Summary

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

Published: June 13, 2012
doi:

Summary

Este artigo descreve uma sequência otimizada de eventos para imagiologia multimodal de enxertos celulares no cérebro de roedores por meio de: (i) na bioluminescência vivo e ressonância magnética, e (ii) a análise post mortem histológica. A combinação destas modalidades de imagem em um único animal permite uma avaliação do enxerto celular com alta resolução, sensibilidade e especificidade.

Abstract

Durante a última década, o transplante de células estaminais ganhou interesse crescente como primário ou secundário modalidade terapêutica para uma variedade de doenças, tanto em estudos pré-clínicos e clínicos. No entanto, até à data resultados referentes resultado funcional e / ou tecido regeneração transplante de células estaminais seguinte são bastante diversos. Geralmente, um benefício clínico é observado sem uma profunda compreensão do mecanismo subjacente (s) 1. Portanto, os esforços têm múltiplas levou ao desenvolvimento de diferentes modalidades de imagens moleculares para monitorar enxerto de células-tronco com o objectivo último para avaliar com precisão o destino, sobrevivência e fisiologia de células estaminais enxertados e / ou do seu ambiente de micro-. Alterações observadas em um ou mais parâmetros determinados por imagem molecular pode estar relacionado com o efeito observado clínica. Neste contexto, os nossos estudos focalizam o uso combinado de imagem de bioluminescência (BLI), ressonância magnética (MRI) e Analysi histológicas para avaliar células estaminais do miocárdio.

BLI é normalmente usado para executar de forma não invasiva de rastreamento de células e monitorar a sobrevivência das células no tempo após o transplante de 2-7, com base numa reacção bioquímica onde as células expressando o gene repórter da luciferase-são capazes de emitir luz interacção seguinte com o seu substrato (por exemplo, D- luciferina) 8, 9. RM, por outro lado é uma técnica não-invasivo que é clinicamente aplicável 10 e pode ser usado para localizar precisamente os enxertos celulares com resolução muito elevada 11-15, embora a sua sensibilidade altamente depende do contraste gerado após marcação das células com um agente de contraste para IRM . Finalmente, post-mortem análise histológica é o método de escolha para validar os resultados de pesquisa obtidos com técnicas não-invasivas com maior resolução e sensibilidade. Além disso end-point análise histológica nos permite realizar uma análise detalhada fenotípica das células enxertadas e / ou tecido circundante, based sobre a utilização de proteínas repórter fluorescentes e / ou rotulagem célula directa com anticorpos específicos.

Em resumo, estamos aqui visualmente demonstrar a complementaridade de BLI, ressonância magnética e histologia para desvendar células-tronco e diferente / ou meio ambiente associada seguintes características de células-tronco de enxerto no sistema nervoso central de camundongos. Como um exemplo, derivadas da medula óssea células estromais, geneticamente modificados para expressar o reforço de Proteína Fluorescente Verde (eGFP) e luciferase do pirilampo (FLUC), e marcadas com azul fluorescentes micron de tamanho de partículas de óxido de ferro (MPIOs), vai ser enxertados na SNC de camundongos imuno-competentes e os resultados serão monitorados por BLI, ressonância magnética e histologia (Figura 1).

Protocol

1. Preparação de células Experiências deve ser iniciada usando ex vivo populações de células-tronco cultivadas geneticamente modificadas para expressar as proteínas repórter da luciferase e EGFP. Aqui usamos luciferase / eGFP-expressam murinos derivadas da medula óssea (células estromais BMSC-Luc/eGFP) como anteriormente descrito por Bergwerf et al. 2, 5. Dois dias antes de marcação celular, as células BMSC-Luc/eGFP em placas a uma densidade de 8 x 10 células por <…

Discussion

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo otimizado para a combinação de três modalidades de imagem complementares (BLI, ressonância magnética e histologia) para a caracterização detalhada dos implantes celulares no sistema nervoso central de camundongos imunes competentes. Uma combinação de rotulagem de gene repórter de células, com base na modificação genética com os genes repórter luciferase do pirilampo e EGFP, e uma célula de rotulagem directa com a GB MPIO, conduz a uma avaliação precisa de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> O trabalho do autor foi apoiado por bolsa de investigação-ID BOF 2006 da Universidade de Antuérpia (concedido a PPO e AVdL), pela bolsa de investigação G.0136.11 e G.0130.11 (concedido a AVdL, ZB e PPO) e 1.5.021.09. N.00 (concedido a PPO) do Fundo de Pesquisa Científica-Flanders (FWO-Vlaanderen, Bélgica), pela SBO bolsa de investigação IWT-60838: BRAINSTIM do Instituto Flamengo para a Ciência e Tecnologia (concedida a ZB e AVDL), em parte de uma pesquisa Methusalem concessão do governo flamengo (concedido a ZB), em parte, pela EC-FP6-NoE DIMI (LSHB-CT-2005-512146), EC-FP6-NoE EMIL (LSHC-CT-2004-503569) , e pelo Inter Universidade atração poloneses IUAP-NIMI-P6/38 (concedido a AVDL). Nathalie De Vocht tem um PhD bolsa de estudo a partir do FWO-Vlaanderen. Peter Ponsaerts é um pós-doutorado da FWO-Vlaanderen.</p

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
IMDM Lonza BE12-722F Component of the cell growth medium CEM
Fetal bovine serum Gibco 10270-106 Component of the cell growth medium CEM
Horse serum Gibco 1605-122 Component of the cell growth medium CEM
Penicillin-streptomycin Gibco 15140 Component of the cell growth medium CEM
Fungizone Gibco 15290-018 Component of the cell growth medium CEM
PBS Gibco 14190  
Puromycine Invivogen ant-pr-1  
trypsin Gibco 25300  
GB MPIO Bangs Laboratories ME04F/7833  
D-luciferin Promega E1601  
Ketamine (Ketalar) Pfizer    
Xylazine (Rompun) Bayer Health care    
Isoflurane Isoflo 05260-05  
0.9% NaCl solution Baxter    
paraformaldehyde Merck 1.04005.1000  
sucrose Applichem A1125  
Micro-injection pump KD scientific KDS100  
Photon imager Biospace Lab    
9.4T MR scanner Bruker Biospin Biospec 94/20 USR  
BX51 microscope Olympus BX51  
Mycrom HM cryostat Prosan HM525  
syringe Hamilton 7635-01  
30 gauge needle Hamilton 7762-03  
Photo Vision software Biospace Lab    
M3vision software Biospace Lab    
Paravision 5.1 software Bruker Biospin    
Amira 4.0 software Visage Imaging    

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De Vocht, N., Reekmans, K., Bergwerf, I., Praet, J., Hoornaert, C., Le Blon, D., Daans, J., Berneman, Z., Van der Linden, A., Ponsaerts, P. Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice. J. Vis. Exp. (64), e3906, doi:10.3791/3906 (2012).

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