Summary
Apesar dos esforços em curso para as culturas de transição para a alimentação livres de condições, a derivação ea cultura de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) permanecem em grande parte dependente de co-culturas com alimentadores embrionárias (MEFs). Aqui, mostramos uma nova metodologia para a rápida remoção de alimentadores de culturas CTEh antes da experimentação.
Abstract
Fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) foram utilizados para estabelecer células-tronco embrionárias (hESCs) culturas após blastocisto isolamento 1. Este sistema de alimentação mantém hESCs de sofrer diferenciação espontânea durante a expansão de células. No entanto, este método de co-cultura é um trabalho intensivo, requer pessoal altamente treinado, e os rendimentos a pureza hESC baixo 4. Muitos laboratórios têm tentado minimizar o número de células de alimentação em culturas CTEh (isto é, a incorporação da matriz revestidos pratos ou outros tipos de células alimentadoras 5-8). Estes sistemas de cultura modificados têm mostrado alguma promessa, mas não suplantou o método padrão para hESCs cultura com mitomicina C tratados com fibroblastos de rato embyronic a fim de retardar a diferenciação espontânea indesejada das culturas CTEh. Portanto, as células de alimentação utilizados na expansão hESC deve ser removido durante as experiências de diferenciação. Embora várias técnicas disponíveis para a purificação do co hESClonies (FACS, Macs, ou o uso de vetores resistentes aos medicamentos) de alimentadores, estas técnicas são de trabalho intensivo, caro e / ou destruidores para o hESC. O objetivo deste projeto foi o de inventar um método de purificação que permite a colheita de uma população mais pura de hESCs. Temos observado que em uma cultura confluente hESC, a população MEF pode ser removido usando uma aspiração simples e rápida da folha de MEF. Esta remoção é dependente de vários factores, incluindo a ligação de célula-a-célula lateral MEFs que tem uma menor afinidade de ligação para o prato de cultura de estireno, e a capacidade de as colónias de células-tronco para empurrar para fora os fibroblastos durante a geração do seu próprio " nicho ". O hESC foram então examinadas para SSEA-4, Oct3 / 4 e expressão Tra 1-81 até 10 dias após a remoção do MEF para assegurar a manutenção da pluripotência. Além disso, as colônias CTEh foram capazes de continuar crescendo de em formações maiores após a remoção do MEF, proporcionando um nível adicional de expansão hESC.
Protocol
1. Preparação de Alimentadores embrionárias de rato
- O MEFs utilizado na co-cultura de hESCs devem ser previamente tratadas por irradiação ou mitomicina C para inibir as células de sofrer divisão.
- Duas horas antes da semeadura MEF, revestimento de plasma 60 milímetros cada prato de cultura tratada com 2 ml de 0,05% de gelatina.
- Descongelar um frasco de MEFs tratada e da placa de ~ 20.000 células / cm 2.
- Permitir que as células a aderir durante a noite.
2. Co-semeadura hESCs em MEFs
- Novas colônias pode ser iniciada a partir de culturas criopreservados ou passagens em culturas atuais para novos MEF-revestidos pratos, como abaixo.
- Lave a placa contendo as colónias grandes CTEh a ser passadas uma vez com 3 mL de PBS 1x aquecido.
- Adicionar 3 ml de colagenase IV / solução de PBS (1 mg / ml) e incubar durante 5-10 min a 37 ° C. (Nota: As células não ficará visível ou bola para cima, como visto com tripsina).
- Enquanto que as células estão ainda nacolagenase, utilizar uma ponta de uma pipeta de 5 ml, crie um padrão de grade sobre as colónias, quebrando-as em pedaços de pequenas células.
- Usar o fim da ponta de pipeta (realizada de uma forma perpendicular à placa de cultura) para raspar o fundo da placa de cultura, deslocando todas as células da superfície.
- Recolher as células para um tubo Falcon e em rotação (1000 rpm) durante 5 min.
- Após a centrifugação, aspirar o meio, deixando o sedimento de células no tubo de Falcon.
- Aspirar o meio do dia MEF MEFs do folheado antes.
- Re-placa das células a uma razão de 1:3 a partir da placa original, e alimentos com 3 ml de meio de hESC
3. Esgotando MEFs da co-cultura
Nota: As culturas humanas CES devem estar em alta densidade, normalmente entre 10 e 14 dias de cultura.
- Colocar a ponta de uma pipeta de aspiração na extremidade da placa e permitir que a sucção puxe para cima da borda da folha de MEF.
- Remove a mídia do prato, e permita que a ponta para pegar a folha de celular e mova lentamente a ponta de forma arqueada acima da placa. Nota: A folha pode entupir a ponta da pipeta, mas isto não é problemática, uma vez que não deve impedir que o utilizador manualmente puxando a folha a partir da superfície da placa de cultura. Se as células são presos à extremidade do aspirador, é possível utilizar a parte superior do prato de cultura para quebrar a camada de células por aspiração completa.
- Substitua meio hESC imediatamente, e colocar a placa de volta para a incubadora.
4. Resultados representativos
O resultado final do processo de remoção MEF produz pequenas colónias CTEh não perturbadas (Figura 1D), capazes de sofrer uma expansão significativa em colónias grandes (Figura 2), mantendo a expressão de fabricantes de pluripotência SSEA-4, Out ¾ e Tra 1-81 (Figura 3).
Figura 1. CES morfologia da colônia antes e após remoção MEF. Humanos Colônias células-tronco embrionárias em um dia) 1 e B) dias após a semeadura em duas placas de cultura. C) de Alta Densidade Humanos Colônias células-tronco embrionárias (H7) cercado por MEFs. As duas colônias CTEh estão descritos no traços vermelhos. D) Após a remoção MEF usando a técnica de aspiração descrito, ficamos com uma colônia isolada com hESC MEFs muito poucos em torno da colônia intacta.
Figura 2. CES Expansão Colônia 10 dias após a remoção MEF. HESC A colônia original imediatamente após a depleção MEF (à esquerda) é permitido a expansão em uma colônia muito grande (direita) adeximately 800 pm, 10x. Note-se que a colónia original, é criada uma imagem com a mesma ampliação (10x) quanto à colónia composto.
Figura 3. A imunocoloração de colónias MEF com depleção CTEh. Imunofluorescente identificação de colónias de até 10 dias após a depleção MEF mostra que as colónias manter a sua expressão de marcadores de pluripotência, como é evidente pelos outubro ¾, SSEA-4, e-Tra 1-81 coloração. Além disso, estas colónias CTEh não apresentam diferenciação para um destino mesodérmica, indicado pela ausência de Flk-1. A, E, I e M) são imagens de transmissão de luz das colónias coradas immunoflouscently, 20, 10, 10 e 2x, . respectivamente B, F, J e N) mostram os núcleos -. células DAPI corados das colónias coradas imunofluorescência, 20, 10, 10 e 2x, respectivamente CD) mostram a expressão demarcador de células estaminais humanas SSEA-4 apenas, e imagem composta, 20x. GH) mostram a expressão de células estaminais humanas marcador outubro ¾ só, e imagem composta, KL 10x.) mostram a expressão do marcador de células estaminais humanas Tra 1-81 só e imagem composta, 10x. MP) A última linha se imagens retratam uma colônia retratar as fronteiras típicas suaves visto com este aumento, 2x, e essas colônias não expressa O) Flk-1, um marcador precoce de diferenciação mesoderme, nem eles P) contém fibroblastos como mostrado pela ausência de coloração DDR2.
Vídeo suplementar. Remoção fibroblastos por aspiração Folha. Clique aqui para ver filme .
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Discussion
O método apresentado neste manuscrito oferece uma alternativa rápida e menos onerosa para eliminar células alimentadoras de fibroblastos humanos de culturas de células embrionárias. A eliminação bem sucedida de fibroblastos é dependente da existência de uma monocamada confluente de firmemente estas células que se desenvolvem em culturas de células estaminais mais longos. Depois de 7-10 dias, as colónias que crescem CTEh vai empurrar os fibroblastos de alimentação numa direcção para fora, gerando uma monocamada de fibroblastos cada vez mais densa entre colónias. As fortes célula-a-célula anexos em monocamada de fibroblastos a permitir a sua rápida remoção como uma camada de células. Deve ser cuidadosamente notado que esta técnica de purificação é sugerido para uso como um método de remoção de MEF hESC antes da experimentação somente, e não utilizado para a cultura de rotina de expansão.
Também é possível utilizar esta técnica de purificação para resgatar má qualidade colónias de células-tronco. Uma colônia hESC alta qualidade deve apresentar distiNCT fronteiras entre si e as células alimentadoras. Se, no entanto, as colónias de células-tronco sofreram diferenciação parcial, exibindo menos fronteiras bem definidas de colónias, em seguida, este método pode também ser utilizado para remover as colónias CTEh parcialmente diferenciadas, juntamente com a camada de células MEF, no entanto a separação física de colónias com CTEh uma ponta de pipeta pode ser necessário separar quaisquer ligações CTEh com as células indesejadas diferenciados ou de MEF.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma Nova Faculdade Prêmio II do California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1), e um NIH-financiado Prêmio Nacional de Pesquisa (F32-HL104924)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DDR2 | Santa Curz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
| Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC. | |||
References
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