Summary
此视频协议演示的荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯（CFSE）的应用程序的不同的子种群的细胞分裂的频率的基础上在人成胶质细胞瘤细胞的识别和分离。
Abstract
肿瘤的异质性表示支持肿瘤的鲁棒性的一个基本特征，并提出了一种中央障碍的发展的治疗策略1。为了克服肿瘤的异质性的问题，它是必不可少的表型，（EPI）的基因和功能的识别和鉴定的肿瘤亚群，推动特定疾病的病理学和代表临床相关指标的检测和工具，使开发。这是目前公认的肿瘤表现出不同的子细胞与细胞分裂的不同频率的分数，慢骑自行车的功能标准与多种癌症，包括脑癌，乳腺癌，皮肤肿瘤形成能力呈正相关胰腺以及白血病2-8。的荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯（CFSE）已被用于在体外和体内细胞的分裂频率跟踪在血源性吨umors和实体肿瘤如神经母细胞瘤2,7,8。细胞穿透物的非荧光的CFSE的前体药物通过细胞内酯酶转换成荧光的化合物，它被保留在细胞内，由共价结合的蛋白质，通过反应的琥珀酰亚胺基团与细胞内的胺基团，以形成稳定的酰胺键9。荧光染料同样分布之间的子细胞时分裂，导致细胞分裂的荧光强度与每个减半。这使得追踪细胞周期的频率高达八至十个师10轮。用CFSE保留容量与脑肿瘤细胞的识别和分离证明富集在肿瘤干细胞的活性2缓慢循环亚群（顶部5％的染料保持细胞）。
该协议描述了技术CFSE染色细胞内的个别人群的隔离一个的人glio文化母细胞瘤（GBM）衍生的细胞具有不同的部门使用流式细胞仪2。该技术一直凭借自己的能力，保留CFSE标记的识别和分离脑肿瘤慢骑自行车的细胞群。
Protocol
1。准备胶质母细胞瘤单细胞悬液
- 使用的神经球的吸附试验（NSA）如先前所述2,11,12 gliomasphere文化建立和维护。
- 在适当的时间用于传代gliomaspheres的，介质中含有球体除去，放置在一个适当大小的无菌组织培养管中，在室温下5分钟（110克）在800 rpm的转速下离心分离。
- 弃去上清液，和球形的颗粒再悬浮于1毫升的0.05％胰蛋白酶-EDTA和孵育在37℃下在水浴中3-5分钟。
- 然后用等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂，停止的胰蛋白酶活性。
- 轻轻地用移液管将细胞悬浮液，以确保均匀和完全中和的胰蛋白酶活性。
- 再次将细胞悬浮液离心5分钟，在800 rpm的转速下。弃去上清液，并将细胞重新悬浮于1ml的NeuroCultNSC基础培养基。
- 单细胞的悬浮液中加入10μl的是，混合与90μl的台盼蓝进行细胞计数。
2。与细胞微量羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）绿色荧光染料染色
- 对于每1百万个细胞被染色，1毫升的染色试剂制备通过加入1微升的5mM细胞微量的CFSE染料（分子探针，Invitrogen）中，以1毫升NeuroCult NSC基础培养基，得到的最终染色浓度为5μM 。
- 含有细胞的染色试剂充分混合，直至形成均匀物质，并在室温下孵育10分钟。
- 在培养期间，将冰冷的NeuroCult NSC基础培养基作为淬火溶液制备。
- 要停止的染色过程，约5到10倍体积的冰冷淬火溶液被添加到的CFSE加载细胞。
- 然后将溶液以800rpm离心5分钟，弃去上清液。
- 在日是点，应该出现颗粒的细胞在试管底部具有明亮的绿色色调的颜色，表示染色成功。
- 通过在1-2毫升新鲜NeuroCult NSC基础培养基中重悬沉淀，以800rpm离心5分钟，弃去上清，将细胞洗涤。重复该过程共洗涤三次。
- 第三次洗涤后，将细胞重新悬浮于1毫升NeuroCult NSC基础培养基，并进行细胞计数。
- CFSE的染色细胞，然后镀在无菌组织培养烧瓶中，在一个适当的密度[50,000个细胞/ ml]，并放置在37℃/ 5％CO 2培养箱中。
3。 CFSE载入验证
- 可以监视NSA培养接种于细胞，在荧光显微镜下，验证的CFSE的染色。在这个阶段，所有的细胞表现出明亮的绿色的颜色（ 图1）。可替换地，下降的细胞悬浮液CFSE的染色的细胞可以被放置在显微镜载玻片上，用盖玻片覆盖，在荧光显微镜下的可视化细胞。
- 成功CFSE标记通过流式细胞仪检测进一步证实。尽可能多的为1-5×10 5个细胞从每个组是足够的CFSE的染色验证。 CFSE加载细胞和卸载阴性对照细胞分别重悬在1×PBS或NeuroCult NSC基础培养基的总体积为500微升，并放置在单独的FACS管。
- 流式细胞仪是根据它的用户手册说明相关参数调整。的CFSE有一个最大的492 nm和最大发射波长为517 nm波长激发。
- 首先，的卸载控制细胞的运行和收购事件都记录在正向和侧向散射光（FSC与SSC）和直方图，主要的细胞人口的门控信号（ 图2A）。
- 同样，CFSE加载的细胞使用相同的参数进行了分析S用于对照细胞（ 图2B）。
4。分离慢分裂即CFSE保留细胞人口，用荧光激活细胞分选（FACS）
- 分裂后，CFSE的强度降低，并hGBM细胞形成gliomaspheres，呈现绿色荧光强度的不同水平的（ 图3）的细胞所组成的。当的gliomaspheres已达到约150-200微米的直径（约5〜10天的细胞系生长速率取决于后的CFSE加载）的平均尺寸，球体的培养基中被移除时，放置在一个适当大小的无菌组织培养管中，并以800rpm离心5分钟，在室温下。
- 甲单细胞的悬浮液，在先前的步骤中所描述的方法制备和密度高达每毫升10 7个细胞以制备细胞悬浮液，将细胞重新悬浮在PBS中作细胞计数。
- 船尾呃在适当体积的PBS重悬细胞，加入碘化丙啶（PI，Sigma公司，500微克/毫升）的浓度的1微升/毫升的细胞悬浮液中，排序时/通过流式细胞术分析，以排除死细胞。
- 两个15毫升无菌组织培养管中各含有1ml的完整NeuroCult NSC中等是用来收集的排序条件慢分裂的细胞（CFSE滞留细胞）和快速分裂的细胞（CFSE稀释细胞）。
- 首先，从卸载单元组的细胞悬浮液通过流式细胞仪运行。
- 基于前向散射（FSC）的相对于侧向散射光（SSC）和电压参数，这两个参数的绘制的细胞（事件）被调整以使大多数的细胞被包含在流图。
- 要排除死或受损的细胞，被绘制的细胞基于SSC与PI的反应性和单活细胞群体（PI阴性）被选通。
- 然后，均匀的细胞群体中选择基于forward散射（FSC）与侧向散射光（SSC）。
- 的均相单活细胞种群，然后绘制在直方图中，根据设置在对数刻度上的小区频率随CFSE强度。 CFSE的激光强度被调整，以便放置在0和100之间的负信号。
- 使用相同的参数和类似的门控策略，运行的CFSE标记的细胞通过流式细胞仪和分析（ 图4C）。
- 随后，确定一个缓慢的分裂细胞的人口和总人口（更快速分裂的细胞），根据自己的能力，保留CFSE（5％CFSE 高顶和CFSE 低底的85％，分别）。
- 这些不同的细胞群，然后整理成单独的15毫升无菌组织培养试管包含完整的NSC介质1ml的。
- 条件分类的细胞，然后在800 rpm离心5分钟离心。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于在一个合适priate体积的培养基（取决于上孤立的事件的数目，或颗粒尺寸）和细胞计数进行。
- 从不同的排序条件种群的细胞，然后在适当的无菌组织培养烧瓶中50,000个细胞接种于每毫升，并放置在37℃/ 5％CO 2培养箱串联传代或用于下游实验之前为5-10天。
5。代表性的成果
CFSE的装载后，所有的细胞提出了一种强烈的绿色荧光，如在显微镜下（ 图1）的可视化。绿色调的颜色可以看出，甚至用肉眼（见视频）。这些细胞，用流式细胞仪分析也对照细胞（ 图2）相比，显示高度强烈的绿色荧光。后装电镀CFSE细胞在神经干文化，这些细胞增殖并形成150〜200微米gliomaspheres在5-10天。随着细胞增殖，T荧光染料均匀地分布在部门之间的子细胞，导致的荧光强度与每一个细胞分裂减少了一半。胶质母细胞瘤是功能异质性和细胞增殖在不同的时间尺度上组成的。在本协议中所描述的方法可以凭借自己的能力淡化或保留CFSE，分别为（ 图3中 ，还可以看到视频）识别和分离快，慢分裂的细胞。
流式细胞分析的离解生成与卸载的细胞相比，在从的CFSE加载细胞gliomaspheres演示多样的CFSE保持性质（ 图4）。快速分裂的细胞（最低85％）或缓慢分裂的细胞（5％ - CFSE 高 ）展览gliomapshere形成能力培养的神经球的试验条件下（ 图5）。
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图1。后立即加载与CFSE染料的游离肿瘤细胞。细胞表现出明亮的绿色，展示成功的标记。放大倍数10倍。
图2。CFSE装载确认使用流式细胞仪A）空载细胞，B细胞）的 CFSE加载的细胞和C）在加载与卸载细胞的CFSE荧光强度比较。请注意，有几个数量级的差异之间的标记和未标记的细胞中的荧光强度。
图3。一位代表gliomasphere从CFSE加载细胞后第6天电镀而得。有些细胞表现出非常明亮的CFSE染色。放大倍数：63×。
产生图5。代表gliomaspheres
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Discussion
越来越多的研究已经证明一个缓慢的分割的子隔室的细胞在癌症有助于肿瘤的形成和治疗抵抗2-8的重要性。因此，这是至关重要的描述和标准化的实验方法，使此特定的细胞或更普遍的亚群的研究比较亚群具有不同的生长速率。使用的CFSE识别和分离部分的细胞根据其细胞分裂的速度是一个起点，进一步描述这些特定的细胞组分，有助于推进我们的理解，在肿瘤的异质性。在这个协议中，我们给的例子中识别和分离一个缓慢的分割人口内胶质母细胞瘤，但此协议也可以应用到其他的肿瘤细胞，包括并不限于乳腺癌，胰腺癌，皮肤癌。下游分析这些人群可以执行，并且可以包括此功能有理的研究比较，增殖潜能，肿瘤形成能力，治疗的敏感性，以及（EPI）的基因比较。此方法也可以使用与非癌系统，并且可以应用于，例如，体干细胞/前体细胞。
在过程中所涉及的关键技术要点足够的细胞用胰蛋白酶解离，并有足够建立一个适当的密度悬浮细胞在染色介质，并确保均匀的染色。一个小样本，应该检查新染的细胞，通过流式细胞仪检测，以确保均匀的特点是一个高斯状分布（ 见图2B）的标签。在异构初始标记的情况下，预排序可以为了提高具有更窄的范围内的CFSE荧光峰值分辨率执行。然而，应当确保这预排序不选择为特定的大小。使用碘化丙啶（PI）标记为important用于识别活细胞和死/损坏的人口去除从栅极的工作，由于死细胞，可以在下游应用中引入的偏置。这是当使用的频谱，如荧光染料藻红蛋白（PE）中的相邻的荧光染料时，值得注意的特别高的荧光强度的CFSE的标签和它的潜力渗进其他渠道。关键是要注意，CFSE荧光标记的抗体与多重标记实验可能需要补偿的过程在收购或分析时间。请务必让所有的必要的控制措施，包括提供的自体荧光染色的细胞，单染的细胞和特定的组合。多种颜色的标签，在结合的CFSE效果最好的荧光染料，例如太平洋蓝或别藻蓝蛋白（APC）。如果实验目的是量化的绝对数量在规定的时间内，中心的细胞分裂Ë平均荧光强度（MFI）有至少两个不同的时间点来衡量的第一个至少24小时后CFSE加载。 CFSE的强度急剧下降的最初24小时内，在的情况下的细胞分裂，但然后在细胞分裂的稳定和减小。也有必要为包括控制与非增殖的CFSE加载的细胞提供基线并不相关的细胞分裂的CFSE的强度衰减。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由佛罗里达州，普雷斯顿A.富国小中心的脑肿瘤治疗和美国国立卫生研究院（1R21CA141020-01）脑肿瘤研究中心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | R&D Systems | 2028-EG | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Molecular Probes, Life Technologies | C34554 |
References
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