Questo protocollo si concentra sulla utilizzando la capacità intrinseca delle cellule staminali a prendere spunto dalla loro matrice extracellulare che circonda ed essere indotte a differenziarsi in fenotipi multipli. Questo manoscritto metodi estende la nostra descrizione e caratterizzazione di un modello utilizzando un idrogel doppo strato, costituito da PEG-fibrina e collagene, contemporaneamente alla co-differenziare derivate da tessuto adiposo cellule staminali 1.
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Articolo metodologico
Progettazione di un Hydrogel doppo strato di controllo differenziazione ASC
In questo articolo
Sommario
Abstract
Polimeri naturali nel corso degli anni hanno acquisito maggiore importanza a causa della loro biocompatibilità di accoglienza e la capacità di interagire con le cellule in vitro e in vivo. Un'area di ricerca che promette nel campo della medicina rigenerativa è l'uso combinatorio di biomateriali innovativi e cellule staminali. Una strategia fondamentale nel campo dell'ingegneria dei tessuti è l'uso di tridimensionale ponteggio (ad esempio, decellularizzato matrice extracellulare, idrogel, micro / nano particelle) per dirigere la funzione delle cellule. Questa tecnologia si è evoluta dalla scoperta che le cellule hanno bisogno di un substrato su cui si può aderire, proliferare, ed esprimono il loro fenotipo differenziato cellulare e la funzione 2-3. Più recentemente, è stato anche determinato che le cellule non solo utilizzare questi substrati per adesione, ma anche interagire e prende spunto dal substrato di matrice (ad esempio, matrice extracellulare, ECM) 4. Pertanto, le cellule e ponteggi una connessione reciproca cheserve a controllare lo sviluppo dei tessuti, l'organizzazione e la funzione finale. Derivate da tessuto adiposo cellule staminali (CSA) sono mesenchimale, non-ematopoietiche cellule staminali presenti nel tessuto adiposo, che può esibire multi-lineage differenziazione e servire come fonte immediatamente disponibile di cellule (cioè pre-endoteli vascolari e periciti). La nostra ipotesi è che derivate da tessuto adiposo cellule staminali possono essere dirette verso differenti fenotipi contemporaneamente semplicemente co-coltura in matrici doppo strato 1. Il nostro laboratorio è focalizzata sulla guarigione della ferita cutanea. A questo scopo, abbiamo creato un'unica matrice composita dai biomateriali naturali, fibrina, collagene, e chitosano che possono mimare le caratteristiche e le funzioni di un dermo-specifico ambiente guarigione della ferita ECM.
Protocollo
1. Isolamento derivate da tessuto adiposo cellule staminali (CSA) 1, 5
Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.
- Isolare adiposo perirenale e epididimale di ratto e lavare con soluzione salina sterile tamponata di Hank (HBSS) contenente 1% siero bovino fetale (FBS) 5 come precedentemente descritto. Questo studio è stato condotto nel rispetto della legge sulla protezione degli animali, l'applicazione dei regolamenti benessere degli animali e in conformità con i principi della guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio. ....
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Discussione
ASC sono ben noti per la loro facilità di isolamento e la capacità di differenziare verso vari tipi di cellule. Con le tecniche descritte in questa manoscritto, siamo in grado di sfruttare la plasticità del ASCs esponendo le cellule a biomatrices contemporaneamente. Come le cellule migrano lontano dalla loro base CSM e inserire il proprio ambiente circostante extracellulare, le cellule prendono spunto dal patibolo e può mantenere "staminalità" (collagene) o essere indotte a differenziarsi verso tipi di cellule.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi finanziari esistono.
Disclaimers
I pareri o le affermazioni contenute nel presente documento sono le opinioni personali degli autori e non devono essere interpretate come ufficiale o che riflette le opinioni del Dipartimento della Difesa o il Governo degli Stati Uniti. Gli autori sono dipendenti del governo degli Stati Uniti, e questo lavoro è stato preparato come parte delle loro funzioni ufficiali. Tutto il lavoro è stato sostenuto dalla US Army Medical Research e Materiel Command. Questo studio è stato condotto nell'ambito di un protocollo esaminato e approvato dalla US Army Medical Research e Materiel Command Institutional Review Board e in conformità con il protocollo approvato.
Ringraziamenti
SN è stato sostenuto da una borsa post-dottorato dal Initiative Tissue Engineering Pittsburgh. DOZ è supportata da una sovvenzione concessa dalla Fondazione di Ginevra.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente / apparecchiatura | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS) | Gibco | 14175 | Consumabili |
| Siero fetale bovino | Hyclone | SH30071.03 | Consumabili |
| Collagenasi di tipo II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumabili |
| 70-micron Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352350 | Consumabili |
| 100-um Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352360 | Consumabili |
| MesenPRO crescita media del sistema | Invitrogen | 12746-012 | Consumabili |
| L-Glutammina | Gibco | 25030 | Consumabili |
| CaCl 2 .2 H 2 O | Sigma | C8106 | Consumabili |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumabili |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumabili |
| Acido acetico | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumabili |
| N-ottanolo | Acros Organics | 150630025 | Consumabili |
| Sorbitan-mono-oleato | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumabili |
| Idrossido di potassio | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumabili |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumabili |
| Etanolo | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumabili |
| Trinitro benzensolfonico Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumabili |
| Acido cloridrico | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumabili |
| Etere etilico | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumabili |
| 8-micron di tessuto coltura in piastra Inserti | BD Biosciences | 353097 | Consumabili |
| Microcentrifuga da 1,5 ml Tubes | Pescatore | 05-408-129 | Consumabili |
| MTT reagente | Invitrogen | M6494 | Consumabili |
| Dimetilsolfossido | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumabili |
| Qtracker cellulare Labeling Kit (QTracker 655) | Sonde molecolari | Q2502PMP | Consumabili |
| Collagene di tipo 1 | Travigen | 3447-020-01 | Consumabili |
| Di sodio idrossido | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumabili |
| 12-Well piastre di coltura dei tessuti | BD Biosciences | 353043 | Consumabili |
| Fibrinogeno | Sigma | F3879 | Consumabili |
| Trombina | Sigma | T6884 | Consumabili |
| Derivata Benztriazole di polietilene | Sunbio | DE-034GS | Consumabili |
| Tris Buffer Tablet (pH 7,6) | Sigma | T5030 | Consumabili |
| Centrifuga | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Attrezzatura |
| Incubatore umidificato con Air-5% CO 2 | Thermo Scientific | Modello 370 | Attrezzatura |
| Agitatore | IKA | Visc6000 | Attrezzatura |
| Agitatore magnetico | Corning | PC-210 | Attrezzatura |
| Vacuum Essiccatore | - | - | Attrezzatura |
| Particle Size Analyzer | Malvern | STP2000 Spraytec | Attrezzatura |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Attrezzatura |
| Spettrofotometro | Beckman | Beckman Coulter Spettrofotometro DU 800UV/Visible | Attrezzatura |
| Vortice | Diagger | 3030a | Attrezzatura |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax M2 | Attrezzatura |
| Luce / microscopio a fluorescenza | Olimpo | IX71 | Attrezzatura |
| Microscopio confocale | Olimpo | FV-500 microscopio confocale a scansione laser | Attrezzatura |
| Microscopio Elettronico a Scansione | Carl Zeiss MicroImaging | Leo 435 VP | Attrezzatura |
| Microscopio elettronico a trasmissione | JEOL | JEOL 1230 | Attrezzatura |
Riferimenti
- Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
- Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S.
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Ristampe e permessi
