Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Published: May 14, 2012 doi: 10.3791/3986
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Pennsylvania State University College of Medicine

Summary

Indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerden T lenfositlerin Nesil T hücre tabanlı immünoterapi için embriyonik kök hücreler kullanarak alternatif bir yaklaşım verir. Yöntem kullanılarak ya da göstermektedir

Abstract

Antijen-spesifik CD8 + sitotoksik T lenfositler (CTL) ve evlatlık hücre transferi (ACT) maligniteleri 1 çeşitliliği için umut verici bir tedavi yöntemidir. CTL'leri Malign hücreleri öldürmek için T hücre reseptörleri (TCR) ve serbest sitotoksin gibi sitokinler ile tümör antijenleri etkileşim suretiyle habis hücrelerin tanıyabilirsiniz. Bu CTL'leri yüksek proliferatif potansiyeli var çünkü, az diferansiye ve merkezi-bellek gibi (yüksek derecede reaktif adlandırılır) CTL'leri ACT tabanlı immünoterapi için optimal nüfus olduğu bilinmektedir, daha farklılaşmış hücreler daha apoptoz daha az yatkındır ve sahip bir homeostatik sitokin 2-7 yanıt yüksek yeteneği. Ancak, hastaların bu tür CTL'leri yüksek bir sayı elde zorluklar nedeniyle, başarılı ACT-temelli tedaviler için son derece reaktif Ag spesifik CTL oluşturmak için yeni bir yaklaşım bulmak için acil bir ihtiyaç vardır.

Kendini yenilenebilir kök TCR transdüksiyonimmün sulandırma için hücre hastalıkların 8-10 tedavisi için terapötik bir potansiyele sahiptir. Ancak, hastaların embriyonik kök hücreler (EKH) elde etmek için bir yaklaşım mümkün değildir. Tedavi amaçlı hematopoetik kök hücrelerin kullanımı (HKH'lerin) yaygın klinik 11-13 uygulanmış olmasına rağmen, HKH'lerin farklılaşma ve proliferatif kapasiteleri azalmış ve HKH'lerin in vitro hücre kültürleri 14-16 in genişletmek için zordur. Son iPS hücre teknolojisi ve gen aktarımı için in vitro bir sistem içinde bir gelişme, herhangi bir cerrahi yaklaşım olmadan hastaların iPS hücreleri oluşturma yeteneğine sahiptirler. Buna ek olarak, EKH gibi iPS hücreleri, in vitro olarak belirsiz proliferatif kapasitesine sahip olması, ve hematopoietik hücrelerin farklılaşması için gösterilmiştir. Böylece, iPS hücreleri EKH veya HKH'lerin ile karşılaştırıldığında ACT-tabanlı immünoterapi kullanılmak üzere, daha büyük bir potansiyele sahiptir.

Burada, T lenfosit üretimi için yöntemler mevcutin vitro iPS hücrelerden cytes, kanser ve immün gözetim teşvik etmek için iPS hücreleri antijen-spesifik CTL in vivo programlama. Bir Çentik ligand ile in vitro olarak uyarılması iPS hücrelerden T-hücresi farklılaşması sürücüler ve tümör büyümesini engelleyen in vivo antijen-spesifik T hücrelerinin içine ayırt iPS hücreleri içinde TCR gen transdüksiyonu ile sonuçlanır. Böylece, iPS hücreleri antijen-spesifik T hücre farklılaşmasını göstermektedir. Çalışmalarımız ACT-temelli tedaviler için antijen spesifik CTL oluşturmak için bir potansiyel olarak daha verimli bir yaklaşım sağlamak ve hastalıklar için tedavi stratejilerinin geliştirilmesini kolaylaştırmak.

Protocol

1. Hücre Kültürü

  1. Kültür için (irSNL76 / 7) SNL76 / 7 ışınlanmış besleyici hücrelerin hazırlanması.
    SNL76 / 7 hücreleri genel olarak% 10 fetal bovin serumu (FBS) Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) ortamında muhafaza edilir.
    1. Sıvı azot SNL76 / 7 hücreleri kurtarmadan önce 30 dakika süreyle inkübatör; bir kültür çanak veya cam şişe 37% 0,1 jelatin çözeltisi ° C ile kaplı olacaktır.
    2. SNL76 / 7 hücreler konfluense ulaştığında, hücreler tripsinize kapalı 5 dakika boyunca 400 g'de santrifüje ve taze ortam içinde yeniden süspanse edilecektir.
    3. Resüspande SNL76 / 7 hücreleri 5000 RADS bir doz ile bir 60 Co ışınlayıcılar ışınlanmış edilecektir.
      Alternatif bir yaklaşım, SNL76 / 7 hücreleri fare embriyonik fibroblastlar (MEF) ve mitomisin-inaktivasyon yerini olabilir ışınlama yerini alabilir.
    4. Işınlama sonra, hücreler 5 dakika boyunca 400 g'de santrifüje edilir ve içine% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) FBS donma tampon, kısım içinde tekrar süspansekriyotüplerin ve ileride kullanmak için sıvı azot içinde korunmuş.
  2. In vitro farklılaşma için PÇ9-DL1 hücrelerin hazırlanması.
    PÇ9-DL1 hücreler genellikle% 20 FBS α-asgari temel, orta (α-MEM) medya muhafaza edilecektir. Onlar confluency hücrelere ulaştığında 1:5 seyreltme bölünecektir.
  3. E.G7 timoma hücreleri hazırlanması.
    E.G7 timoma hücreleri genellikle% 10 FBS Roswell Park Memorial Institute orta (RPMI) -1640 medya muhafaza edilecektir. Onlar confluency gelindiğinde, hücreleri 1:10 seyreltme bölünecektir.
  4. IPS ve TCR-transduced iPS hücrelerin genel bakım.
    1. Kültür bir çanak irSNL76 / 7 besleyici hücrelerin ileri geri kazanım veya iPS hücrelerin bölünme bir gün tohumlu önce 30 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.1 jelatin solüsyonu ile kaplanır.
    2. IPS hücrelerin bölünme için, hücreler 5 dakika boyunca 400 g'de santrifüje kapalı tripsinize edilir ve% 15 FCS DMEM ortamı içinde tekrar süspanse edilir.
    3. Tripsinize iPShücreleri 37 ile 30 dakika için taze bir kültür çanak üzerinde inkübe edilecektir ° C inkübatör farklılaşmış hücre ve kalıntı besleyici hücreler dışlamak için taze irSNL76 / 7 besleyici hücre Precoated yemeğin üzerine ekiyoruz önce.
    4. Inkübasyondan sonra, 4 × 10 6 hücre 100mm kültür çanak ekilirler edilecektir.

2. Vitro Programlama

  1. Vitro kokültürü sisteminde.
    1. Gün 0 anda, 5x10 4 iPS hücreleri% 20 FBS α-MEM medya confluent PÇ9-DL1 hücre monolayer içeren 100mm kültürü çanak seribaşı olacak.
    2. 3. Gün anda, kültür ortamı taze olanları ile değiştirilebilir olacaktır.
      1. ° C inkübatör 37 30 dakika süreyle taze 100mm kültür çanak üzerinde kuluçkaya önce Day At 5, hücreleri kapalı tripsinize olacak ve 5 dakika boyunca 400 g de santrifüj.
      2. Yüzer hücreler toplanmış ve dahil edilecektir, 5x10 5 hücreler taze kültür aktarılır% 20 FBS α-MEM medya confluent PÇ9-DL1 hücre monolayer içeren çanak. Sitokin mFlt-3L (nihai konsantrasyon: 5 ng / ml) kültür içinde ilave edilir.
      1. 8. Gün anda, gevşek tutturulmuş hücreler yavaşça aşağıya Pipeti edilecektir.
      2. Kısmen farklılaşmış iPS hücrelerinin maksimal iyileşme elde etmek için 10 ml PBS bir kez daha sahip PÇ9-DL1 besleme katmanı yıkayın.
      3. Kokültürü hücreler hasat sonra, hücreler 5 dakika boyunca 400 g'de santrifüje edilir ve tekrar süspanse% 20 FBS mFlt-3L (5 ng / ml) ve MIL-7 (1 ng / ml) ile desteklenmiş α-MEM ortam.
      4. Hücreler konfluent PÇ9-DL1 hücreleri ile kaplanmış bir 6 oyuklu kültür levhası içine aktarılır. Genellikle bir 100 mm kültür kaplarına ele iPS hücreleri 6-kuyulu plakanın iyi birine aktarılır.
      1. Günde 10 itibaren, kültür ortamı (günaşırı değiştirilir% 20 FBS α-MEM ortam supplementemFlt-3L (5 ng / ml) ve MIL-7 (1 ng / ml)) ile d.
      2. Kültür plakaları PÇ9-DL1 hücreler besleyici hücrelerin büyümesini bağlı olarak 4-6 gün içinde değişecektir besleyici ile kaplanmıştır.
  2. Kısmen farklılaşmış iPS hücreleri in vivo olgunlaşması.
    1. 30 dakika boyunca 37 ° C kokültürü Günü, 22 iPS hücreleri, kapalı tripsinize olacak 5 dakika boyunca 400 g de santrifüj ve taze bir kültür çanak üzerinde inkübe.
    2. Yüzer hücrelerin farelere pulmoner embolizm neden olabilir hücre kümeleri çıkarmak için 70 mikron naylon süzgecinden geçirildi, toplanmış ve soğuk PBS ile üç kez yıkanır.
    3. Hücreler 7 1.5x10 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon ile PBS içerisinde yeniden süspanse edilecektir.
    4. Hücreler Enjeksiyondan önce buz üzerinde muhafaza edilecektir.
    5. Kuyruk damarı boyunca iv enjeksiyon öncesi, farelerin kuyruk damarından genişletmek için bir kızılötesi ışık altında yer alacaktır.
    6. Damar d sonrailatation, 200 ul hücre süspansiyonu veya 3x10 6 hücre adoptif kuyruk ven yoluyla B6.129S7-Rag1 tm1Mom / J-eski fare 4 hafta içine transfer edilecektir. Üç hafta kısmen farklılaşmış iPS hücreleri in vivo maturasyonu için izin verilir.
  3. Değerlendirme.
    1. Farklılaşmış hücre ve hücre kurtarma oranları morfolojik değişiklikler. Şekil 1.
      1. PÇ9-DL1 hücrelerle kokültürü farklı günlerde, canlı hücre fotoğraf geleneksel mikroskop altına alınacaktır.
      2. Hücre iyileşme oranları kültür hasat hücre sayısına göre hesaplanır.
    2. Yüzey işaretleyici değişiklikler flow sitometrik analizi. Şekil 2a.
      1. Kokültürü farklı günlerde, hücreleri tripsinizasyonla tarafından kültür kaldırılır ve hücre yüzeyi boyama geçmeden önce soğuk PBS ile yıkandı.
      2. Zekâ boyama önceh farklı florokrom konjuge antikorlar, hücreler 20 dakika süreyle 4 ° C de Fc engelleyici 24G2 tarafından bloke edilir.
      3. 4 boyanma 20 dakika sonra ° C, hücreler akış sitometrik incelemeden önce soğuk PBS ile üç kez yıkanır.
    3. Vitro farklılaşmış iPS hücreleri. Şekil 2b aktivasyonu.
      1. Etkinleştirme tahlil bir gün önce, astar öncesi, anti-CD3 (nihai konsantrasyon: 4 mg / mL PBS içinde) içeren 24 kuyulu plakanın 4 ° C de gece boyunca.
      2. Kokültürü ve 22. günde iPS hücreleri, elde edilen T-hücrelerinde kültür hasat edilir ve plaka kaplama, anti-CD3 ve çözünür anti-CD28 antikoru (nihai konsantrasyon: 4 mg / ml) ile stimüle önce soğuk PBS ile yıkandı.
      3. Kuluçka 37 içinde gerçekleştirilecektir sonra ° C, 40 saat boyunca% 5 CO2 kuluçka makinesi ve A başka bir 4 saat için kültür içine eklenecektir Befeldin.
      4. Kokültürü sonunda, hücreler har olacaktırgiydirilmiş, yıkanmış ve yukarıda açıklandığı gibi Fc engelleyici tarafından engellenmiş. Engellenen hücreleri florokrom konjuge antikorlar kullanılarak CD8 ve TCR Vβ zinciri olarak yüzey belirteçleri için lekeli olacak.
      5. Hücre yüzeyi boyaması sonra, hücreler% 4 formaldehit ile sabitlenir ve Biolegend en Permeabilizing kiti kullanılarak permeabilize.
      6. Geçirgenliği sonra, IL-2 ve IFN-γ gibi moleküllerin hücre içi florokrom konjuge antikor ile boyanmıştır olacaktır.
      7. Nihai flow sitometrik incelemelerine önce, hücrelerin aşırı antikor dışlamak için soğuk PBS içinde üç kez yıkanır.
    4. Fareler - Rag-/ olgunlaşma.
      1. Vivo geliştirme, Rag-/ üç hafta sonra - fareler sakrifiye edilecek, dalak ve lenf düğümleri farelerin silinecektir.
      2. Tek hücreler mekanik arıza ile işlenecektir. Kırmızı kan hücreleri ACK lizis tamponu ve kullanarak lize olacakmononucleocytes toplanmış ve soğuk PBS ile iki kez yıkanır.
      3. Yıkamadan sonra, hücreler 20 dakika süreyle 4 ° C de Fc engelleyici 24G2 ile bloke edilir ve engelleme sonunda, hücreler farklı florokrom konjuge anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 ve anti-TCRβ antikorlar ile boyanmış olacaktır 4 ° C'de 20 dakika karıştırıldı.
      4. Boyanma sonunda, hücreler akış sitometrik incelemeden önce soğuk PBS ile üç kez yıkanır.

3. Vivo Programlama

  1. Retroviral yapı üretimi.
    1. MSCV-IRES-DsRed (MiDR) vektör DsRed gen ile GFP gen tarafından ikame MSCV-IRES-GFP vektörüne dayanarak yapılmıştır.
    2. OT-bir T-hücresi reseptör geni OT-I/MiDR inşa etmek için MiDR vektör içine alt klonlandı edilir.
  2. Retroviral iletimi ve hücre sıralama.
    1. Plat-E paketleme hücre arE aşağıdaki iletimi için kullanılacağını pseudovirus oluşturmak için kullanılır.
      1. 3x10 6 Plat-E hücreler transfeksiyon öncesinde 100 mm kültür çanak bir gün numaralı seribaşı.
    2. 0. günde, Plat-E hücreleri ile transfekte edilir OT-I GeneJamma transfeksiyon reaktifi kullanılarak plazmid MiDR.
    3. 1. günde, 1x10 6 iPS hücreleri,% 0.1 jelatin Precoated 24-kuyulu plakanın de bir içine ekilmiş olacaktır.
      1. Günde 2 üzerinde, pseudovirus içeren Plat-E kültüründen süpernatant potansiyel kirletici dışlamak için filtre 0.4 mikron aracılığıyla toplanan ve geçilecek.
      2. Transdüksiyon 5 ug / ml polybrene varlığında 1 saat için 1400 rpm'de 32 ° C'de santrifüj koşulu altında gerçekleştirilecektir.
      3. Santrifüj bazlı transdüksiyon sonra, hücreler 32 ° C, gece boyunca% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde yer alacaktır.
    5. 3. gün, günde 2 tra tekrarlayınYukarıda tarif edildiği gibi nsduction işlem. Bir 6-plaka daha sonra kullanmak için irSNL76 / 7 besleyici hücreleri ile Precoated olacaktır.
    6. 4. günde, iPS hücreleri 5 dakika boyunca 400 g de santrifüj ve Precoated irSNL76 / 7 besleyici hücreler üzerine numaralı seribaşı, kapalı tripsinize edilecektir transduced.
    7. Confluency anda, hücre, kapalı tripsinize 5 dakika boyunca 400 g de santrifüj edilerek hücre sıralama için işlenecektir. GFP ve DsRed çift pozitif hücrelerin MoFlo hücre sıralayıcı sıralama kriteri olacaktır. Sıralama hücreler daha sonra kullanmak için irSNL76 / 7 besleyici hücreleri üzerinde kültive edilir.
  3. Evlatlık transferi ve tümör meydan.
    OT-I TCR yukarıda tarif edildiği gibi IPS (OT-I/iPS) hücreleri genellikle irSNL76 / 7 besleyici hücreleri üzerinde tutulur transdük.
    1. Evlatlık transfer gününde OT-I/iPS hücreler, kapalı tripsinize edilir 5 dakika boyunca 400 g de santrifüj ve taze ortam içinde yeniden süspanse.
    2. 30 dakika 37 bir taze kültür çanak inkübasyon ° C inkübatör farklılaşmış hücre ortadan kaldırmak için gereklidirve kalan besleyici hücreler.
    3. İnkübasyonun sonunda, yüzer hücreler 5 dakika boyunca 400 g'de santrifüje toplanmış ve edilir.
    4. Hücre topak üç kez soğuk PBS ile yıkanır ve hücrelerin hücre kümeleri (2X filtrasyon) hariç tutmak için, iki yıkama arasında bir 70 mikron naylon filtre içinden geçirilir.
    5. 7 1.5x10 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda yıkamadan sonra, hücreler sayılır ve soğuk PBS içinde tekrar süspanse edilir.
    6. Hücreler Enjeksiyondan önce buz üzerinde muhafaza edilecektir.
    7. Adoptif transfer için, 4-6 haftalık dişi fareler C57BL/6J kullanılır. Kuyruk damarı boyunca iv enjeksiyon öncesi, farelerin kuyruk damarları genişletmek için bir kızılötesi ışık altında yer alacaktır.
    8. Ven dilatasyonu sonra, 200 ul hücre süspansiyonu veya 3x10 6 hücre adoptif kuyruk ven yoluyla aktarılır. OT-I TCR in vivo olgunlaşmasında iPS hücreleri transdük için altı hafta izin verilecektir.
      1. Iv enjeksiyon altı hafta sonra, 4x10 6 E.G7 timoma hücreleri intraperitoneal inoküle edilir.
      2. E.G7 timoma hücreleri kültürüne hasat edilmiş ve PBS ile üç kez yıkanır.
      3. Yıkama sonunda, hücreler 7 8x10 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon içinde soğuk PBS içinde askıya alınır.
      4. 50 ul hücre süspansiyonu 4x10 ya da 6 hücre periton içine enjekte edilecektir.
  4. Değerlendirme.
    1. In vitro OT-I TCR karakterizasyonu iPS hücreleri transdük.
      1. DsRed Floresan mikroskopi, GFP çift pozitif hücrelerin sabitlenmemiş canlı hücreleri ile geleneksel floresan mikroskop altında yapılacaktır.
      2. Gen entegrasyon ve ifade PCR ve RT-PCR analizleri hem de analiz edilecektir.
        1. Hücresel DNA ya da RNA ya da DNA Qiagen kullanılarak örneklerinden ayrı ayrı izole edilirRNA izolasyon kiti.
        2. PCR ve RT-PCR özellikle TCR Vβ5 zincirinin rekombine VDJ bölgeyi tanımamıza primerler kullanılarak yapılacaktır.
    2. T hücre gelişimi ve olgunlaşması. Şekil 3a.
      1. Hafta 2, 4 ve 6 sonrası hücre transferi, hayvan kurban edilecek ve dalak, lenf düğümleri hayvan kaldırılır.
      2. Tek hücre süspansiyonu mekanik arıza yoluyla yapılacaktır. Kırmızı kan hücreleri toplanmış ve soğuk PBS ile iki kez yıkanır ve ACK lizis tamponu ile mononucleocytes kullanılarak lize edilir.
      3. Yıkamadan sonra, hücreler 20 dakika süreyle 4 ° C de Fc engelleyici 24G2 ile bloke edilir ve engelleme sonunda, hücreler 20 dakika için 4, farklı florokrom konjuge antikor ° C ile aliquotted ve lekeli edilecektir.
      4. Boyanma sonunda, hücreler akış sitometresinde yüklemeden önce, soğuk PBS ile üç kez yıkanır.
    3. Peptid stimülasyon. Şekil 3b.
      1. Tümör zorluk gün 50 üzerinde, hayvan kurban edilecek ve dalak, lenf düğümleri hayvanlardan kaldırılır.
      2. Tek hücre süspansiyonu mekanik arıza yoluyla yapılacaktır. Kırmızı kan hücreleri toplanmış ve soğuk PBS ile iki kez yıkanır ve ACK lizis tamponu ile mononucleocytes kullanılarak lize edilir.
      3. CD8 + T hücreleri Miltenyi Biotec en CD8 + T-hücresi izolasyon kiti kullanılarak izole edilir. Izole edilmiş CD8 + T hücrelerini 1:10 oranında saf C57BL/6J farelerde izole edilmiş ve 0.5 mol / ml OVA 40 saat için 257-264 peptit ile doldurulan, ışınlanmış splenositlerin ile karıştırılır. Bundan sonra, Brefeldin A başka bir 4 saat için kültür içine eklenir.
      4. Kokültürü sonunda, hücreler yukarıda tarif edildiği gibi yıkanır ve Fc engelleyici ile bloke edilmiş, hasat edilir.
      5. Engellenen hücrelerin yüzey işareti lekeli olacakflorokrom konjuge antikorlar kullanılarak CD8 ve TCR Vβ5 zincir gibi ers.
      6. Hücre yüzeyi boyaması sonra, hücreler% 4 formaldehit ile sabitlenir ve hücre geçirgenliği kiti kullanılarak permeabilize.
      7. Geçirgenliği sonra, IL-2 ve IFN-γ gibi moleküllerin hücre içi florokrom konjuge antikor ile boyanmıştır olacaktır.
      8. Nihai flow sitometrik incelemelerine önce, hücrelerin aşırı antikor dışlamak için soğuk PBS içinde üç kez yıkanır.
    4. In vivo tahlil öldürüyor. Şekil 3C.
      1. Naif C57BL/6J farelerin dalak izole edilmiş ve hedef hücre olarak carboxyfluorescein süksinimidil ester (CFSE) ile etiketlenir.
      2. Hücreler 5 mmol / ml CFSE (CFSE hi hücre) 10 ug / ml OVA 257-264 peptit ve 0,5 mol / ml CFSE (CFSE lo hücreleri) darbeli olmayacak ile etiketlenmiş hücreler ile doldurulan olacaktır ile etiketlenmiştir. 2.5x10 6 KAKE hi hücreleri artı 2.5x10 6 KAKE lo hücrelerin karışımı adoptif belirtilen alıcının içine iv enjeksiyon yoluyla aktarılır.
      3. 16 saat sonra, bu farelerin dalak izole edilecek ve KAKE + hücreler flow sitometri ile analiz edilecektir.
    5. Intraperitoneal tümör hücre sayımı. Şekil 4.
      Tümör zorluk günün 20 At, fareler sakrifiye edilecek ve periton boşluğuna lavaj soğuk PBS kullanılarak yapılacaktır. Periton lavajı tümör hücreleri sayılır kurtarıldı.
    6. Tümör T-hücrelerinde tanımlama infiltre. Şekil 5.
      1. Tümör zorluk geç aşamada, fareler kurban edilecek ve tümör farklı gruplardan periton silinecektir.
      2. Tümör parçalar halinde kesilir, tek parça bir cryovial içine koymak ve hemen kuru buz üzerine yerleştirilir, diğer yarısı için giderilecektirmaldehyde ve üçüncü bir parça daha sonra kullanmak için şartlı RPMI-1640 ortamı içinde muhafaza edilir.
      3. H & E boyama formaldehit sabit ve parafine sarılmış örnekleri genel protokolüne uygun olarak yapılacaktır.
      4. Immünofloresan boyama kriyoprezerve numuneler üzerinde yapılacaktır.
        1. Doku kullanımdan önce -20 ° C kesitli ve korunmuş olacaktır.
        2. Doku kesitleri hava 15 dakika 15 dakika soğuk aseton tespit öncesi kurutulmuş olacaktır.
        3. Tespit edildikten sonra, kesitler 5 dakika PBS yıkama önce başka bir 15 dakika kurutulup hava olacak.
        4. Nemli bir odaya yıkama, sonra, slaytlar bir yerde ve spesifik olmayan bağlanma engellemek için 30 dakika için 30 ul PBS içinde% 3 oranında BSA ile doku bölümü kapsamaktadır.
        5. Engelleme sonunda, bloke edici tampon kapalı leke ve% 3 BSA içinde seyreltilmiş PE-anti-TCR Vα2 antikorlar ve FITC-anti-OVA antikorların bir karışımı ile 50 ul doku bölümleri kapsarPBS içinde.
        6. 2 saat boyunca nemli bir odaya ve inkübasyon sonunda inkübe, slaytlar soğuk PBS ile üç kez yıkanmış ve floresan mikroskobik inceleme öncesinde su bazlı bir montaj ortamı ile monte edilir.
      5. T hücrelerinin infiltre tümör flow sitometrik analizi.
        1. Tümör tek bir hücre süspansiyonu ve kırmızı kan hücreleri ACK lizis tamponu tarafından yok edilecektir içine ezilmiş olacaktır.
        2. Yıkama ve engelleme sonra hücreler özellikle CD8, TCR Vα2 ve hücre yüzeyinde ifade TCR V β5 molekülleri tanıyabilmesi farklı florokrom konjuge antikorlar ile etiketlenir.
    7. Fare sağkalım. Şekil 6.
      Tümör mücadelesinden sonra, fare hayatta dikkatle izlenecektir.

4. Temsilcisi Sonuçlar

CD3 ve TCRβ T marker olarak kullanılmaktadırhücreler. Notch ligand DL1 ile iPS hücrelerinin uyarılması T hücre farklılaşmasını katkıda bulunabileceğini belirlemek için, biz iPS hücre kaynaklı hücreler üzerinde CD3 ekspresyonu ve TCRβ + değerlendirilir ve CD4 ve CD8 daha detaylı analiz ifadesi, CD3 yolluk + ve TCRβ + nüfus. CD8 + tek pozitif (SP) T hücrelerinin in vitro iPS hücreleri elde edildi - gibi günde 22, CD3 + TCRβ + CD4, burada gösterilen. Buna ek olarak, iPS hücre kaynaklı SP hücreleri IL-2 ve üretmek mümkün IFN-γ iPS hücre-kaynaklı düşündüren, plaka-kaplı, anti-CD3 ve çözünür anti-CD28 antikor (Şek. 2) ile in vitro olarak uyarıldığında T hücreleri fonksiyonel.

Alıcı farelere evlatlık transferinden sonra, TCR çoğunluğu iPS hücreleri CD8 içine farklılaşma uygulandı + se tarafından peptid stimülasyon in vitro yanıtladı CTL'leri, gen-transdüklüIL-2 ve IFN-γ (Şekil 3). creting En önemlisi, bir evlatlık transferi iPS hücreler tümör meydan (Şekil 5-6) tümör dokuları ve korunan hayvanların içine OVA-reaktif CTL'lerin infiltrasyonu tetiklenen TCR-transduced. Böylece, TCR gen-transduced iPS hücreleri in vivo fonksiyonel antijen spesifik CTL içine ayırt edebilirsiniz.

Şekil 1
Şekil 1. IPS hücre farklılaşmasının morfolojisi. Muhtelif günlerde, fare iPS hücreleri,% 20 FCS ve 5 ng / ml mFlt3L ve 1 ng / ml, MIL-7 varlığında, 2.2 g / L sodyum bikarbonat ile desteklenmiş α-MEM ortam içinde PÇ9-DL1 hücreleri ile birlikte-kültür edildi .

Şekil 2,
IPS hücrelerinden Şekil 2.. T hücre farklılaşması. Fare iPS hücreleri, Şekil 1 'de tarif PÇ9-DL1 hücreleri ile birlikte-kültür edildi. D Açık22 ay iPS hücre türetilmiş hücreler izole edilmiş ve analiz edilmiştir. A) CD4 + CD8 - veya CD4 - CD8 CD3 + ve TCRβ + popülasyonları üzerindeki yolluk sonrası + hücreler. B) Hücreler% 5 CO2, 37 ° C de 5 saat için plaka kaplama, anti-CD3 ve çözünür anti-CD28 antikorları ile stimüle edildi. CD8 + T hücreleri - IL-2 ve IFN-γ canlı CD4 yolluk sonra, hücre içi boyama ile incelendi.

Şekil 3
Şekil 3,. In vivo iPS hücreleri antijene spesifik CD8 + T-hücre gelişme. OT-I TCR gen-transduced iPS hücreleri C57BL / 6 fareler içine iv enjekte edildi. Altı ila on hafta sonra, OVA spesifik CD8 + Vβ5 + T-hücresi gelişme tespit edilmiştir. A) CD8 + Vβ5 toplanmış LN'ler ve dalak + T hücreleri C yolluk sonra, flow sitometri ile analiz edildiD8 + popülasyonları. B) IL-2 ve IFN-γ üretim (koyu renkli çizgiler; gölgeli alanlar izotip kontrolleri belirtiniz) CD8 + Vβ5 + popülasyonları üzerindeki yolluk sonra, hücre içi sitokin boyama ile tespit edilmiştir. C) in vivo proliferasyon / sitotoksisite deneyde gösterilebilir. KAKE hi (sağ pik) ve KAKE lo (sol zirveleri) hedef hücrelerin sırasıyla OVA 257-264 peptid ve kontrolü ile doldurulmuşlardır ve farelere enjekte edildi on hafta OT-I CTL transferinden sonra iPS hücre transferi veya bir gün sonra.

Şekil 4,
OT-I TCR Şekil 4. Evlatlık transferi iPS hücrelerinin tümör büyümesini baskıladığı gen-transduced. OT-I TCR gen-transduced iPS hücreleri adoptif C57BL / 6 fareler aktarılmıştır. Farelerin bir grup OT-I TC OVA-reaktif CD8 + T hücreleri ile enjekte edildiR transgenik fareler ve farelerin bir grup hiçbir hücre transferi vardı. Altı hafta ya sonra veya hücre transferinden sonra ertesi gün, farelerde E. G7 tümör hücreleri ile meydan okumaya maruz kaldılar. Günde 20 üzerinde, periton boşluğunda tümör hücrelerinin numaralandırılan.

Şekil 5,
Şekil 5,. IPS hücre-türevli antijen-özgü CTL'ler tümör dokusu içine sokulmak. Tümör mücadelesinden sonra günde 30 ile 35 üzerinde, tümör dokularında tümör-reaktif T hücre infiltrasyonu yönünden incelendi. A) H & E boyama. İnflamatuar hücreler tümör dokuları (↓) sızmış. B) Immünohistolojik boyama. OVA spesifik CTL Vα2 + (kırmızı) OVA-eksprese eden tümör dokularında (yeşil) sızdı. C) tümör dokularından Tek hücre süspansiyonları Vα2 ifadesi için analiz edildi + akım sitometri, CD8 + nüfus yolluk sonra + ve Vβ5.

"Şekil Şekil OT-I TCR 6. Evlatlık transferi gen-transduced iPS hücreleri fare hayatta sürdürmektedir. OVA TCR iPS hücreleri adoptif Şekil tarif edildiği gibi E. G7, tümör hücreleri ile meydan tabi tutuldu C57BL / 6 fareler içine transfer edildi gen-transdük. 4. Günde 50 Fare sağkalım Kaplan-Meier sağkalım eğrileri (n = 6) tarafından gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ACT-temelli tedaviler için, in vivo tekrar infüzyon için son derece reaktif Ag-spesifik T hücreleri çok sayıda in vitro nesil optimal bir yaklaşımdır. Bizim in vitro yöntem iPS hücreleri iPS hücre türetilmiş hücreler, özellikle dört hafta sonra, dört hafta içinde ölmek çok sayıda fonksiyonel dan T hücrelerinin yol açmaktadır rağmen. Bu çentik dan hayatta kalma sinyallerini DL1 hem de IL-7 ve FLt3L iPS hücrelerden türetilen ata T hücrelerinin hayatta kalma korumak için yeterli değildir göre kaynaklı sinyalizasyon olduğu sonucuna, diğer hayatta kalma faktörler bu hücre olgunlaşması düzenlemek için işbirliği olabilir. TCR gen iletimi ve Çentik ligand ile in vitro stimulasyonu büyük ölçüde doğrudan doğruya T hücre farklılaşmasını içinde iPS hücreleri, ancak, iPS hücre-türevli antijen-spesifik T hücrelerinin henüz iPS hücre kaynaklı uygun sayıda elde etmek için önleyen daha fazla hayatta kalma değil, antijen-can ACT-tabanlı immünoterapi için spesifik T hücreleri.

ve_content "> içinde timus T hücrelerinin gelişimi iyi düzenlenmiş bir işlemdir. CD4 ve CD8 eksik olgunlaşmamış timositlerde olarak çift negatif (DN) hücreleri ile verilir. DN öncüleri CD44 göre gelişim alt ayrılır ve CD25:. DN1 (CD44 + CD25 -), DN2 (CD44 + CD25 +), DN3 (CD44 - CD25 +) ve DN4 (CD44 - CD25 -) ile işlevsel TCRβ zinciri yarattı Sadece DN3 hücreleri, hangi çiftleri değişmeyen ön Tα ve CD3 zincir bir ön-TCR oluşturmak üzere daha ileri ve farklılaşması için seçilir. Bu olay, β-seçim olarak adlandırılan, T-hücresi gelişme sırasında birinci kontrol noktası temsil etmektedir. Ön-TCR oluşum sinyalleri yayılması, TCRβ lokus düzenlenmesi sona ermesi ve CD4 DN timositlerin farklılaşması + CD8 + çift pozitif (DP) aşamasında 17. Bizim in vitro stimülasyon wITH Notch ligand DL1 2 hafta içinde β-Seçimi kontrol noktasından geçmesine ve önceden T hücreleri olmak iPS hücreleri sürücüler (CD3 + TCRβ +; CD25 - CD44 -; CD4 - CD8 -). . Ek 2 haftalık bir uyarım içine olgun CD8 + T hücreleri (; -; CD62L + CCR7 + CD27 + CD127 + CD8 + CD3 + CD4 + TCRβ) ve taşıma için önceden T hücreleri sağlar SP olgun T-hücreleri TCR ve CD3 kompleksi ile daha ileri bir uyarım yokluğunda ölecektir.

IPS gelen antijen spesifik CTL in vivo programlama hücreleri ACT-temelli tedaviler için T hücrelerinin yeterli sayıda elde etmek eksikliği üstesinden gelebilir. Tümör büyümesi gözlenen kontrol edilmesine rağmen, TCR gen-transduced iPS hücreleri ile ACT bazı sınırlamalar belirlenmiştir. İlk olarak, in vivo geliştirme için en az altı haftalık t alınan T-hücre farklılaşması için gereklidiriPS hücreleri ransferred. İkincisi, aldığımız TCR-transduced T hücre tabanlı kanser immünoterapi yönetiyor bazı klinik çalışmalarda gözlenen iPS hücreleri. Farelerde kürk kaybı, osteoporoz ve diğer küçük otoimmün bulgular fark Bu etkiler transfer iPS hücrelerinden başka bağışık hücre tiplerinin kuşak tarafından sebep olabilir. Ancak, nasıl bu hücreler in vivo üretilen bilinmemektedir. THR gen-transduced iPS hücrelerin Üçüncüsü, evlatlık transferinden dolayı kök fenotip teratom oluşturma riski vardır. / - - Ama bugüne kadar bizim çalışmamızda, biz sadece bir Rag1 içinde extrathymic kitle tespit fare ve konvansiyonel C57BL / 6 farelerde anormallik rastlanmamıştır. Bu nedenle, maksimum verim elde etmek, önermek, in vivo iPS farklılaşma genetik arka plan maçı almak daha iyidir.

EKH türevlerinin aksine, iPS hücreleri farklılaşan bir anormal hücrelerde gen ekspresyonunu potentia sahipsinjenik alıcı 18, T hücre-bağımlı bağışıklık tepkisinin uyarılmasından önce olduğu l. Bu otolog hücrelerin herhangi bir klinik uygulama düşünülen önce bu nedenle, hastaya özgü iPS hücreleri, elde edilen hücre immünojenitesi değerlendirilmelidir. IPS hücrelerden türetilen hücrelerin gen ekspresyonunun özellikleri analiz ederek, 9, bir gen grubu (Hormad1, Zg16, Cyp3a11, Lce1f, Spt1, Lce3a, Chi3L4, Olr1, RETN) anormal derecede yüksek düzeylerde eksprese olduğu görülmüştür . Buna ek olarak, ES hücreleri bu genlerin üç (Hormad1, Zg16 ve Cyp3a11) arasında indükleyici anlamlı ölçüde genetik olarak uyumlu alıcıya 18 içine transplantasyon ile ilgili immünojenite artmıştır. Böylece, 9 protein grup adoptif transferden sonra hücre iPS türetilmiş hücreler bağışıklık reddine neden olma potansiyeline sahiptir ve immünojenik belirteçler temsil edebilir. Hücre-de Bununla birlikte, olası immünojenitesi iPSrived T lenfositleri tespit edilmemiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz sağlamak için Dr Shinya Yamanaka (Kyoto Üniversitesi) teşekkür iPS-MEF-Ng-20D-17 hücre hattı, OT1-2A destekleyen Dr Dario Vignali (St Jude Çocuk Araştırma Hastanesi) • pMig II yapı, Dr Juan Carlos PÇ9-DL1 hücre hattı destekleyen Zuniga-Pflucker (İmmünoloji Bölümü, University of Toronto), ve bu çalışmanın tasarımı yardım için Dr Kent E Vrana (Farmakoloji Anabilim Dalı, Tıp Penn State Üniversitesi). Bu proje Ulusal Kanser Enstitüsü, Barsumian Güven ve Melanom Araştırma Vakfı (J. Şarkısı) adlı Hibe Numarası K18CA151798 ile hibe altında finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 000664
B6.129S7-Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 002216
Anti-CD3 (2C11) antibody BD Biosciences 553058
Anti-CD28 (37.51) antibody BD Biosciences 553295
Anti-CD3 (17A2) antibody BioLegend 100202
Anti-CD4 (GK1.5) antibody BioLegend 100417
Anti-CD8 (53-6.7) antibody BioLegend 100714
Anti-CD25 (3C7) antibody BioLegend 101912
Anti-CD44 (1M7) antibody BioLegend 103012
Anti-CD117 (2B8) antibody BioLegend 105812
Anti-TCR-β (H57597) antibody BioLegend 109220
Anti-IL-2 (JES6-5H4) antibody BioLegend 503810
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody BioLegend 505822
DMEM Invitrogen ABCD1234
α-MEM Invitrogen A10490-01
FBS Hyclone SH3007.01
Brefeldin A Sigma-Aldrich B7651
Polybrene Sigma-Aldrich 107689
GeneJammer Integrated Sciences 204130
RNA kit Qiagen 74104
DNA kit Qiagen 69504
CD8 Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-095-236
ACK lysis buffer Lonza Inc. 10-548E
mFlt-3L PeproTech Inc 250-31L
mIL-7 PeproTech Inc 217-17
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
FITC-anti-OVA antibody Rockland Immunochemicals 200-4233
Permeabilization buffer Biolegend 421002
BSA Sigma-Aldrich A7906
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
0.4 μm filter EMD Millipore
Moflo Cell Sorter Dako
Calibur Flow Cytometer BD Biosciences
LSR II Flow Cytometer BD Biosciences
Mouse restrainer Braintree Scientific, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, M. K., Heslop, H. E. Adoptive T cell therapy of cancer. Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).
  2. Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
  3. Seki, Y. IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs. J. Immunol. 178, 262-270 (2007).
  4. Stemberger, C. A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets. Immunity. 27, 985-997 (2007).
  5. Siewert, C. Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells. J. Immunol. 180, 146-155 (2008).
  6. Wang, L. X., Plautz, G. E. Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure. J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).
  7. Hinrichs, C. S. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117, 808-814 (2011).
  8. Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution. Blood. 105, 4583-4589 (2005).
  9. Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).
  10. Zhao, Y. Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling. Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).
  11. Boztug, K. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. N. Engl. J. Med. Med, N. .E. ngl.J. . 363, 1918-1927 (2010).
  12. Peerani, R., Zandstra, P. W. Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering. J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).
  13. Mendez-Ferrer, S. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  14. Daley, G. Q. Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).
  15. Boitano, A. E. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329, 1345-1348 (2010).
  16. Himburg, H. A. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat. Med. 16, 475-482 (2010).
  17. Tanigaki, K., Honjo, T. Regulation of lymphocyte development by Notch signaling. Nature immunology. 8, 451-456 (2007).
  18. Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474, 212-215 (2011).

Tags

Hücre Biyolojisi Sayı 63 Stem İmmünoloji T hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücreleri farklılaşma Notch sinyali T hücre reseptörü evlatlık hücre transferi
T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, … More

Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (63), e3986, doi:10.3791/3986 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter