daha düşük fakat co-iyonik PCR inhibitörleri (örn. anyonik deterjan, proteinler ve organik çözücüler, olsa bile, yüksek mevcut daha yüksek olan bir eğik anyon seçerek arıtılmamış hücre lizatı gelen nükleik asit saflaştırılmasıGH konsantrasyon). Katyonik PCR inhibitörleri (örn. alkali metaller ve katyonik deterjanlar ve proteinler) ters yönde geçirmek ve bu nedenle de geride edilir. Yavaş PCR-inhibe türler arkasında (bkz. Şekil 4) bırakırken ITP, örnek rezervuardan hedef nükleik asitler ayıklar ve odaklanır.

  1. Bir örnek veya kültür E. edinin bir yoğunlukta 10 den daha büyük 8 CFU / ml 'ye coli hücreleri.
  2. 6 dakika 4000g santrifüj ile güvenli bir kilit mikrosantrifüj tüpü ve pelet içine 1 ml hücre kültürü aktarın.
  3. 80 uL RNase içermeyen su içinde tekrar askıya pelet, 10 mM trişin, 10 mM tris-bis, 2 mM EDTA,% 0.1 Triton X-ve 5 mg / mL lizozim parçalama ajanı içeren 10 ul ilave edin. İyice karıştırın ve 5 dakika inkübe edin. oda sıcaklığında (Bercovici ark uyarlanmıştır parçalama protokolü. 11).
  4. ~ 12.5 lizat pH yükseltmek için 1 M sodyum hidroksit ile 10 uL ekleyin. Yavaşça pipet yukarı ve aşağı harekete kadarçözüm noktası parçalama tamamlandığında hangi, netleşiyor.
  5. 50 mM trişin 90 uL ve 100 mM tris-bis ile lizatı 10 uL birleştirir. Bu çözüm, artık TE olarak kullanılabilir.
  6. 500 mM tris-bis, 250 mM HCI,% 1 PVP ve 1X SYBR Green II oluşan LE 1 mL hazırlayın. Olarak 3. bölümünde tanımlanmıştır LE ile mikroakışkan çip doldurun.
  7. ITP takiben off-çip analizi için saflaştırılmıştır nükleik asidi elde etmek için, 50 mM tris-bis, 25 mM HCI, ve% 0.1 PVP ihtiva eden bir PCR ile uyumlu LE East rezervuar içeriğinin yerini alır. Denemenize başlamaya Doğu ve Batı kuyular arasında 1000 V uygulayın. Bu rezervuarların arasındaki akım azalacaktır.
  8. Deney sonunda örnek LE haznesine elutes. Bu elüsyon tesadüf, bu sistem için tercih edilen zaman genellikle bir plato değeri (direnç şimdi düzgün kanal içinde dağıtılan TE iyonlarının hakim olduğu bu yana) ulaşır. Yavaşça karıştırın rezervuariçindekiler pipetleme tekrarlanır ve nicel RT-PCR ile analiz için bir 5 uL hacmi özü.

5.. Görselleştirme için katyonik plato modu ITP ve non-odaklama tracer (NFT) ile amino asitlerin ayrılması

ITP TE ve LE arasındaki bitişik ve saptanabilir yaylaları içine küçük iyonları ayırmak ve odaklanmak için kullanılabilir. Bu tür yerel iletkenlik, UV absorbans, sıcaklık algılama, ya da kırılma indeksi gibi fizikokimyasal özellikleri, dayalı algılama ve tanımlama sağlar. Burada bir floresan, co-iyonik türler LE eklenir olmayan bir odak izleyici (NFT) assay göstermektedir. Bu floresan türleri ele vermez, ama onun konsantrasyonu yerel bir elektrik alanı adapte olur ve böylece (bkz. Şekil 5) saflaştırılmış plato bölgeleri görselleştirme sağlar.

  1. 100 mM etanolamin oluşan 1 mL LE, 200 mM trişin, ve% 1 PVP ve katyonik fluorofor rodamin 6G 100 uM hazırlayın.
    2. <li> Hazırlama 1 ml TE 20 mM tris, 40 mM trişin oluşan. 10 uL 50 mM arginin her biri ve lisin 50 mM TE 90 uL karıştırılarak numunesinin hazırlanması.
  2. 20 uL Batı'da LE ve Doğu rezervuar Kuzey rezervuar ve örnek dağıtın. 1 dakika Güney rezervuar az vakum uygulayın.
  3. DI ile iyice durulayın Doğu ve TE (örnek olmadan TE) ile değiştirin.
  4. Doğu ve Batı rezervuarlar arasında 500 V uygulayın.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Bu Şekil 4, Şekil 2b ve nükleik asit ekstraksiyon deneyler içinde tepe modu deneyler isotachopherograms göstermektedir. Bir flüoresan raportör (örneğin AF488, SYBR Green II) ile pik modunda deneylerde, genel floresan nicel konsantrasyonu bilgileri almak için bir kalibrasyon eğrisi karşı entegre ve mukayese edilebilir. Ayrıca 12, nükleik asit ekstraksiyon deneyleri, örnek Zehir izin verilir t içineO LE rezervuar ve nicel RT-PCR. 10,12 ile analiz için bir pipet ile ekstre We Şekil 5 amino asit ayrılması için plato modu isotachopherograms göstermektedir. Bölgesi genişlikleri kantitatif sağlarken floresans yoğunluğunu (LE ya TE bölgesi yoğunluğu oranla), bölgesi belirlenmesi için de kullanılabilir.

Şekil 1..
Şekil 1. Isotachophoresis (ITP) iyonları hassas algılama ve ayrılması için mikroakışkan uygulamalarda kullanılan bir elektrokinetik tekniktir. ITP ayırma, seçici odaklama ve önderiştirme yetenekleri sunuyor. Buna ek olarak, son derece sağlam ve nedeniyle kendiliğinden bilenen doğanın fiziksel bozuklukları duyarsız. Örnek iyonları seçici LE bölgesi öncü iyonlarının hızı ile belirlenir sabit bir hızda mikrokanal yoluyla bir öncü (LE) ve sürükleme elektrolit (TE) ve seyahat arasındaki odaklanacaktır. Örnek iyonlarıbunların etkin elektroforetik mobilite LE ve TE iyonların etkili hareketliliğin parantez ise odak. Şematik örnek LE ve TE bölgeler arasında sürekli odaklanan bir model ITP deneyi anlatıyor.

Şekil 2.
Şekil 2. "Zirve modu" ITP örnek iyonlar odak sulandırınız. a) İki ayrı seyreltilmiş (c örnek << c LE) ve TE LE bölgeler arasında oluşan arayüz pik modunda tür odak. Örnek türlerin önemli güncel katkıda yok gibi sadece LE ve TE, elektrik alanı belirler. Örnek iyonlar TE (yarı-sonsuz enjeksiyon) ile karıştırılır ve ITP arayüzüne bir kabaca Gauss pik birlikte odaklanır. Odaklama kriter (eşitsizlikler olarak gösterilir) kuvvetli iyonize türler için de geçerlidir. b) Alexa Fluor 488 (AF488) gösteren deneyler (ayrıca bakınız V uygulamalı akımların bir dizi için pik modunda odaklıideo 1). Örnek tepe genişliği (elektroozmotik akışı nedeniyle ihmal moleküler hızın etkin dağılımı için) akımı ile ters orantılıdır. 14 kendiliğinden bilenen arayüz basınç tahrikli akış (Video 2) nedeniyle dağılım dayanıklıdır.

Şekil 3.
Şekil 3. Örnek "plato" modunda yeterince yüksek konsantrasyonda odağında iyonları ve yerel iletkenlik düzenler. Biz genellikle TE ve LE arasında sonlu bir enjeksiyon örnek iyonlar tanıtmak. Bu yöntem, bunların etkili elektroforetik mobilite (Video 3) göre numune iyonları ayrı ve sipariş. Kuvvetle iyonize türler için, TE ve yayla bölgesi konsantrasyonları Kohlrausch düzenleyici fonksiyonu (KRF, LE bölgesi tarafından başlangıçta değişmeyen set) tarafından belirlenir. Seyreltik iyonları plato bölgeleri braketi onların etkin hareketlilik arasında pik modunda odaklanmaya devam ediyoruz. C Odaklamariterion (eşitsizlikler olarak gösterilir) kuvvetli iyonize türler için de geçerlidir.

Şekil 4.
Şekil 4. Pik modu ITP ile hazırlanması ve nükleik asit ekstraksiyon Lizat. Nükleik asit E. çıkarılır lizozim destekli alkali parçalama kullanarak ve ITP ile odaklanarak seçici elektroforetik arıtıldı coli hücre kültürü. Lizat ile karışık TE (kahverengi) hedef nükleik asit (yeşil), proteinler, ve potansiyel PCR-inhibe kimyaları içerir. Iyonları takip ve önde gelen Uygun seçimi geride PCR inhibitörlerinin bırakarak hedef nükleik asit odaklanarak seçici sağlar. Ek modül, burada gösterildiği gibi toplam nükleik asit ITP pik genellikle, İdeal olmayan bir şekil alır. Bu deneyde bir göstergesi olarak, gram-negatif bakterilere toplam nükleik asit ayıklanır, ITP kullanılarak E. coli (tek başına sodyum hidroksit çözeltisi ile lizlendi), lizat arındırılan NA, toplanangenetik materyal, ayıklanır ve 16S rRNA (kırmızı) ve bakteriyel kültürden 16S rDNA (yeşil) saflandırılmasında doğrulamak için QRT-PCR analizleri uygulandı. 16S rRNA (mavi) ve 16S rDNA (sarı) Negatif kontrol eşiği döngüleri her Yukarıda 30 devir idi. Biz Güç SYBR Green RNA-C T tavsiye edilen ısıl şartlarda 150 ileri nM (5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) ve ters (5'-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) primerleri ile Uygulamalı Biosystems'ten 1-Adım Kit kullanarak QRT-PCR yapıldı.

Şekil 5.
Şekil 5. Sigara odaklanan etiketsiz amino asitlerin ayrılması ve algılama için izleyici (NFT) testi. NFT assay of a) şematik. Örnek iyonları bir sonlu enjeksiyonu Doğu kanal içine tanıtıldı. Biz TE iyonları (μ izleyici <μ TE) daha etkili mobilite düşük bir izleyici katyonik fluorofor ile LE karıştırın. Fluoroforbir "underspeeding izleyici" olarak hareket söyleniyor. Fluorofor şimdi örnek yayla ve TE tarafından işgal bölgeleri içine LE gelen electromigrates olarak, daha yüksek bir elektrik alan ve böylece konsantrasyonu artar yaşar. Konsantrasyonda Bu değişiklik isotachopherogram basamakları oluşturur. b) iki amino asitleri, arginin ve lizin, ayrılması underspeeding floresan İzleyici olarak rodamin 6G ile NFT testi kullanılarak. TE ve arginin arasında hafif bir tepe, İTP yaygın olan iyi anlaşılmış değildir, ve burada yaylaları tespit veya miktarının engel değildir.

Ek Movie 1. tamamlayıcı filmi görmek için buraya tıklayın .

Ek Film 2. ek filmi görmek için buraya tıklayın .

Ek Movie 3. tamamlayıcı filmi görmek için buraya tıklayın .

Discussion

ITP yöntemleri burada iyonik moleküllerin hızlı, hassas ve sağlam algılama ve işleme olanak sundu. İTP kullanarak temel zorluk LE ve TE tamponlar uygun seçimdir. Bu, çok yüksek mutlak hareket yeteneğine sahip güçlü bir asittir ve böylece çok öngörülebilir özelliklere sahip olduğundan anyonik ITP olarak, tipik olarak gelen anyon olarak klorid tercih. Bu nedenle, anyonik ITP'de tampon seçimi, genellikle uygun bir TE ve kontriyon tercih indirgenir. Seçici odaklanma deneyler için, TE seçim iyonları kirletici dışlanması için çok önemlidir. Kirletici maddeler mevcut olmayan uygulamalar olarak, düşük bir TE etkili hareketliliği odaklama hızlı bir oranda yol açar. MES, MOPS, HEPES, trişin: Biz nispeten anyonik TE iyonları uslu, aşağıdaki kullanmanızı öneririz. Kontriyon Seçimi sistemi pH ve TE etkili bir hareketlilik hem de etkiler. Yaygın counterions tris (pKa 8.1) ve bis-tris (pKa 6.4) vardır. Düşük veya yüksek pH gerektiren testler için, piridin tavsiye (pKa 5.25) vesırasıyla, etanolamin (pKa 9.5),. Tablolar 1 ve 2'de, anyonik, katyonik ITP için, sırası ile, bir çok faydalı tampon örnekleri özetler. Bu katyonik LE iyonu olarak anyonik LE iyonu ve sodyum gibi HCl alır, ve bu LE tamponun 100 mM iyonik kuvvet varsayılmaktadır.

Okuyucunun protokolleri bu tampon iyonik gücün not edin (Tablolar 1-2 ve in) her zaman büyük veya 10 mM eşit olacaktır. Teoride ITP fizik 10 mM daha düşük iyonik gücü de geçerlidir, 1 mM düzeyine yakın doğal kirleticiler (su ve atmosferdeki karbondioksit arasındaki reaksiyonun örneğin karbonik asit) genellikle düşük iyonik güçlü tamponlar pratik kullanımını sınırlandırmaktadır.

Bu sinyal iletimi mekanizmasının Bu protokolde sunulan deneyleri ile sınırlı değildir, dikkat ediniz. Bölgeleri saflaştırılmış plato modunda Bölüm 5, kısaca değinildiği gibi yerel iletkenliği değişiklikler, UV absor yoluyla tespit edilebilirkırılma ağır bozukluklar, sıcaklık veya dizin. Kendi grubunda, biz bilinmeyen analitlerin hassas algılama ve tanımlama için floresan taşıyıcı ampholytes kullanan bir yöntem geliştirdik. Pik modunda deneylerde 5, spesifik problar odaklı analitler etiketlemek için kullanılabilir. Yüksek özgüllük ile hedef DNA veya RNA molekülleri tespit 11,18 - kendi hedef diziyle hibridizasyon üzerine floresan oligonükleotid problar - Bir örnek olarak, moleküler işaretleri kullanabilir.

ITP basınç tahrikli akışı ve EOF kaynaklanan dispersiyon için göreceli olarak sağlamdır iken, aşırı EOF ortalama EOF hızı ITP hızına eşit olur ITP arayüz, durgunluk yol açabilir. 14 gibi güçlü bir EOF özellikle yüksek pH şartlarında meydana ve düşük iyonik gücü. Bu nedenle, 100 mM amacıyla uygun olursa üzerindeki pH 8 veya daha düşük olan ve iyonik gücü olan tamponlar kullanılması tavsiye edilir. Deneyimlerimize göre, PVP olduğunuborosilikat fiş EOF bastırılması için en etkili kaplama. Ancak, bu eleme özellikleri, örneğin PVP genomik DNA odaklama gibi bazı uygulamalar için uygun olmayabilir. Deneylerde, PVP eklenmesinin büyük ölçüde (bunu ele vermez noktaya) genomik DNA mutlak hareketlilik azaltabilir dikkat. Bu durumda böyle bir yüzey (örneğin Triton-X 100) ile conjuction Sigmacote olarak silanolle kaplama da EOF azaltmada etkili olabilir. 10

TE anyon (pKa -1)
Tamponlama karşı iyon (pKa 1) MES (6.10) MOPS (7.20) HEPES (7.50) trişin (8.15)
etanolamin (9.50) 21.41 20.40 17.38 22.85
tris (8.08) 21.00 19.23 </ Td> 15.84 17.56
bis-tris (6,40) 18.22 10.41 7.30 5.23
piridin (5.18) 1.01 3.72 2.42 1.48

Tablo 1. LE 100 mM HCl ve 200 mM tamponlama karşı iyon anyonik İTP arındırılmış saf analit bölgesi Etkin hareketlilik büyüklüğü (× 10 -9 m 2 / V / s).

TE katyonu (pKa 1)
Tamponlama karşı iyon (pKa -1) etanolamin (9.50) tris (8.08) bis-tris (6,40) piridin (5.18)
MES (6.10) 35.57 21.96 16.39 10.45
MOPS (7.20) 35.47 20.92 9.76 3.93
HEPES (7.50) 35.35 19.97 7.77 2.88
Trişin (8.15) 34.77 16.72 4.50 1.44

Tablo 2. Katyonik İTP düzeltilmiş saf analit bölgenin Etkili hareketlilik büyüklüğü (× 10 -9 m 2 / V / s) LE 100 mM sodyum ve 200 mM tampon karşı iyon.

Disclosures

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz minnetle DARPA sponsorluğunda Mikro / Nano Fluidics Temelleri Focus (MF3) sözleşme numarası N66001-10-1-4003, altında Merkezi'nden ve DARPA hibe N660001-09-C-2082 fon kabul ediyorsunuz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Distilled water GIBCO, by Life Technologies 10977 RNase/DNase free
Clorox Ultra Clorox 02489CT
sodium hydroxide (NaOH) Mallinckrodt Baker Inc. 7708
hydrochloric acid (HCl) EMD Millipore HX0603-4
Trizma base (tris) Sigma-Aldrich T6066
polyvinylpyrrolidone (PVP) Polysciences, Inc. 06067 MW 1,000,000
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Alexa Fluor 488 carboxylic acid Invitrogen A20000
tricine Sigma-Aldrich T-9784
bis-tris Sigma-Aldrich B4429
EDTA GIBCO, by Life Technologies AM9260G
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
SYBR Green II Invitrogen S7564
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000
Rhodamine 6G Acros Organics CAS 989-38-8
L-Amino Acids Sigma-Aldrich LAA21
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit Applied Biosystems 4389986
PCR primers Integrated DNA Technologies
Borosilicate microfluidic chip Caliper Life Sciences NS12A Supplied with or without plastic caddy
Vacuum pump Gast Manufacturing, Inc. DOA-P104-AA
Sourcemeter Keithley 2410 Constant current and constant voltage operation modes
Inverted epifluorescent microscope Olympus Corporation IX70 Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination
Filter cube Omega Engineering, Inc. XF115-2 Excitation/emission: blue/green
Safe-lock microcentrifuge tubes Eppendorf 022363204 1.5mL capacity
Centrifuge Eppendorf 5417C
Table 3. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis. Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).
  2. Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis. Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).
  3. Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications. Elsevier Science & Technology. , (1976).
  4. Khurana, T. K., Santiago, J. G. Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers. Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).
  5. Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water. Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).
  6. Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay. Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).
  7. Kaigala, G. V. Miniaturized system for isotachophoresis assays. Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).
  8. Chambers, R. D., Santiago, J. G. Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers. Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).
  9. Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis. Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).
  10. Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis. Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).
  11. Bercovici, M. Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons. Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).
  12. Marshall, L. A., Santiago, J. G. Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis. Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).
  13. Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers. Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).
  14. Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Sample dispersion in isotachophoresis. J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).
  15. Kohlrausch, F. Über concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von lÖsungen und lÖsungsgemischen. Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).
  16. Alberty, R. A. Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases. J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).
  17. Jovin, T. M. Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations. Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).
  18. Persat, A., Santiago, J. G. MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons. Anal. Chem. , (2011).

Tags

Biyomühendislik Sayı 61 Isotachophoresis elektrokınetik Mikroakiskan numune hazırlama
İyonların ayrılması ve Nükleik Asit Saflaştırılması için on-chip Isotachophoresis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garcia-Schwarz, G., Rogacs, A.,… More

Garcia-Schwarz, G., Rogacs, A., Bahga, S. S., Santiago, J. G. On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (61), e3890, doi:10.3791/3890 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter