Summary
전환 문화에 피더 - 무료 조건에 지속적인 노력에도 불구하고, 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 유도와 문화 마우스 배아 피더 (MEFs)와 공동 문화에 달려 남아 있습니다. 여기, 우리는 신속하게 이전 실험에 hESC 문화에서 피더를 제거 소설 방법을 보여줍니다.
Abstract
마우스 배아 섬유 아세포의 (MEFs)는 blastocyst 절연 1 일 이후 인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 문화를 확립하는 데 사용되었습니다. 이 피더 시스템은 셀 확장하는 동안 자연스럽게 차별화를 겪고에서 hESCs을 유지합니다. 그러나이 공동 문화에있어서, 집중적 인 노동이 고도로 숙련 된 인력을 필요로하고, 수율 낮은 hESC의 순도 4. 많은 실험실 hESC 문화의 피더 세포의 수를 (즉, 매트릭스 코팅 요리 또는 기타 피더 세포 유형 5-8을 포함) 최소화하기 위해 시도했습니다. 이러한 수정 문화 시스템은 몇 가지 약속을 표시했지만, 미토 마이신 C-처리 마우스 embyronic의 섬유 아세포로 배양의 hESCs hESC 문화의 원치 않는 자연 차별화를 병신하기 위해에 대한 표준 방법을 supplanted 없습니다. 따라서, hESC 확장에 사용되는 피더 세포는 분화 실험을하는 동안 제거해야합니다. 여러 기술 hESC의 공동 정화에 사용할 수 있지만피더에서 lonies은 (FACS, 맥, 또는 약물 내성 벡터의 사용), 이러한 기술은 노동 집약적 인 비용 및 / 또는 hESC에 파괴됩니다. 이 프로젝트의 목적은 hESCs의 순수한 인구의 수확을 가능하게 정화하는 방법을 발명하는 것이 었습니다. 우리는 합류 hESC 문화에서, MEF 인구는 MEF 시트의 간단하고 빠른 흡인을 사용하여 제거 할 수 관찰했다. 이 제거 "측면 휴대 전화의 스티렌 배양 접시에 낮은 바인딩 친화력을 가지고 MEFs의 결합, 그리고 자신의 세대 동안 바깥쪽으로 섬유 아세포를 누르는 줄기 세포 콜로니의 능력 등 여러 가지 요인에 따라 달라집니다 틈새 ". hESC 그런 다음 pluripotency의 유지 보수를 보장하기 위해 MEF 제거 후 10 일 SSEA-4, Oct3 / 4, Tra 1-81 표현에 조사되었다. 또한, hESC의 식민지는 hESC 확장의 추가 레벨을 제공 MEF 제거 후 큰 형태로의 성장을 계속 할 수있었습니다.
Protocol
1. 마우스 배아 공급기의 작성
- hESCs의 공동 문화에 사용되는 MEFs는 이전에 다음 부서를 겪고에서 세포를 억제하기 위해 조사 또는 미토 마이신-C에 의해 처리되어야합니다.
- MEF를 심는 이전 두 시간, 코트는 각 60mm 플라즈마는 0.05 % 젤리 2 ML과 문화 요리를 취급.
- 처리 MEFs의 약병과 ~ 20,000 세포 / cm 2에 판을 해동.
- 세포가 밤새 준수 할 수 있도록 허용합니다.
2. MEFs로 공동 심는 hESCS
- 새로운 식민지는 다음과 같이 새로운 MEF-코팅 요리에 cryopreserved 문화 나 passaging 현재 문화에서 시작 될 수 있습니다.
- 예열 1X PBS의 3 ML로 1 회를 passaged 할 큰 hESC의 식민지가 들어있는 판을 씻으십시오.
- Collagenase IV / PBS 용액 (1 MG / ML) 3 ML을 추가하고 37 5-10 분 동안 품다 ° C. (참고 : 세포가 뚜렷한이나 공 등의 트립신으로 본이되지 않습니다.)
- 세포는 아직있는 동안collagenase, 5 ML의 pipet 팁의 가장자리를 사용하여, 작은 세포 clumps으로을 깨고, 식민지에 그리드 패턴을 만들 수 있습니다.
- 표면의 모든 셀을 dislodging, 문화 판의 바닥을 긁어 pipet 팁 (문화 판에 수직 방식에서 개최)의 끝을 사용합니다.
- 5 분을위한 (1000 RPM)에서 매 관과 스핀으로 세포를 수집합니다.
- 원심 분리 후, 매 튜브에 세포 펠렛을두고 매체를 대기음.
- 전에 MEFs 도금 날부터 MEF 매체를 대기음.
- 재 판 원본 판에서 1시 3분 비율 셀 및 hESC 매체의 3 ML과 피드
3. 공동 문화에서 MEFs를 없애고
참고 : 인간 ESC 문화는 일반적으로 문화 10 14 일 사이에 고밀도에 있어야합니다.
- 접시의 가장자리에서 aspirating pipet의 팁을 놓고 흡입은 부드럽게 MEF 시트의 가장자리를 당겨 할 수 있습니다.
- R요리에서 미디어를 emove, 그리고 끝이 세포 시트를 잡아 천천히 접시 위의 arced 방식으로 끝을 이동 할 수 있습니다. 참고 : 시트 pipet의 끝에서 방해 할 수 있지만 수동으로 문화 판의 표면에서 시트를 당기는 사용자를 방지하지 말아야으로이 문제가되지 않습니다. 세포 흡인기의 끝에 붙어있는 경우에는 전체 열망에 대한 세포 시트를 깨 배양 접시의 상단을 사용할 수 있습니다.
- 즉시 hESC 매체를 교체하고, 보육에 다시 판을 넣어.
4. 대표 결과
MEF 제거 프로세스의 최종 결과는 작은 방해받지 hESC의 pluripotency 업체 SSEA-4의 표현을 유지하면서 매우 큰 식민지 (그림 2)에 상당한 확장을 받아야 할 수 식민지 (그림 1D), 10 월 ¾, 그리고 Tra 1-81 (그림을 생산 3).
1 그림. ESC의 콜로니의 형태학 MEF 제거 이전과 이후. 문화 요리로 심는 후 A) 일 1 B) 2 일에서의 인간의 배아 줄기 세포 식민지. C) 고밀도 인간 배아 줄기 세포의 식민지 (H7)은 MEFs로 둘러싸여. 두 hESC의 식민지가 빨간색 대시에 설명되어 있습니다. D)이 설명 된 흡인 기술을 사용하여 MEF 제거 후, 우리는 그대로 식민지를 둘러싼 거의 MEFs과 격리 된 hESC의 식민지로 남아 있습니다.
그림 2. 10 일 MEF 제거 후 ESC의 콜로니 확장. 바로 MEF 고갈 후 원래 hESC의 식민지가 (왼쪽) 매우 큰 식민지 (오른쪽) appro으로 확장 할 수 있습니다10X ximately 800 μm. 원래 식민지가 복합 식민지와 같은 배율 (10 배)에 이미지로되어 있습니다.
그림 3. MEF-소모의 hESC의 식민지 Immunostaining. 식민지의 Immunofluorescent 식별가 MEF 고갈부터 10 일까지하는 것은 식민지가 10월 ¾, SSEA-4에 의해 분명 같은 pluripotency 마커의 표현, 그리고 Tra-1-81 착색을 유지 것으로 나타났습니다. 또한, 이러한 hESC의 식민지가 mesodermal 운명으로 차별화를 전시하지 Flk-1의 부재로 표시. A, E, I, 그리고 M) immunoflouscently 스테인드 식민지, 20, 10, 10, 2 배의 전송 빛 이미지이며, .. 각각 B, F, J, 그리고 N) 핵 표시 - 각각 immunofluorescently 스테인드 식민지, 20, 10, 10, 배, CD)의 DAPI 스테인드 셀의 표현을 보여인간의 줄기 세포 마커 만 SSEA-4, 및 복합 이미지, 20x. GH)은 인간의 줄기 세포 마커 10월의 표현을 보여 ¾ 만하고 복합 이미지, 10 배. KL)은 인간의 줄기 세포 마커의 표현 Tra 만 1-81 표시 , 그리고 복합 이미지, 10 배. MP) 마지막 행은 이미지가 확대, 배,이 식민지에서 볼 전형적인 부드러운 테두리를 설명해 식민지을 묘사 아닌 경우 명시 적 O) Flk-1, 중배엽 차별화의 초기 마커 않으며, 그랬지 DDR2 착색의 부재에 의해 표시된대로 그들은 P)은 섬유 아세포가 포함되어 있습니다.
보충 비디오. 시트 흡인에 의해 섬유 아세포를 삭제를. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
이 논문에 제시된 방법은 인간 배아 세포 문화에서 섬유 아세포 피더 세포를 제거에 신속하고 적은 비용이 많이 드는 대안을 제공합니다. 섬유 아세포의 성공적인 제거 더 이상 줄기 세포 문화에 개발이 세포의 단단히 합류 monolayer의 존재에 따라 달라집니다. 7~10일 후, 성장 hESC의 식민지는 식민지 사이에 점점 더 조밀 한 섬유 아세포 monolayer를 생성, 바깥 방향으로 피더 섬유 아세포를 밀어 것입니다. 섬유 아세포 monolayer에서 강력한 휴대 전화 첨부 파일은 셀 시트 등의 빠른 제거를 할 수 있습니다. 그것은이 정화 기술은 이전 루틴을 확장 문화 활용 만이 아니라 실험에 hESC에서 MEF 제거의 방법으로 사용하기 위해 추천되는주의 깊게 주목해야한다.
그것은 품질이 낮은 줄기 세포 식민지를 구출이 정화 기술을 활용하는 것도 가능합니다. 고품질의 hESC의 식민지 disti을 전시한다자신과 피더 세포 사이의 경계를 nct. 그러나, 줄기 세포 식민지는이 방법도 MEF 세포 시트와 함께 부분적으로 차별화 된 hESC의 식민지를 제거하는 데 사용할 수 있습니다 덜 잘 정의 된 식민지 테두리,와 hESC의 식민지하지만, 물리적 분리를 전시, 부분적인 차별화를받은 경우 pipet 팁은 원치 않는 차별화 된 셀 또는 MEF과의 hESC 연결을 분리 할 필요가 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 재생 의료의 캘리포니아 연구소 (RN2 - 00921-1) 및 NIH 투자 국가 연구 상 (F32-HL104924)에서 새로운 교수 상 II가 추진하는 사업
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DDR2 | Santa Curz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
| Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC. | |||
References
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