Method Article

慢分裂的细胞在人脑胶质瘤羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）的分离与鉴定

DOI:

10.3791/3918

⸱

April 29th, 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran

In This Article

Summary

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此视频协议演示的荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯（CFSE）的应用程序的不同的子种群的细胞分裂的频率的基础上在人成胶质细胞瘤细胞的识别和分离。

Abstract

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肿瘤的异质性表示支持肿瘤的鲁棒性的一个基本特征，并提出了一种中央障碍的发展的治疗策略1。为了克服肿瘤的异质性的问题，它是必不可少的表型，（EPI）的基因和功能的识别和鉴定的肿瘤亚群，推动特定疾病的病理学和代表临床相关指标的检测和工具，使开发。这是目前公认的肿瘤表现出不同的子细胞与细胞分裂的不同频率的分数，慢骑自行车的功能标准与多种癌症，包括脑癌，乳腺癌，皮肤肿瘤形成能力呈正相关胰腺以及白血病2-8。的荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯（CFSE）已被用于在体外和体内细胞的分裂频率跟踪在血源性吨umors和实体肿瘤如神经母细胞瘤2,7,8。细胞穿透物的非荧光的CFSE的前体药物通过细胞内酯酶转换成荧光的化合物，它被保留在细胞内，由共价结合的蛋白质，通过反应的琥珀酰亚胺基团与细胞内的胺基团，以形成稳定的酰胺键9。荧光染料同样分布之间的子细胞时分裂，导致细胞分裂的荧光强度与每个减半。这使得追踪细胞周期的频率高达八至十个师10轮。用CFSE保留容量与脑肿瘤细胞的识别和分离证明富集在肿瘤干细胞的活性2缓慢循环亚群（顶部5％的染料保持细胞）。

该协议描述了技术CFSE染色细胞内的个别人群的隔离一个的人glio文化母细胞瘤（GBM）衍生的细胞具有不同的部门使用流式细胞仪2。该技术一直凭借自己的能力，保留CFSE标记的识别和分离脑肿瘤慢骑自行车的细胞群。

Protocol

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1。准备胶质母细胞瘤单细胞悬液

  1. 使用的神经球的吸附试验（NSA）如先前所述2,11,12 gliomasphere文化建立和维护。
  2. 在适当的时间用于传代gliomaspheres的，介质中含有球体除去，放置在一个适当大小的无菌组织培养管中，在室温下5分钟（110克）在800 rpm的转速下离心分离。
  3. 弃去上清液，和球形的颗粒再悬浮于1毫升的0.05％胰蛋白酶-EDTA和孵育在37℃下在水浴中3-5分钟。
  4. 然后用等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂，停止的胰蛋白酶活性。
  5. 轻轻地用移液管将细胞悬浮液，以确保均匀和完全中和的胰蛋白酶活性。
  6. 再次将细胞悬浮液离心5分钟，在800 rpm的转速下。弃去上清液，并将细胞重新悬浮于1ml的NeuroCultNSC基础培养基。
  7. 单细胞的悬浮液中加入10μl的是，混合与90μl的台盼蓝进行细胞计数。

2。与细胞微量羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）绿色荧光染料染色

  1. 对于每1百万个细胞被染色，1毫升的染色试剂制备通过加入1微升的5mM细胞微量的CFSE染料（分子探针，Invitrogen）中，以1毫升NeuroCult NSC基础培养基，得到的最终染色浓度为5μM 。
  2. 含有细胞的染色试剂充分混合，直至形成均匀物质，并在室温下孵育10分钟。
  3. 在....

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Discussion

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越来越多的研究已经证明一个缓慢的分割的子隔室的细胞在癌症有助于肿瘤的形成和治疗抵抗2-8的重要性。因此，这是至关重要的描述和标准化的实验方法，使此特定的细胞或更普遍的亚群的研究比较亚群具有不同的生长速率。使用的CFSE识别和分离部分的细胞根据其细胞分裂的速度是一个起点，进一步描述这些特定的细胞组分，有助于推进我们的理解，在肿瘤的异质性。在这个协议中，我们给的例子中识别和分离一个缓慢的分割人口内胶质母细胞瘤，但此协议也可以应用到其他的肿瘤细胞，包括并不限于乳腺癌，胰腺癌，皮肤癌。下游分析这些人群可以执行，并且可以包括此功能有理的研究比较，增殖潜能，肿瘤形成能力，治疗的敏感性，以及（EPI）的基因比较。此方法也可以使用与非癌系统，并且可以应用于，例如，体干细胞/前体细胞。

在过程中所涉及的关键技术要点足够的细胞用胰蛋白酶解离，并有足够建立一个适当的密度悬浮细胞在染色介质，并确保均匀的染色。一个小样本，应该检查新染的细胞，通过流式细胞仪检测，以确保均匀的特点是一个高斯状分布（ 见图2B）的标签。在异构初始标记的.......

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Disclosures

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没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

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这项工作是由佛罗里达州，普雷斯顿A.富国小中心的脑肿瘤治疗和美国国立卫生研究院（1R21CA141020-01）脑肿瘤研究中心的支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
的试剂的名称 类型 公司 目录编号
NeuroCult NSC基础培养基（人） 中干细胞技术 05750
NeuroCult补充NSC增殖（人） 中补充干细胞技术 05753
％0.05胰蛋白酶-EDTA 试剂 Gibco公司 25300-062
大豆胰蛋白酶抑制剂试剂西格玛 T6522
青霉素/链霉素试剂 Gibco公司 15140-122
T25烧瓶培养器皿 Nalge Nunc公司国际 136196
T80烧瓶培养器皿 Nalge Nunc公司国际 178905
15 mL管培养器皿 BD猎鹰 352096
50ml试管培养器皿 BD猎鹰 352070
EGF 生长因子 R＆D 2028-EG
CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒跟踪染料荧光细胞分裂 Molecular Probes公司，Invitrogen公司 C34554

References

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  1. Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
  2. Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-....

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CFSE StainingFlow CytometryGlioblastoma CellsSlow Dividing CellsNeurosphere AssayCell Division TrackingFluorescence MicroscopyPropidium IodideCell SortingTumor Heterogeneity

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