Summary
A CD4 numaralandırma yöntemi, α-testi, hızlı ve doğru CD4 sayımları sağlamak üzere tam tükürük kullanan tarif edilmektedir. Α-test maliyetleri pennies ve bu monoklonal antikorlar, enstrümantasyon, soğutma, numunelerin taşınması gibi toplama ve kan işleme gibi teknik eğitim, pahalı reaktifler için gereksinimini ortadan kaldırır.
Abstract
HIV hastalığı izlemek için uygun fiyatlı CD4 sayımı için acil bir ihtiyaç vardır. CD4 sayımı kan hücreleri, sadece şu anda kabul edilebilir bir yöntem üzerinde CD4 ölçmek için özellikle monoklonal antikorlar zaman ve sıcaklık sınırlamaları, teknik gelişmişliği ve reaktiflerin maliyeti nedeniyle kaynak sınırlı bölgelerde, ulaşamayacağı. Yaygın olarak kullanılan bir maliyet tasarrufu ve zaman tasarrufu sağlayan laboratuvar stratejisi yerine tedbir bazı kan değerlerinin daha hesaplamaktır. Örneğin, LDL düzeyleri total kolesterol, HDL, trigliseritler ve 1 ölçülen seviyeleri kullanılarak hesaplanır. Bu nedenle, doğrudan CD4 + T hücre sayısı CD4 hesaplanması için doğru bir yöntem sağlayabilir regüle hücre içermeyen ögelerinden tanımlama ögelerinden fizyolojik ilgisi nedeniyle sayılır.
Kan girin ve CD4 + T hücreleri dolaşımdaki olmaya yazgılı olan kök hücrelerin sayısı bir kemokin CXCL12 tarafından belirlenirnd reseptörü lokomosyon 2 üzerindeki etkisi nedeniyle CXCR4. Kana kök hücre hareketin süreci ayrıca hücre yüzeyinde insan lökosit elastaz (HLE CS) ve HLE CS-reaktif aktif α 1 proteinaz inhibitörü (α 1 PI, α 1 antitripsin, SerpinA1) 3 ile düzenlenir. HIV-1 hastalığı, α 1 PI hastalığı süreçler 4 gerçekleşmemesinden dolayı inaktive edilir. HIV-1 hastalığının erken asemptomatik kategoride, aktif α 1 PI arıtılmamış, HIV-1 hasta (medyan = 12 uM ve semptomatik kategoriye 4, 5 sırasında normal düzeyinin elde edilmesi için% 100 olarak normalin altında olduğu bulunmuştur. Bu desen değil yetersiz sentezi, proteolitik inaktivasyon veya oksijenasyonu, bağışıklık inaktivasyon atfedilmiştir. Biz> 220 CD4 hücre / ul HIV-1 kişilerde, CD4 sayısı (r 2 aktif α 1 PI serum düzeyleri ile ilişkili olduğu görüldü = 0.93, p < 0.0001, n = 26) ve inaktif α 1 PI (r 2 = 0.91, p <0.0001, n = 26) 5. HIV-1 enfekte olan ve olmayan konulara α 1 PI İdaresi α 1 PI CD4 sayısının düzenleyen katılır + T hücreleri kan 3 düşündüren CD4 sayısı dramatik artış ile sonuçlanmıştır.
Stimülasyon ile, tüm tükürük aktif α 1 PI ve bu ölçüm korelasyon ölçümü bunu CD4 sayıları hesaplamak doğru bir yöntem olduğunu kanıtlayan izin vermek için yeterli seröz eksuda (plazma tükürük içine kan damarı duvarlarının geçer proteinli madde içeren) içerir. Kısaca, bu sakız veya sitrik asit gibi sialogogues tüm ağız tükürük içine serum eksudasyon uyarır. Serum eksudasyon uyararak sonra, tükürük serum α 1 PI aktivitesi elastaz aktivitesini inhibe etme kapasitesi ile ölçülür. Domuz pankreatik elastaz (KKE)elastaz bir hazır ucuz bir kaynağıdır. PPE kendine özgü substratlar, kolorimetrik peptid bir tanesi, sukinil-L-Ala-Ala-L-L-Ala-p-nitroanilid (SA yarma gelen PPE önleyen bir bire-bir kompleks oluşturarak α 1 PI bağlanır 3 NA). Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PPE bir satüre konsantrasyonu ile kuluçkaya tükürük tükürük tüm aktif α 1 PI için KKD'nin bağlayıcı sağlar. Aktif α 1 PI KKD'nin edilen inhibisyon PPE substrat SA 3 NA. (Şekil 1) eklenmesi ile ölçülebilir. CD4 sayımları kan hacmi (CD4 hücre / ul) cinsinden ölçülür rağmen, tükürük α 1 Pİ konsantrasyonu hacmi gün ve kişi süresince önemli ölçüde değişebilir değil tükürük hacmi beri, tükrük serum konsantrasyonu ile ilgilidir 6 kişi için. Ancak, tükürük neredeyse tüm protein serum içeriği nedeniyle ve tükürük protein içeriği mea olduğunu7 surable. Böylece, tükürük aktif α 1 PI tükürük protein içeriği bir oranı olarak hesaplanır ve α 1 PI Endeksi denir. Sonuçlar burada α 1 PI Endeksi CD4 sayıları hesaplamak için doğru ve kesin fizyolojik bir yöntem sağladığını göstermiştir sundu.
Protocol
1. Taze Çalışma Çözümler hazırlayın
- TBS: 0.05 M Tris Salin, pH 7.8 (TBS) Tamponlu. 60 ml TBS / mikroplak hazırlayın.
- KKE: Domuz pankreatik elastaz, tip 1 (PPE) bir süspansiyon olarak sağlanmıştır. Iyice çalkalayın ve yaklaşık 0.01 U / ml TBS KKE sulandırın. 6 ml) solüsyonu / mikroplak çalışma hazırlayın.
- SA 3 NA: Sukkinil-L-Ala-Ala-L-L-Ala-p-nitroanilid (SA 3 NA). Dimetil sülfoksit (DMSO) 0.1 M stok SA 3 NA çözeltisi hazırlayın ve -20 ° C'de hemen kullanmak veya saklamak Stok SA 3 NA çözüm TBS içinde 1/100 sulandırarak 6ml çalışma çözüm / mikroplak hazırlayın.
- Coomassie MAVİ: TBS% 10 Coomassie Brillant Blue R-250 (Coomassie Mavi) bir stok çözeltisi hazırlayın ve -20 ° C'de hemen veya depoyu kullanın TBS içindeki stok solüsyonu 1/1000 seyreltilmesi ile 6 ml çalışma çözeltisi hazırlayın.
2. Tükürük hazırlayın
3. Mikroplaka Set-up
- ÖRNEKLER: her bir test için de, 150 ul / kuyucuk bir son hacim 20 uL tükürük eklenir. Kabarcıklar tanıtma olmadan pipetleme ile karıştırın.
- KONTROLLER: Pozitif kontrol KKD içerir, ancak tükürük. Negatif kontrol tükürük içerir, fakat herhangi bir PPE.To pozitif kontrol de 20 uL TBS eklenir. Negatif kontrol etmek de 20 uL tükürük eklenir.
- KKE KULUÇKA: KKD çalışma çözümü iyice çalkalayın. De negatif kontrol kuyuları hariç her 50 uL KKE çalışma solüsyonu eklenir. Negatif kontrol kuyuları için, 50 uL TBS ekleyin. 23 ° C'de 10 dakika inkübe
- SUBSTRAT KULUÇKA: Her bir kuyuya 50 uL SA 3 NA çalışma çözeltisi ekleyin. 23 ° C'de 45 dakika inkübe
- Coomassie MAVİ:. 50 uL Coomassie Mavi çalışma çözüm Ekle </ Li>
- OKUMA: mikroplaka okuyucu absorbans, aktif α 1 PI ve protein içeriği temsil Coomassie Mavi algılamak için bir 595 nm temsil SA 3 NA bölünme algılamak için bir 405 nm okuyun.
4. Α 1 PI Endeksi hesaplayın
- ORTALAMA BİR 405 nm VE 595 nm normalleştirmek: Her üç nüsha için, ortalama hesaplamak. Numune ortalama Negatif Kontrol ortalama çıkarın. Plaka-to-plaka değişimi en aza indirmek için, aşağıdaki gibi Pozitif kontrol ortalama her Numune ortalama bölerek ortalama normalize:
- Α 1 PI INEX HESAPLAYIN: normalize A 595 nm ile 405 nm bir normalize bölün:
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Endemik, kaynak sınırlı bölgelerde CD4 sayısı izlemek için bir nokta-bakım tarama testi olarak α-test kullanımı için uygun olup olmadıklarını belirlemek için, uyarılmış tükürük 20 kadın toplandı ve 11 erkek HIV-1 konular katılıyor kliniği için Kamerun rutin bakım. New York'ta toplanan tükürük kullanarak α-testinin geliştirilmesi sırasında ön gözlemler ile tutarlı, tükürük α 1 PI Endeksi CD4 sayısı (r 2 = 0.91, p <0.0001. N = 31) ile korele Kamerun toplanır. Ilişki bir doz-yanıt ilişkisi (Şekil 2A) ile tutarlı bir 3-parametreli sigmoidal eğri olarak tanımlandı. % 95 güven ve tahmin aralıkları sırasıyla mavi ve kırmızı çizgiler, (Şekil 2B) ile birlikte tasvir edilmektedir.
Içindeönceki bir çalışmada, CD4 + T hücreleri dönemsellik 23 sinüs bisiklet ± HIV-1 dersten ve α 1 PI eksikliği (Pizz) 3 miras versiyonu olan olgularda 3.5 gün sergilediği belirlenmiştir. Tasvir burada 27 gün periyodisite (Şekil 3A) sergileyen olmayan bir HIV-1 Sağlıklı kontrol bisiklet CD4, bilgisayar tarafından üretilen sinüs eğrisi analizi temsili bir örnektir.
CD4 Bilgisayar oluşturulan sinüs eğrisi analizi + 6 konularda T hücre değişiklikleri salınım 3 tepe-tepeye genlik ve eksen değerlerini vermiştir. Beklendiği üzere, salınım ekseni genlik (r 2 = 0.96, p = 0.009, n = 6) (Şekil 3B) ile korele idi. Hastalarda olacak düşük CD4 + T hücre sayısı, CD4 T hücre sayısı siklik değişiklikler küçüktü ve yüksek CD4 + T hücre sayısı olan hastalarda, siklik değişiklikler büyüktü.
ÇünküŞekil 2 içinde gösterildiği regresyon hattı salınımı ve salınım ekseninin ekseni amplitüd bağlı olarak değişebilir etmek ve böylece regresyon hattı CD4 + T hücreleri beklenir ne kadar yukarıda ve aşağıda tahmin regresyon çizgisi için hesaplanan edilebilir, amplitüd ile ilişkilidir tahmin bisiklet (Şekil 3C). Şekil 3C ve Şekil 2B hesaplanan güven aralığı hesaplanan genlik overlaying, genlik (yeşil hat)% 95 içinde yer olduğu tespit edilmiştir güven aralığı (mavi çizgi) (Şekil 3D).
Şekil 1.. Prosedür Özet: ağızda Yeri sitrik asit ve tükürük toplamak. Üçlü bir mikroplaka kuyu için seyreltilmiş tükürük ekleyin. Her oyuğa PPE ekleyin ve 23 ° C'de 15 dakika süreyle inkübe Her oyuğa PPE substrat ekleyin ve 23 ° C'de 45 dakika süreyle inkübe. Coomassie Mavi ekleyin ve PPE aktivite tespit etmek ve 595 nm de proteini tespit etmek için 405 nm de okunur.
Şekil 2. Standart CD4 numaralandırma yöntemi ile α-testi karşılaştırılması. A) α-test uyarılan tüm ağız tükürük α 1 PI Endeksi miktarlarının tarafından yapıldı. CD4 sayısı standart akım sitometri kullanılarak bağımsız bir tıbbi laboratuvar tarafından yapıldı. Akım sitometri ve tükürük için kan aynı klinikte ziyaret toplandı. Α 1 PI Endeksi ve CD4 sayıları arasındaki ilişki, bir 3-parametreli sigmoidal eğrisi (r 2 = 0.91, p <0.0001, n = 31). B)% 95 güven aralıkları ve tahmini mavi ve kırmızı olarak tasvir edilmektedir tanımlandı sırasıyla hatları,.
Şekil 3. CD4 c hesaplama Doğrulukα1PI Index.A kullanarak ounts) CD4 + T hücreleri olmayan bir HIV-1 sağlıklı kontrol 27 günlük periyodik sinüs bisiklet sergiledi. Salınım ekseni tasvir edilir (kırmızı noktalı çizgi). B) T hücre bisiklet 4 HIV-1 kişilerde salınım peak-tepe genliği ve eksen hesaplamak için kullanılan CD4, 1 sigara HIV Bilgisayar üretilen sinüs dalga analizi -1 Pizz konu ve parçası A. CD4 arasındaki ilişkiyi tasvir olmayan HIV-1 sağlıklı kontrol T + hücre genlik ve salınım ekseni 3-parametreli sigmoidal eğrisi (r 2 = 0.96, p = 0.009, n kabul edildi = 6). C) parçası B) 'de elde edilen salınım genlik ve ekseni arasındaki ilişkiyi sigmoidal Şekil 2 den regresyon hattı (siyah çizgi) boyunca nokta, beklenen amplitüd (yeşil hatlar) hesaplamak için kullanılmıştır. GE) beklenen amplitüd aralığı (yeşil hat)% 95 güven aralığı (belirgin olarak farklı bulunduolarak Mann Whitney Rank Sum Testi ve genlik hattı ve regresyon hattı (37 hücreleri arasındaki ortalama fark (% 95 güven aralığı ve regresyon hattı (63 hücre / ml arasındaki ortalama fark karşılaştırılmasına dayanarak) tarafından belirlenen mavi çizgiler) / ml), p = 0.001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Seyreltilmemiş Serum median 36 mM içeren α 1 PI ve 3.6 mM α 2 makroglobulin (α 2 M) 10 kat farkı 8. Her iki protein KKD bağlanmak için yarışırlar. Bu iki özellik, konsantrasyon ve PPE yakınlığı, özellikle α 2 M 8 rakip varlığında, normal serum α 1 PI ölçebilen bir yöntem geliştirmek için istismar edilmiştir. Bu yöntem,% 0.3 serum az 50 nM μ 1 PI algılayabilir. % 2,5 serum dilüsyonunda, KKD'ler için α 2 M bağlayıcı saptanamaz hale gelir ve bu seyreltme hakkında 900 nM α 1 PI ve 90 nM α 2 M. içerir
Α 2 M, tüm ağız tükürük bir 20 kat daha fark, 9. içerir den 10 kat daha fazla α 1 PI oluşur serum aksine. Biz, sulandırılmadan olduğu bu çalışmada uyarılmış tükürük bulunduserum veya yaklaşık 1200 nM α 1 PI göre yaklaşık 30 kat daha az α 1 PI içerir ve yaklaşık 60 nM α 2 M. içermesi beklenir Α-testi için optimum tükürük dilüsyon 13% uyarılmış tükürük olduğu bulunmuştur ve bu seyreltme yaklaşık 160 nM içermesi beklenebilir α 1 PI ve 8 nM α 2 M, aşağıda eşik α 2 M lik bir derişimde protokolde tespit. Α 2 M düşük konsantrasyon nedeniyle, doğru bir α 2 M. rekabet için endişe olmadan tükürük α 1 PI spesifik aktivite belirlemek mümkündür Tükürük aktif α 1 PI ve protein ölçümleri CD4 sayısı, flow sitometri ölçmek için standart yöntem ile korelasyon bulunmuştur α 1 PI Endeksi hesaplama izin verdi. Önemlisi, regresyon analizi sonuçları (r CD4 sayım yöntemleri daha önce dikkate bisiklet nedeniyle varyasyonu almamış. Pratik açıdan, CD4 sayıları 23-27 gün periyodik Nadir ve tepe arasındaki kadar 200 hücre / ul değişebilir ve bu 3 CD4 + T hücreleri ölçmek için ne olursa olsun yöntemi geçerlidir. Salınım ekseni saat, hafta hafta sürekli saat olduğundan Böylece, salınım sinüs dalgası ekseni bireyin gerçek CD4 daha doğru bir ölçü + tek bir günün tedbiri olmaktan T hücre sayısı sağlar. Doğrudan bir kişinin CD4 + T hücreleri için salınım ekseni ölçmek için uygun olmayabilir iken, bu beklenen genlik aşmayan CD4 sayısı boyuna CD4 + ortalama varyasyon sürece T hücre sayıları kullanılarak tahmin edilebilir. Büyük değişimCD4 sayısı s bisiklet dışındaki değişkenlerin etkisi işaret eder. Şekil 2 içinde gösterildiği regresyon hattı salınım ekseni bir tahminidir. Regresyon çizgisi üstünde ve altında beklenen genlik hesaplanması genliği% 95 güven aralığı içinde olduğunu gösterdi. % 95 güven aralığı ve regresyon hattı arasındaki ortalama fark 63 CD4 hücre / ml, ve genlik ve regresyon çizgisi arasında ortanca fark 37 CD4 hücre / ml olduğunu. Bu CD4% 95 bu fark yaklaşık% 58 CD4 bisiklet nedeniyle olacak yaklaşık 63 CD4 hücreleri / gerçek CD4 sayımları gelen ul içinde ve bu olacaktır α-testi hesaplandı sayar anlamında yorumlanabilir. Böylece, α-test hassas güven aralığı ve yaklaşık 26 CD4 hücre / ml olan genlik arasındaki mesafe, ve α-testin doğruluğunu korelasyon coefficie olduğunu0.95 veya% 95 regresyon çizgisinin nt. Vardır, burada tarif edildiği gibi α-testi için çeşitli sınırlamaları vardır, ancak çözümler kolaylıkla temin edilebilir. Örneğin, bile tarif α-testi bir mikroplaka formatı kullanan, bir tek tükürük seyreltme kullanılarak α-testi yapmak yeteneği α-testi çubuğu teknolojisi, bir aracı-free, basit bir teknolojik sistemi ile kullanılabilmesini sağlar. Kamerun toplanan tükürük örnekleri yaklaşık% 2 işlemek için çok ağdalı idi ve bu New York City toplanan tükürük ile tutarlıdır. Bu tür örnekler DNase uygulanması sayede ölçümü 10 izin viskozitesi iyileştirmek için kullanılabilir. Ek bir çözüm özellikle böylece sulu tükürük üretiyor parasempatik karşı sempatik yolun aracılığıyla tükürük salgılanmasını uyarmak farmakolojik sialagogues kullanmak olabilir. Böyle bir salya akıtan ilaç pilokarpin 11'dir. Son olarak, α-test yokturt henüz doğrulanmış ve bu performans CD4 sayısı 12 kritik düzeyleri için yeterince ayrımcı olup olmadığını belirlemek için gerekli değil. CD4 sayısı kritik seviyeleri bu değerlerin lineer bir algoritma ile hesaplanmaktadır izin sigmoidal regresyon eğrisinin doğrusal bölgede bulunmaktadır. Bu popülasyonda, değerleri için lineer regresyon <860 CD4 hücre / ml (r 2 = 0.86, n = 30, p <2x10 -7) sigmoidal regresyon (r 2 kadar iyiydi = 0.88, n = 30, p < 0.0001). Yaklaşık 350 CD4 hücre / ml (r 2 = 0.88, n = 15, p = 0.002) sigmoidal regresyon (r 2 = 0.89, n = 15, kadar iyiydi karşılık 67 Yukarıda α 1 PI Endeksleri için lineer regresyon p <0.0001). Ancak, korelasyon <350 CD4 karşılık 67 aşağıda α 1 PI Endeksleri anlamlı bulunmamıştır hücre / ml (r 2 = 0.17, p = 0.54, n = 15). Bu W beri kritik bir değerdirHO kuralları bir CD4 sayısı <350 CD4 hücre / antiretroviral tedavi 13 erişim için hak ul öneririz. Iyi α-test performansını belirlemek ve değerleri daha az duyarlılığı artırmak için, ek bir 800 tükürük örnekleri 4 grup ve Kamerun tahsil edilmektedir: yenidoğan-2 yaş arası, 3-5 yaş ve 6-15 yaş ve 16 yaş ve üzeri. Sonuç olarak, α-testi kandaki CD4 hücreleri sayısı fizyolojik alakalı henüz böylece hiçbir enstrümantasyon ile endemik bölgelerde CD4 sayısı izlemek için noninvazif, doğru ve hassas noktası bakım yöntemi sağlayan tükürük kullanılarak yapılabilir bir dolardan az olan-başı-maliyet testi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Araştırma Harry Winston Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sialogogue, 0.05M citric acid | Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 | Sugar-Free Lemon dropS | |
| Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 | E1250 | |
| Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | S4760 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Tissue culture-treated, 96 well microplates | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 | 35-3072 | |
| Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm | MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 | Dynex P97277 |
References
- Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study. Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).
- Lapidot, T., Petit, I. Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).
- Bristow, C. L. α1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients. Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. Alfano, M. , Bentham Science Publishers. (2010).
- Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).
- Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. α1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease. PLoS One. , Forthcoming (2011).
- de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review. J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).
- Edgar, W. M. Saliva: its secretion, composition and funcitons. Br. Dent. J. , 172-305 (1992).
- Bristow, C. L., Meo, F. di, Arnold, R. R. Specific activity of α1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus. Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).
- Pederson, E. D. Salivary levels of α2-macroglobulin, α1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease. Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. PNAS. 87, 9188-9192 (1990).
- LeVeque, F. G. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients. J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).
- Stevens, W. Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries. Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).
- WHO. 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. , Available from: http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html (2010).
