Le façonnage d'une bicouche Hydrogel de contrôler la différenciation ASC

Summary

Ce protocole met l'accent sur l'utilisation de la capacité inhérente de cellules souches de prendre exemple sur leur matrice extracellulaire environnante et être amené à se différencier en de multiples phénotypes. Ce manuscrit méthodes étend notre description et la caractérisation d'un modèle utilisant un hydrogel bicouche, composé de PEG-fibrine et le collagène, à la fois co-différencier les cellules souches adipeuses

Abstract

Les polymères naturels au fil des ans ont acquis plus d'importance en raison de leur biocompatibilité hôte et sa capacité à interagir avec les cellules in vitro et in vivo. Un domaine de recherche prometteur dans la médecine régénérative est l'utilisation combinatoire de nouveaux biomatériaux et des cellules souches. Une stratégie fondamentale dans le domaine de l'ingénierie tissulaire est l'utilisation de échafaudage tridimensionnel (par exemple, décellularisée matrice extracellulaire, les hydrogels, les micro / nano particules) pour diriger la fonction des cellules. Cette technologie a évolué à partir de la découverte que les cellules ont besoin d'un substrat sur ​​lequel ils peuvent adhérer, prolifèrent, et d'exprimer leur phénotype différencié et la fonction cellulaires ^2-3. Plus récemment, il a également été déterminé que les cellules non seulement utiliser ces substrats pour l'adhésion, mais aussi d'interagir et de prendre des repères à partir du substrat de matrice (par exemple, la matrice extracellulaire, ECM) ^4. Par conséquent, les cellules et les échafaudages ont une connexion réciproque quesert à contrôler le développement des tissus, l'organisation, et la fonction ultime. Les cellules souches adipeuses (CSA) sont mésenchymateuse, les cellules souches hématopoïétiques non-présents dans le tissu adipeux qui peut présenter de lignées multiples différenciation et servir comme une source facilement accessible de cellules (c.-à-pré-vasculaire endothélium et péricytes). Notre hypothèse est que les cellules souches adipeuses peuvent être dirigés vers différents phénotypes simultanément par simple co-culture entre eux dans des matrices bicouches ^1. Notre laboratoire se concentre sur la cicatrisation cutanée. À cette fin, nous avons créé une matrice composite unique à partir des biomatériaux naturels, de la fibrine, de collagène, de chitosan et qui peuvent imiter les caractéristiques et les fonctions d'un cutanée spécifique cicatrisation ECM environnement.

Protocol

1. Isoler des cellules souches adipeuses (CSA) ^{1, 5}

Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Isoler adipeux périrénal chez le rat et de l'épididyme et laver avec une solution stérile de Hank saline tamponnée (HBSS) contenant 1% de sérum de veau fœtal (FBS) de ⁵ précédemment décrit. Cette étude a été menée en conformité avec la Loi sur la protection des animaux, les règlements d'application de protection des animaux et en conformité avec les principes du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
2. Émincer le tissu et le transfert 1-2 g dans 25 ml de HBSS contenant 1% de FBS dans un tube de 50 ml et centrifuger à 500 g pendant 8 min à température ambiante.
3. Recueillir la couche flottante du tissu adipeux et le transfert à 125 ml erlenmeyer et traiter avec 25 ml de collagénase de type II (200 U / ml) dans du HBSS pendant 45 min à 37 ° C sur un agitateur orbital (125 rpm). Retirer soigneusement la fraction liquide (ci-dessous d'huile et de la couche adipeux) par un pipetage et filtrer séquentiellement à travers une 100 - filtre de nylon de maille um - um et 70. Centrifuger le filtrat à 500 g pendant 10 min à température ambiante, aspirer le surnageant, et laver le culot deux fois avec 25 ml de HBSS.
4. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 50 ml de milieu de croissance (MesenPRO RS moyen basal) supplémenté avec supplément MesenPRO croissance RS, antibiotiques antimycosiques (100 U / ml de pénicilline G, 100 ug / ml de sulfate de streptomycine, et 0,25 pg / ml d'amphotéricine B), et 2 mM de L-glutamine et les cellules de pipette en deux flacons T75 (25 ml / flacon).
5. Culture de l'ASC dans un 5% de CO _2-incubateur humidifié à 37 ° C (passage 2-4 ASC sont utilisés pour toutes les expériences).

2. Préparation Chitosan microsphères (MSC)

Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.

5. Émulsionner une solution aqueuse de chitosane (6 ml de 3% p / v chitosane dans 0,5 M d'acide acétique) dans une 100 mL de mélange une phase huileuse comprenant de l'huile de soja, le n-octanol (1:2 en volume / volume) et 5 % de sorbitan mono-oléate (travée 80) émulsifiant, en utilisant de tête (1700 tpm) et agitation magnétique (1000 tpm) simultanément dans des directions opposées. Cette double méthode de mélange assure que les micelles formées très tôt, avant la réticulation se produit peut rester en solution et ne pas se déposent au fond. En outre, l'agitation magnétique bar aides en de-agrégation chitosane lors de la formation de micelles et rigidification.
1. Le mélange-malaxage en continu sous agitation pendant environ 1 heure jusqu'à ce qu'une stable eau-dans-huile est obtenue. Engager transversale ionique se raccordant à l'addition de 1,5 ml à 1% p / v d'hydroxyde de potassium dans du n-octanol toutes les 15 minutes pendant 4 h (24 totale ml)
2. Sécher les sphères récupérés dans un dessiccateur à vide et d'analyser sans autre traitement. On peut déterminer la taille moyenne des particules CSM, surface par milligramme, et l'unité de volume cubique à l'aide d'un analyseur de taille de particule.
3. Pour les expériences ultérieures, se laver les trois CSM fois avec de l'eau stérile pour éliminer les sels résiduels et stériliser par un lavage pendant la nuit avec 5 ml d'éthanol absolu.

3. Déterminationle nombre de groupes amino libres dans MSC

Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Déterminer le nombre de groupes amino libres présents dans MSC après transversale reliant ionique en utilisant le benzène trinitro (TNBS) dosage acide de Bubnis et Ofner ^6. Incuber 5 mg de microsphères avec 1 ml de solution TNBS 0,5% dans un tube de verre de 50 ml pendant 4 h à 40 ° C et hydrolyser avec l'ajout de 3 ml de HCl 6N à 60 ° C pendant 2 h.
2. Refroidir les échantillons à température ambiante et d'extraire les TNBS libres en ajoutant 5 ml d'eau déminéralisée et 10 ml d'éther éthylique.
3. Chauffer une partie aliquote de 5 ml de la phase aqueuse à 40 ° C dans un bain-marie pendant 15 min à s'évaporer toute l'éther résiduel, refroidir à température ambiante, et diluer avec 15 ml d'eau.
4. Mesurer l'absorbance à 345 nm avec un spectrophotomètre en utilisant une solution TNBS sans chitosane en tant que vide et le chitosane utilisé pour CSM pla réparation pour déterminer le nombre total de groupes amino. Estimer le nombre de groupes amino libres du CSM par rapport au chitosane.

4. Chargement en ASC CSM

Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Equilibrer 5 mg de MSC stérilisés de l'article 2.5 dans HBSS stériles nuit et ajouter à un 8 - um taille des pores de membrane plaque d'insertion de la culture (24-puits).
2. Après les MSC sont installés sur la membrane, aspirer le soin HBSS et ajouter 300 pl de milieu de croissance à l'intérieur de l'insert et 700 pl de milieu de croissance à l'extérieur de l'insert.
3. CSA Resuspendre à la concentration appropriée (1 × 10 ⁴ à 4 × 10 ⁴⁾ dans 200 pi de milieu de croissance et de semences au cours de la CSM intérieur de l'insert plaque de culture. Le volume final du milieu au sein de l'insert de culture, après le semis, est de 500 pi.
4. Incubmangé la tête de série ASC sur MSC pendant 24 h dans un 5% de CO ₂ incubateur humidifié à 37 ° C.

5. Déterminer le pourcentage de chargement ASC et la viabilité cellulaire dans MSC

Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Après incubation, le CSM pipette ASC-chargée dans un microtube de 1,5 ml stérile sans perturber les cellules qui ont migré dans la membrane d'insertion.
2. Retirez le milieu résiduel et ajouter 250 ul de milieu de croissance frais dans le tube.
3. Pour chaque tube, ajouter 25 ul de MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium] solution (5 mg / ml) et incuber pendant 4 h dans un 5% de CO ₂ humidifié incubateur à 37 ° C.
4. Après incubation, éliminer le milieu, ajouter 250 ul de diméthylsulfoxyde, et le vortex le mélange pendant 2-5 min pour solubiliser le complexe de formazan.
5. Centrifuger le CSM à 2700 gpendant 5 min, pipette le surnageant et déterminer sa longueur d'onde d'absorbance à 570 nm et 630 nm en utilisant un lecteur de plaque standard, selon les spécifications du fabricant de MTT.
6. Déterminer le nombre de cellules associée avec les MSC par rapport aux valeurs obtenues à partir des numéros de NCP définis cultivées à développer une courbe standard.

6. Préparation et caractérisation d'ASC-CSM intégré dans le PEG-fibrine Gels

Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Polyéthylène glycol (PEG) de fibrine (PEG-fibrine) hydrogel préparé par Suggs et al ⁷ en dissolvant le glycol polyéthylène modifié glutarate succinimidyle (PEG; 3400 Da). Utilisant 4 ml d'une solution saline tamponnée de tris (SCT, pH 7,8) et le filtre stériliser avec un filtre de 0,22 um juste avant de commencer l'expérience. PEG dissous n'est efficace que dans la présente demande pour les 3-4 premières heures.
2. Mélanger 500 μ l de bouillon de fibrinogène (40 mg / ml dans du TBS, pH 7,8) et 250μl de stock PEG dans une culture puits d'une plaque à 6 puits et incuber pendant 20 minutes dans un 5% de CO ₂ incubateur humidifié à 37 ° C. Ce mélange constitue un rapport de concentration molaire de 1:10, SG-PEG-SG: le fibrinogène.
3. Prélever 250 ul de ASC-CSM à une concentration de 5 mg de CSM, (≈ 2 × 10 ⁴ cellules) et mélanger avec la solution de fibrinogène pégylé.
4. Immédiatement ajouter 1 ml de thrombine stock (25U/mL) et rapidement triturer une ou deux fois avec la pipette. Après mélange avec de la thrombine de la PEG-fibrinogène, immédiatement placer le mélange de cellules-gel dans une plaque à 12 puits, et incubées dans un 5% de CO ₂ incubateur humidifié à 37 ° C pendant 10 min pour permettre la gélification complète. Depuis le temps de gélification est rapide, ne pas essayer de retenir la solution du gel dans la pipette pendant plus de 5 secondes. Le fibrinogène pégylé est clivée par la thrombine et forme un hydrogel de fibrine pégylé. En tant que tel, eproduit e gel final est dénommé PEG-fibrine.
5. Laver les gels de PEG-fibrine à deux reprises avec HBSS et incuber avec des alpha minimales médias essentiels (α-MEM) supplémenté avec 10% de FBS dans un 5% de CO ₂ incubateur humidifié à 37 ° C.
6. Observer la migration des cellules de CSM dans le gel sur une période de 11 jours en utilisant des techniques de microscopie optique.

7. Préparation et caractérisation d'ASC-CSM embarqué dans des gels de collagène

Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Mélange ASC-CSM (5 mg contenant ≈ 2 × 10 ⁴ cellules) avec collagène de type 1 (7,5 mg / ml) extrait de tendons de queue de rat selon la méthode de Bornstein ⁸ et la fibrillation, après ajustement du pH à 6,8 à l'aide de NaOH 2N.
2. Ajouter la fibrille collagène-ASC-CSM mélange sur une plaque de 12 puits et incuber pendant 30 min dans un 5% de CO ₂ humidificateurFIED incubateur à 37 ° C.
3. Après la fibrillation complète, incuber les gels de collagène-ASC-CSM pour un maximum de 11 jours dans un 5% de CO ₂ incubateur humidifié à 37 ° C.
4. Observer la migration des cellules de CSM dans le gel sur une période de 11 jours en utilisant des techniques de microscopie standard.

8. Développement de bicouches PEG-fibrine-(ASC-CSM) Constructions Gel-collagène

Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Pour développer la bicouche construire, préparer à la fois le collagène et les gels de PEG-fibrine comme décrit ci-dessus, avec de légères modifications. En bref, pour étudier les propriétés migratoires et de co-induction d'une source unique de cellules souches en utilisant deux biomatériaux, "sandwich" de l'ASC-MSC entre le collagène et les échafaudages PEG-fibrine en utilisant un processus en quatre étapes: Charge 1) ASC sur CSM, 2) jette un gel de collagène fibrillaire et la couche des perles ASC-CSM sur le collagen gel, 3) la distribution de PEG-fibrine gel sur le gel ASC-CSM-collagène et de permettre gel de se solidifier, et 4) ajouter du milieu de bien et insérer pour étudier les cellules in vitro ou de supprimer à partir d'insertion pour des applications in vivo (voir la figure 1 ).
2. Préparer un type 1-1 mL de collagène (7,5 mg / ml) du mélange tel que décrit ci-dessus en 7.1, sans ajouter ASC-CSM pour le mélange. Placer le mélange dans un insert de 6 puits de culture de tissu (la taille des pores 8-m) et incuber pendant 30 min dans un 5% de CO ₂ incubateur humidifié à 37 ° C.
3. Après la fibrillation, couche complète sur toute la surface du collagène de 5 mg de ASC-CSM (10, 000 cellules / mg) en suspension dans les milieux de culture (200 pi). Après les microsphères sont installés sur le gel, la préparation du gel de PEG-fibrine tel que décrit dans la section 6,0, sans ajouter ASC-CSM au mélange, et la couche la pégylé fibrinogène / solution de thrombine sur les couches ASC-CSM-collagène. Lors de la préparation du gel de PEG-fibrine, utiliser 250 ul de milieu de culture cellulaire à la place de til 250 pi de milieu contenant les cellules.
4. Une fois terminé, incuber les constructions pendant 30 min dans un 5% de CO ₂ incubateur humidifié pour atteindre la gélification complète avant d'alimenter la construction de milieu de culture.
5. Après gélification complète, le lieu de 1 mL de milieu dans la chambre supérieure au cours de la construction et 3 ml de milieu dans la chambre inférieure.

9. Faire Solutions mères

Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.

• Stock de chlorure de calcium (40 mM): Utilisez uniquement CaCl ₂ .2 H ₂ O. Dissoudre 588,4 mg de CaCl ₂ .2 H ₂ O par 100 ml d'eau désionisée. Stériliser l'aide d'un filtre de 0,22 um.
• Le polyéthylène glycol: PEG est très réactif avec l'oxygène et peut s'oxyder lorsqu'elle est exposée à l'air ambiant. En tant que tel, le PEG doit être stocké sous azote (N ₂₎ l'atmosphère. Accurately peser 32 mg dans un tube à centrifuger de 2 ml (assurez-vous de purger les tubes avec de la N ₂ avant utilisation) et les conserver à -80 ° C jusqu'à ce que prêt à l'emploi. Dissoudre 32 mg de PEG dans 4 mL de solution de TBS avant utilisation.
  Les solutions suivantes doivent être faites avant chaque nouvelle expérience.
  
• SCT solution: (pH de 7,75 à 7,77 à 25 ° C; pH à 25 ° C est très critique). Pour préparer 15 ml de solution de TBS, soigneusement dissoudre un comprimé tampon dans stérilisée par filtration de l'eau déminéralisée et d'ajuster au pH requis. Ne pas entreposer le stock solution de préparer sa fraîcheur à chaque fois.
• Solution de fibrinogène: (40 mg / ml). Dissoudre la poudre dans du TBS fibrinogène pour rendre la concentration de fibrinogène de 40 mg / ml. Dissolvez la nuit à l'aide d'un agitateur magnétique à 4 ° C. Il est facile à dissoudre l'ensemble 1-g quantité avec la quantité requise de SCT. Le lendemain, retirez le fibrinogène à partir de 4 ° C (généralement nuageux) et lui permettreà chauffer dans un bain d'eau jusqu'à ce qu'une solution homogène soit obtenu. Enfin, stériliser par filtration du fibrinogène en utilisant un filtre de 0,45 um.
• Solution de thrombine (25 unités / ml): Pour faire la solution de thrombine, pesez la quantité requise et dissoudre avec le prêt de 40 mM CaCl ₂ .2 H ₂ O. C'est toujours une bonne pratique d'utiliser le flacon entier de la thrombine pour faire du stock. Exemple: Dissoudre une bouteille de 5 kU thrombine avec 200 mM de CaCl ₂ .2 H ₂ O, partie aliquote et conserver à -20 ° C.

10. Les résultats représentatifs

L'objectif global de la technique présentée ici est de démontrer le potentiel de la matrice simultanée axée sur la différenciation des ASC en phénotypes multiples en utilisant CSM comme un véhicule de livraison. Nous démontrons une stratégie in vitro pour produire des cellules souches à partir de MSC dans une bicouche collagène-PEG-fibrine échafaud. Caractérisation de l'ASC intégré au sein de cette reveale échafaudaged qu'ASC chargées MSC peut être "sandwich" entre une couche de collagène et de PEG-fibrine simultanément et de manière différentielle se repère à partir des deux environnements extracellulaires de se développer dans leurs conditions de nouvelles. Nous avons d'abord caractérisé la capacité pour le système modèle pour maintenir la viabilité des cellules et des capacités migratoires. Collagène soutenu la capacité des ASC de maintenir leur "caractère souche", comme l'a démontré par leur expression de Stro-1 et de leur morphologie fibroblastique (figure 2D et 2F). En revanche, le PEG-fibrine induit les ASC de différencier vers un phénotype vasculaire, comme cela est démontré par leur morphologie structure de type tube, leur spécifique des cellules endotheliales expression de facteur von Willebrand (figure 2E et 2G), et des péricytes-expression spécifique de NG2 et platelet-derived growth factor beta du récepteur (PDGFRβ) (données non présentées). En outre, ces phénotypes observés semblaient se produire au début de la culture et ont été maintenues pendant 11 jours, comme c'est demonstrated dans la figure 3.

Tableaux et figures

Avantages de la bicouche Construire:

• Le seul échafaud sans cellules peuvent fonctionner comme un échafaudage bioactif.
• PEG-fibrine peut induire les cellules souches à se différencier sans addition de facteurs de croissance.
• Le collagène peut aider à maintenir le phénotype de cellules souches de la CSA.
• Produit d'assemblage bicouche peut être utilisé comme un substrat actif pour d'autres types de cellules de migrer et proliférer (par exemple, des cellules endothéliales, des fibroblastes, des kératinocytes, des cellules musculaires lisses, des péricytes).
• Il peut être utilisé avec des échafaudages d'ingénierie des tissus durs comme l'os hydroxyapatite ou déminéralisée pour régénérer les tissus durs et mous.
• Il peut être utilisé pour développer un multi-couches, diversifiée par génie tissulaire construction (comme dermo-vasculaire, vasculaire-épithéliale, dermo-vasculaire-hypodermique, etc.)
• Il utilise une seule source de cellules de développer simultanémentcompartiments multicellulaires.
• Il a le potentiel d'intégration avec le tissu hôte, car il est d'origine naturelle.
• CSM dans la construction fournit une plate-forme de gel pour les cellules à migrer à partir.
• Chitosan, utilisé pour préparer le mat, est un bien-actif connu chimio-attractif.
• Le concept global appliqué dans ce protocole de «matrice axée sur la différenciation des cellules souches" peut être appliqué à d'autres types de cellules souches. Toutefois, une enquête plus approfondie est nécessaire pour déterminer la faisabilité de la matrice axée sur la différenciation. La bicouche gel échafaudage peut agir comme un réservoir de livrer les cellules d'une manière prolongée et contrôlée.
• Après la reconstruction, les gels peuvent encore être séparés en composants individuels.

Figure 1. Schéma illustrant l'objectif global et le processus de la technique. 1) Les cellules souches adipeuses (CSA) sont loajouté sur le chitosane microsphères. 2) Le collagène est ensuite versé dans un insert de 6 puits, le pH ajusté à la fibrillation collagène, et l'insert placé dans une chambre plaque à 6 puits. Les sphères CSM ASC-chargés sont ensuite superposées sur le collagène. 3) Le fibrinogène pégylé est ensuite versé sur le collagène (ASC-CSM) et gélifié par l'addition de thrombine. 4) La construction bicouche final peut ensuite être retiré de l'insert de la culture et utilisé pour in vitro ou in vivo l'analyse.

Caractérisation Figure 2. De l'ASC cultivés dans du collagène et de PEG-fibrine matrices 3D. A) en contraste de phase photomicrographie d'isolé ASC passages et maintenu en utilisant la routine en 2 dimensions techniques de culture cellulaire. Photomicrographies B, D, et F représentent ASC-CSM cultivées dans un gel de collagène en 3 dimensions, tandis que C, E, G et spectacle ASC-CSM cultivées dans un 3-dimensions PEG-fibrine gel, à la fois au jour 12. En B et C), les CSA sont présentés migration loin de la sphère CSM dans les deux types d'échafaudage. CSA semble avoir une aplatie, la broche en forme de morphologie en collagène (B), tout en maintenant leur expression du marqueur de cellules souches Stro-1 (D; flèche). Lorsqu'elle est cultivée dans le PEG-fibrine CSA présentent plus de structures tubulaires et sont amenés à exprimer ces marqueurs cellulaires vasculaires comme facteur de von Willebrand (E). Microscopie électronique à transmission montre que la morphologie typique démontré par CSA au sein de chaque échafaud. CSA dans un gel de collagène semble avoir moins filopodes (fl) s'étendant depuis le corps de la cellule (F), tandis que les CSA typiquement formé luminales (marquée L) des structures (G; flèche).

Figure 3. L'analyse morphologique des ASC-MSC entre bicouches de collagène et de PEG-fibrine gels. ASC-MSC ont été «pris en sandwich" entre le collagène et le PEG-fibrine gels et maintenues en culture pendant 11 jours. La gauche Column représente CSA migration et la prolifération au sein de la matrice de collagène et semblent prendre une morphologie semblable à la broche. La colonne de droite représente les CSA migrateurs à l'écart des MSC et formant tube de structures semblables à travers le gel de PEG-fibrine.

Discussion

ASC sont bien connus pour leur facilité d'isolement et de capacité à se différencier vers différents types cellulaires. Avec les techniques décrites dans ce manuscrit, nous sommes en mesure d'exploiter la plasticité des CSA en exposant ces cellules à biomatrices multiples simultanément. Comme les cellules migrent loin de leur base CSM et entrer dans leur environnement extracellulaire, les cellules prennent exemple sur l'échafaud, et peut soit maintenir "caractère souche" (collagène) ou être induites à se différencier vers des types de cellules vasculaires et vasculaires-soutien-(fibrine). Depuis notre laboratoire s'intéresse à la peau et des tissus mous la cicatrisation des plaies, nous stratégique mis en œuvre une bicouche de collagène et de fibrine depuis collagène soutient la régénération dermique et épidermique par l'hôte, tandis que la fibrine induit naturellement la formation de réseaux vasculaires ^9. En outre, il est désormais entendu que la diaphonie se produit entre la prolifération des kératinocytes de la peau, des fibroblastes, et le réseau vasculaire sous-jacente, et ce complexemécanisme est très critique pour la cicatrisation proprement dit ^10. Sans un réseau vasculaire sous-jacente, des greffes de peau de l'ingénierie tissulaire ont de la difficulté avec inosculating tissus de l'hôte. Par conséquent, notre hypothèse générale est que le collagène et la fibrine, lorsqu'il est utilisé comme une bicouche en combinaison avec les CSA, réduira les délais de cicatrisation en améliorant une ou plusieurs étapes de vaisseaux sanguins, par voie cutanée, et la ré-épithélialisation processus.

Fibrine est un biopolymère polyvalent formé après la thrombine de clivage du fibrinopeptide A provenant de fibrinogène monomère. La fibrine a été utilisé cliniquement comme agent hémostatique (approuvé par la US Food and Drug Administration) et comme un produit d'étanchéité dans une variété d'applications cliniques, y compris des procédures telles que la dissection des tissus mous. Hydrogels de fibrine à partir du fibrinogène allogénique commercialement purifié et de la thrombine ont été largement utilisés dans la dernière décennie dans une variété de l'ingénierie tissulaire applications. Cependant, certains inconvénients majeurs in l'aide d'un hydrogel de fibrine peut être 1) le potentiel pour l'échafaud à se rétrécir, 2) à faible rigidité mécanique, et 3) la dégradation rapide avant la formation appropriée des structures de l'ingénierie tissulaire. Pour surmonter ces problèmes, la fibrine doit être modifié avant son utilisation pour servir de mieux en trois dimensions de l'ingénierie tissulaire échafaud. Une telle approche est copolymérisation la fibrine avec du polyéthylène glycol (PEG-fibrine). Notre travail préliminaire a démontré plusieurs caractéristiques uniques de PEG-fibrine qui font qu'il est avantageux dans la cicatrisation des plaies plus pansements d'hydrogel d'autres, y compris la fibrine non modifiée. Pégylé-fibrine présente des caractéristiques uniques des deux hydrogels synthétiques et des matériaux naturels. Plus précisément, la présence de PEG fournit un très hydratée (> 90% d'eau) environnement humide pour la gestion des exsudats. Deuxièmement, la présence de fibrine confère biodégradabilité de la matière, mais, les résultats antérieurs montrent que la fibrine pégylé est beaucoup plus stable in vitro que la fibrine non pégylé

Le deuxième volet de notre bicouche est le collagène. Le collagène est une naturelle biomatériau exprimé de façon ubiquitaire chez les mammifères et sert un site directe de l'attachement pour divers types de cellules. Tissus différents exprimer différents types de collagène de type 1 (-type29), en fonction du type de nécessité fonctionnelle du tissu. Autres propriétés inhérentes de collagène qui le rendent très attrayant dans notre modèle sont que 1) il est non-inflammatoire, 2) les deux composantes entières et dégradées de collagène sont biocompatibles, 3) il est un hydrogel très poreux, 4), il soutient l'infiltration de cellules et la migration, 5), il maintient des cellules souches multipotence, 6) il est accordable par une formulation de modulation, et 7), il inosculates facilement avec le tissu hôte. Pour nos études dans la régénération de la peau et des tissus mous, un composite bicouche constitué de collagène est un choix naturel, puisqueil est fortement exprimé à travers la peau, y compris les régions profondes dermiques, et peut être utilisé comme marqueur immunohistochimie pour évaluer la profondeur d'une plaie.

Dans ce protocole, nous démontrons une technique permettant de maintenir simultanément "caractère souche" des CSA, tout en différenciant CSA vers divers types de cellules vasculaires. Pour l'étude de la peau et son tissu sous-jacent douce, le collagène et le PEG-fibrine sont directement applicables. Toutefois, d'autres matériaux peuvent être mis en œuvre bioscaffold d'étudier leurs capacités uniques explorées pour induire ASC dans d'autres types cellulaires. La technique mise en oeuvre ici permet de mettre en évidence l'importance de la matrice extracellulaire dans le contrôle de phénotypes de cellules souches et donne de la crédibilité à l'exploration de composites multicouches pour régénération de la peau.

Résumé

Étapes critiques

• Collagène devrait être ajusté à son pH isoélectrique correcte (pH 6,8-7.1) à induire une fibrillation et d'obtenir un gel stable structure.
• PEG doit être préparée fraîchement avant de mélanger avec une solution de fibrinogène depuis la durée de vie est courte aqueuse de PEG (4-5 heures).
• Le temps d'incubation du fibrinogène-PEG mélange ne doit pas dépasser 25 minutes (à 37 ° C) depuis plus de-incubation peut provoquer une précipitation trouble opaque pendant la gélification.
• Après addition de thrombine à la solution de fibrinogène pégylé, le mélange doit être dispensée aux inserts de culture immédiatement (après mélange doux avec une pipette). En tenant le mélange de solution dans l'embout de pipette pour un temps plus long (> 30 sec) peut provoquer la gélification dans la pointe de pipette et de la difficulté à obtenir des gels régulièrement versé.
• En utilisant des cellules de taille uniforme des microsphères et répartie uniformément sur le lit CSM est essentiel pour le chargement optimale des cellules. Variation de la taille CSM de diamètre influe directement sur la surface disponible pour la fixation des cellules par milligramme de microsphères, alors répartie uniformément ASC-CSM influe directement sur la migration des cellules en til échafaudages. La cellule chargée en microsphères (ASC-CSM) doit être réparti uniformément sur le dessus du gel de collagène afin d'assurer une migration des CSA au sein de l'échafaud. Si la distribution des ASC-MSC est trop dense, la migration des cellules obtiendrez concentré à un domaine particulier dans les gels et peut limiter l'interaction cellule-cellule de post-migration.
• Faire en sorte que le volume des supports ajouté au puits extérieur de l'insert de culture cellulaire est supérieure à la ménisque de l'intérieur ainsi. Typiquement, une intérieure: rapport de volume externe de 1:2 est approprié, ce qui facilite la fixation des cellules à l'microsphères.

Limites

• Cette méthode est limitée à la surface totale disponible sur les microsphères. Si un nombre supérieur de cellules est désiré, plus microsphères sont requis pour augmenter la surface.
• Étant donné que les cellules sont destinées à migrer à partir de microsphères, un décalage peut être observé pour la migration initiale de la cellule sur et dans les gels.
• Les microsphères sont dans l'interface de deux gels (collagène et de PEG-fibrine), ce qui peut limiter / prendre plus de temps pour la migration des cellules aux extrémités distales des gels.
• Pendant la construction de la bicouche, pégylé fibrinogène et la thrombine mélange doit être ajouté rapidement sur un lit CSM-ASC sur le dessus de collagène. Cela peut entraîner inégale redistribution des ASC-MSC. En cas de re-distribution inégale des ASC-MSC à l'interface lors de PEG-fibrine gel de coulée, la construction de gel peut être lentement agité manuellement rapidement redistribuer les microsphères avant la gélification complète.
• Cette méthode est limitée aux cellules qui ont des propriétés migratoires et ne peut être adapté pour fournir les types d'ancrage des cellules indépendantes.
• La solution de collagène avant la fibrillation reste à pH acide et limite le mélange direct de cellules dans des gels de collagène. En tant que tel, si ce n'est pas réglée dans un délai raisonnable (~ 30 min), la viabilité des cellules peut être compromise.
• Depuis le gels utilisés dans cette construction en couches sont individuellement, une interruption possible ou de séparation des gels peut se produire pendant le processus de traitement. Par conséquent, il peut limiter l'aise dans la manipulation au cours des études in vivo.

Modifications possibles

• ASC-MSC peuvent être distribués de manière homogène dans les gels individuels au lieu de superposer à l'interface entre eux.
• CSA peut être directement mélangé dans des gels individuels plutôt que de livrer par le CSM, mais cela peut limiter le développement de très organisés cellulaires motifs constructions de tissu.
• Pour éviter inégale redistribution des ASC-MSC au cours de PEG-fibrine coulée, l'ASC-MSC peut être suspendu dans un petit volume de solution aqueuse de chitosane (1% p / v) et répartis uniformément sur des gels de collagène. Cela permettra d'assurer l'attachement ferme de ASC-MSC sur la couche de gel de collagène et d'éviter de déloger ASC-MSC de la surface du collagène.
• Le produit de construction par lui-même peut être utilisé de manière inversée, c'est-PEG-fgels ibrin peut être lancé d'abord et ASC-MSC peuvent être des semences sur le dessus de PEG-fibrine gels suivie par des gels de collagène. Cela permet à l'utilisateur de lancer la solution de collagène fibrillaire sur la couche (ASC-CSM)-PEG-fibrine avec plus de prudence puisque, contrairement à PEG-fibrine gels, solution de collagène fibrillaire nécessite du temps supplémentaire (30 minutes) à se solidifier. En adoptant ce processus, on peut veiller à maintenir une distribution uniforme de la NCP-CSM.
• Les gels de collagène (et / ou de PEG-fibrine gels) peut être constituée par des mitogènes, comme facteurs de croissance (par exemple, facteur de croissance vasculaire endothéliale, facteurs de croissance des fibroblastes), de manière à induire la migration rapide et la prolifération cellulaire.

Dépannage

• Au cours de la fibrillation de la solution de collagène, si le pH dépasse le pH isoélectrique de> 7,2, le pH doit être réajusté soit en ajoutant plus de solution stock de collagène, un abaissement du pH en utilisant une solution d'acide faible.
• Lors de la préparation du CSM, si une grande variation dans la taille occupantsrs, puis un certain nombre de paramètres peuvent être ajustés pour obtenir la taille désirée CSM (viscosité de chitosane solution mère, volume de surfactant, la vitesse d'agitation, etc.)
• En cas de migration cellulaire lent lors du remplissage des gels, un nombre plus élevé de la MSC, ASC-peut être utilisé pour augmenter le nombre de cellules qui migrent hors de la CSM dans des gels.
• Procédé selon la PEG-fibrinogène gélification peut être retardé en coupant le volume de thrombine au mélange (900 pl généralement au lieu de 1 ml) ou la préparation d'un stock de plus faible concentration de thrombine (20 U / ml à la place de 25 U / ml) . Cela permet plus lent gélification de PEG-fibrinogène mélange et donne donc un délai supplémentaire pour la coulée de prudence pégylé-fibrinogène et la thrombine mélange au cours de la NCP-MSC.
• Pendant l'incubation, si une séparation de phase se produit (entre le collagène et la fibrine sur gel), un anneau de stérile torique Téflon peut être placé sur le produit d'assemblage supérieure pour assurer la fixation des phases de gel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	GIBCO, by Life Technologies	14175	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Consumable
Collagenase Type II	Sigma-Aldrich	C6685	Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352350	Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352360	Consumable
MesenPRO Growth Medium System	Invitrogen	12746-012	Consumable
L-Glutamine	GIBCO, by Life Technologies	25030	Consumable
CaCl2.2H2O	Sigma-Aldrich	C8106	Consumable
T75 Tissue Culture Flask	BD Biosciences	137787	Consumable
Chitosan	Sigma-Aldrich	448869	Consumable
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Consumable
N-Octanol	Acros Organics	150630025	Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate	Sigma-Aldrich	S6760	Consumable
Potassium Hydroxide	Sigma-Aldrich	P1767	Consumable
Acetone	Fisher Scientific	L-4859	Consumable
Ethanol	Sigma-Aldrich	270741	Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid	Sigma-Aldrich	P2297	Consumable
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	320331	Consumable
Ethyl Ether	Sigma-Aldrich	472-484	Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts	BD Biosciences	353097	Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129	Consumable
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8779	Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655)	Molecular Probes, Life Technologies	Q2502PMP	Consumable
Type 1 Collagen	Travigen	3447-020-01	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Consumable
12-Well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	Consumable
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F3879	Consumable
Thrombin	Sigma-Aldrich	T6884	Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene	Sunbio	DE-034GS	Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6)	Sigma-Aldrich	T5030	Consumable
Centrifuge	Eppendorf	5417R	Equipment
Orbital Shaker	New Brunswick Scienctific	C24	Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Model 370	Equipment
Overhead Stirrer	IKA	Visc6000	Equipment
Magnetic Stirrer	Corning	PC-210	Equipment
Vacuum Desiccator	-	-	Equipment
Particle Size Analyzer	Malvern Instruments	STP2000 Spraytec	Equipment
Water Bath	Fisher Scientific	Isotemp210	Equipment
Spectrophotometer	Beckman Coulter Inc.	Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer	Equipment
Vortex	Diagger	3030a	Equipment
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax M2	Equipment
Light/Fluorescence Microscope	Olympus Corporation	IX71	Equipment
Confocal Microscope	Olympus Corporation	FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope	Equipment
Scanning Electron Microscope	Carl Zeiss, Inc.	Leo 435 VP	Equipment
Transmission Electron Microscope	JEOL	JEOL 1230	Equipment