Alta capacidade mapeamento físico de cromossomos usando Automated In situ Hibridação

Summary

As montagens do genoma baseadas em tecnologias de sequenciamento de DNA massivamente paralelas são geralmente altamente fragmentadas. O desenvolvimento de mapas cromossômicos físicos pode potencialmente melhorar as montagens do genoma. Aqui, demonstramos abordagens inovadoras para preparação cromossômica, hibridização in situ fluorescente e imagens que aumentam significativamente o rendimento do desenvolvimento do mapa físico.

Abstract

Projetos para obter sequências do genoma completo para 10.000 espécies de vertebrados¹ e para 5.000^{espécies de} insetos e artrópodes relacionados 2 devem ocorrer nos próximos 5 anos. Por exemplo, o sequenciamento dos genomas de 15 espécies de mosquitos da malária está sendo feito atualmente usando uma plataforma Illumina^3,4. Este grupo de espécies de Anopheles inclui vetores e não vetores da malária. Quando os conjuntos do genoma estiverem disponíveis, os pesquisadores terão a oportunidade única de realizar análises comparativas para inferir mudanças evolutivas relevantes para a capacidade do vetor. No entanto, provou ser difícil usar leituras de sequenciamento de próxima geração para gerar montagens de genoma de novo de alta qualidade⁵. Além disso, as montagens genômicas existentes para Anopheles gambiae, embora obtidas pelo método de Sanger, são espaçadas ou fragmentadas^4,6.

O sucesso das análises genômicas comparativas será limitado se os pesquisadores lidarem com vários contigs de sequenciamento, em vez de montagens de genoma baseadas em cromossomos. Sequências fragmentadas e não mapeadas criam problemas para análises genômicas porque: (i) lacunas não identificadas causam anotação incorreta ou incompleta de sequências genômicas; (ii) sequências não mapeadas levam à confusão entre genes parálogos e genes de diferentes haplótipos; e (iii) a falta de atribuição cromossômica e orientação dos contigs de sequenciamento não permite reconstruir a filogenia de rearranjo e estudar a evolução cromossômica. O desenvolvimento de mapas físicos de alta resolução para espécies com genomas recém-sequenciados é um investimento oportuno e econômico que facilitará a anotação do genoma, a análise evolutiva e o resequenciamento de genomas individuais de populações naturais^7,8.

Aqui, apresentamos abordagens inovadoras para preparação cromossômica, hibridização in situ fluorescente (FISH) e imagens que facilitam o rápido desenvolvimento de mapas físicos. Usando An. gambiae como exemplo, demonstramos que o desenvolvimento de mapas cromossômicos físicos pode potencialmente melhorar as montagens do genoma e, portanto, a qualidade das análises genômicas. Primeiro, usamos um método de alta pressão para preparar spreads de cromossomos politênicos. Este método, originalmente desenvolvido para Drosophila⁹, permite ao usuário visualizar mais detalhes sobre os cromossomos do que a técnica regular de esmagamento¹⁰. Em segundo lugar, um sistema front-end totalmente automatizado para FISH é usado para mapeamento físico do genoma de alto rendimento. O sistema automatizado de coloração de lâminas executa vários ensaios simultaneamente e reduz drasticamente o tempo de trabalho¹¹. Em terceiro lugar, um sistema automático de imagem fluorescente, que inclui um estágio de lâmina motorizado, digitaliza e fotografa automaticamente os cromossomos marcados após o FISH¹². Este sistema é especialmente útil para identificar e visualizar várias placas cromossômicas na mesma lâmina. Além disso, o processo de digitalização captura um resultado FISH mais uniforme. No geral, o protocolo automatizado de mapeamento físico de alto rendimento é mais eficiente do que um protocolo manual padrão.

Protocol

1. Preparação de cromossomo politênico de alta pressão a partir de células de enfermeira ovariana

1. Dissecar fêmeas de Anopheles semi-grávidas 25 horas após a alimentação sanguínea sob um microscópio de dissecção e fixar os ovários em solução de Carnoy modificada com metanol (100% metanol: ácido acético glacial, 3: 1). Nesta fase, os ovários estão no estágio III de desenvolvimento de Christophers, quando os folículos têm uma forma oval e uma área transparente com células enfermeiras dentro dos folículos tem uma forma redonda¹³. Coloque os ovários de aproximadamente cinco fêmeas em 500 μl de solução de Carnoy modificada em um tubo Eppendorf de 1,5 ml e mantenha-os em temperatura ambiente por 24 horas. Transfira os ovários para -20 °C para um armazenamento de longo prazo.
2. Prepare a solução de Carnoy modificada com etanol (100% etanol: ácido acético glacial, 3:1) e 50% de ácido propiônico antes de fazer as lâminas. Coloque um par de ovários em uma lâmina sem poeira em uma gota de solução de Carnoy modificada. Divida os ovários em aproximadamente 6 seções com agulhas de dissecação e coloque-os em gotas de ácido propiônico a 50% em lâminas limpas sob um estereomicroscópio de dissecação MZ6 Leica. Use um slide separado para cada seção.
3. Separe os folículos dissecando usando agulhas e limpe o tecido restante com papel de filtro ou toalha de papel sob um microscópio de dissecação. Adicione uma nova gota de ácido propiônico a 50% aos folículos e deixe-os descansar por 3-5 minutos em temperatura ambiente. Coloque uma lamínula em cima da gota de ácido propiônico a 50%. Deixe o slide repousar por aproximadamente 1 minuto.
4. Enrole a lâmina com papel de filtro e plástico. Usando uma ferramenta rotativa Dremel 200 com um acessório de eixo flexível e ponta de plástico macio entre 3000-5000 RPM, extraia os folículos girando a ponta em círculos e pressionando levemente a lamínula para espalhar uniformemente os núcleos. Esta etapa deve levar aproximadamente 1 minuto. Verifique a qualidade da propagação com um microscópio de fase Olympus CX41 usando uma objetiva de 20x.
5. Prepare um sanduíche colocando uma lamínula adicional ao lado da lamínula que cobre os cromossomos e cubra-os com uma segunda lâmina de microscópio. Isso reduz a chance de esmagar a corrediça no torno. Enrole as lâminas com uma folha de plástico que vem em recipientes de vidro e papel de filtro para segurar o sanduíche e proteger a lâmina de arranhões devido ao torno.
6. Aplique pressão nas corrediças através de um torno mecânico. Uma pressão de 85-120 polegadas-lbs é suficiente e é alcançada usando uma chave de torque. Esta etapa é necessária para achatar os cromossomos o máximo possível.
7. Remova a segunda lâmina do microscópio e a lamínula adicional. Aquecer a lâmina com a lamínula que cobre os cromossomas a 55 °C num sistema de desnaturação/hibridização das lâminas durante 10-15 minutos para achatar ainda mais os cromossomas. Mergulhe a lâmina em nitrogênio líquido por pelo menos 15 segundos e, quando o borbulhar parar, remova rapidamente a lamínula com uma lâmina de barbear. Coloque imediatamente as lâminas em etanol frio a 50% por 5 minutos. Desidratar lâminas em 70%, 90%, 100% etanol por 5 minutos cada. Secar ao ar livre.

2. FISH usando um sistema automatizado de coloração de lâminas

O programa é configurado com o sistema automatizado de coloração de lâminas Xmatrx para executar as seguintes etapas, exceto a rotulagem da sonda. O protocolo detalhado de rotulagem de tradução de entalhe é descrito na documentação fornecida com a DNA polimerase da Fermentas.

1. Antes do FISH, prepare sondas fluorescentes rotulando o DNA genômico do BAC com um fluorocromo usando um protocolo de tradução de entalhe. Misture 1 μg de DNA, 0,05 mM de dATP, dCTP e dGTP não marcados e 0,015 mM dTTP, 1 μl Cy3- ou Cy5-dUTP, 0,05 mg / ml BSA, 5 μl de tampão de tradução de corte 10x, 20 unidades de DNA polimerase I, 0,0012 unidades de DNase I e água livre de nuclease a 25 μl. A relação DNA polimerase I/DNase I é selecionada empiricamente para obter sondas com uma faixa de tamanho de 300 a 500 pb. Incubar a mistura a 15 °C durante 1 hora.
2. Coloque lâminas e reagentes no sistema automatizado de coloração de lâminas Xmatrx e inicie o programa para executar as etapas a seguir. Aplique 800 μl de 1x PBS por 20 min. Sopre as corrediças com ar. Realize a fixação da formalina aplicando 450 μl de formalina a 4% em 1x PBS por 1 min, seguida de lavagens com etanol a 100% por 1 segundo duas vezes e por 2 min uma vez. Sopre as corrediças com ar.
3. Aqueça as lâminas a 45 °C por 2 min para evitar bolhas ao aplicar as sondas. Aplique 20 μl das sondas de DNA, adicione gotas de óleo mineral para evitar a evaporação de uma solução de hibridização e coloque uma lamínula por cima. Desnature cromossomos e sondas de DNA aquecendo lâminas a 90 ° C por 10 min.
4. Para hibridização, incubar as lâminas a 42 °C durante 14 horas com lamínulas. A solução de hibridização consiste em 2x SSC, 100 mM de fosfato de sódio, 1x solução de Denhardt, 100 μg/ml de azida sódica e 10% de sulfato de dextrano em formamida.
5. Para lavagens rigorosas, aqueça as lâminas a 42 °C por 2 min, remova as lamínulas, lave as lâminas em 2x SSC por 1 segundo 4 vezes. Sopre as corrediças com ar. Aplique 800 μl de 0,4x SSC a 42 °C por 10 min 2 vezes. Lave as lâminas em 2x SSC a 25 °C por 10 min.
6. Realize a coloração cromossômica aplicando 50 μl de 1 μM YOYO-1 em 1x PBS. Aplique gotas de óleo mineral para evitar a evaporação da solução de coloração, coloque lamínulas e incube a 25 °C por 10 min. Remova as lamínulas, lave as lâminas em 2x SSC por 1 segundo 4 vezes. Sopre as corrediças com ar. Aplique 15 μl de reagente antidesbotamento ProLong Gold. Coloque lamínulas.

3. Leitura de slides com um sistema automático de imagem fluorescente

Esta seção detalha o uso do software Duet, que vem de fábrica com o sistema de digitalização automatizado ACCORD PLUS. As instruções começam após ligar nesta ordem: Fonte de alimentação Olympus U-RFL-T para uma lâmpada halógena, computador Dell precision T3500, microscópio Olympus BX61 com uma câmera conectada Olympus U-CMAD3.

1. Para configurar o Pre-Scan 10x, abra o software Duet no sistema de digitalização automatizado ACCORD PLUS. Clique no botão "Online". Insira o novo ID do caso e atribua um ID do slide. Clique no ponto rotulado "BF". Esta é a opção de campo claro. Defina uma opção de digitalização como "10x Prescan". Use "círculo de 2500x", "círculo de 10000x" ou "retângulo". Clique em "Definir e executar" para 10x Pre-Scan.
2. Clique no botão "OK" para executar o 10x Pre-Scan. Siga as instruções para ajustar a digitalização corretamente. Clique em "Concluir" para iniciar a verificação. Pressione a guia "Principal" para voltar à tela principal. Clique no botão "Offline". Encontre o ID do caso e o ID do slide que foram atribuídos e clique em "Verificação offline". Na caixa preta na área superior esquerda, clique em uma seta e selecione "10x Prescan". Usando as setas (< || Δ > também conhecidos como botões "voltar", "pausar", "reproduzir", "avançar"), percorra as imagens digitalizadas.
3. Depois de encontrar uma imagem de interesse, clique duas vezes na tela no meio da região de destino e pressione "Snap". Isso terá como alvo uma imagem para captura posterior. Depois de selecionar todos os alvos, clique em "Classificar". Selecione "10x Prescan". Clique com o botão direito do mouse em uma imagem e tenha a chance de classificá-las. Selecione "Politeno".
4. Configure o 40x Pre-Scan no software Duet. Clique em "Principal" para voltar ao menu principal. Selecione "Online" novamente. Selecione um slide. Altere "BF" para "FL". Altere o nome da tarefa para "Revisit-X40-RG". Altere a seção logo abaixo da última configuração para "Revisit-ALL". Clique em "Definir e executar". Pressione "OK". Siga as instruções novamente para configurar a automação. Clique no botão "Iniciar visualizações correspondentes" para corresponder imagens 10x e 40x. Clique em "Concluir" para iniciar a verificação. Feito isso, clique em "Classificar" e veja as imagens.

4. Resultados representativos

A Figura 1 descreve graficamente o esquema da preparação cromossômica de alta pressão. Esta etapa envolve o processo de esmagamento e achatamento de cromossomos usando uma ferramenta Dremel e torno mecânico, bem como a visualização cromossômica usando um microscópio de contraste de fase. A Figura 2 ilustra a hibridização de uma sonda marcada com fluorescência para direcionar o DNA nas preparações de lâminas cromossômicas usando um sistema automatizado de coloração de lâminas, o uso de um microscópio de varredura automatizado para visualizar e mapear as sondas após o experimento FISH e colocar e orientar andaimes genômicos nos cromossomos.

Preparações de cromossomos politênicos de células de enfermeira ovariana de fêmeas de An. gambiae foram feitas usando a técnica de alta pressão. Este método não danifica ou altera a maior parte da estrutura cromossômica (Figura 3). Ele achata os cromossomos dobrados e, portanto, revela faixas finas ocultas que não são vistas em preparações regulares (Figura 4).

As sondas usadas neste protocolo são clones genômicos de DNA BAC obtidos de uma biblioteca ND-TAM BAC gerada a partir do DNA da cepa PEST de An. gambiae. O DNA genômico para esta biblioteca foi extraído de larvas de primeiro ínstar recém-eclodidas de ambos os sexos. A Figura 5 mostra os resultados de FISH usando clones BAC hibridizados com cromossomos politênicos de An. gambiae. Este procedimento foi realizado usando o sistema automatizado de coloração de lâminas Xmatrx. Usando um fotomapa citogenético para An. gambiae¹⁰, dois clones de BAC, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) e BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), foram localizados nas subdivisões 16C e 16D do braço 2R, respectivamente. No entanto, a pesquisa BLAST contra a cepa Pest de An. gambiae AgamP3 assembly ¹⁴ identificou as sequências homólogas a 102B24 e 142O19 nas subdivisões 16B e 17A do braço 2R, respectivamente (Tabela 1). Portanto, a correspondência entre as coordenadas genômicas e as subdivisões citogenéticas pode agora ser ajustada de acordo com nossos dados de mapeamento. A pesquisa BLAST contra os conjuntos de genoma da forma M e da forma S de An. gambiae descobriu que os dois clones BAC estão localizados em contigs diferentes, mas nos mesmos andaimes dentro de cada forma (Tabela 1). Os contigs identificados agora podem ser associados a localizações cromossômicas específicas. Além disso, os andaimes identificados podem agora ser devidamente orientados dentro das subdivisões citológicas 16CD. Curiosamente, as distâncias entre as sequências 102B24 e 142O19 nos andaimes são 1.892.981 pb, 1.658.391 pb e 1.688.426 pb nas montagens do genoma da cepa PEST, forma M e forma S, respectivamente. Como a cepa PEST é um híbrido entre as formas M e S, essa diferença provavelmente se deve à montagem incorreta do genoma PEST.

BAC
(adesão) PEST-cepa
AgamP3

Coordenadas Forma M
contigs

Coordenadas Forma M
andaimes

Coordenadas Forma S
contigs

Coordenadas Forma S
andaimes

Coordenadas 102B24
(BH372694) 2R:AAAB0100
8844_26 (16B)

43.681.342-
43.681.874 ABKP020247
53.1

32.513-
33.045 EQ090167.1

1.858.377-
1.858.909 ABKQ010123
32.1

4.299-
4.832 EQ099711.1

215.891-
216.424 102B24
(BH372701) 2R:AAAB0100
8844_28 (16B)

43.788.213-
43.788.969 ABKP020247
51.1

24.816-
25.575 EQ090167.1,

1.772.683-
1.773.442 ABKQ010123
35.1

27.782-
28.540 EQ099711.1,

305.514-
306.272 142O19
(BH368698) 2R:AAAB0100

8805_5 (17A)
45.428.580-
45.429.264 ABKP020247
01.1

2.499-
3.185 EQ090167.1

315.806-
316.492 ABKQ010123
76.1

49.242-
49.942 EQ099711.1

1.791.625-
1.792.325 142O19
(BH368703) 2R:AAAB0100
8805_8 (17A)

45.560.099-
45.574.323 ABKP020220
17.1

30.971-
32.469 EQ090167.1
200.518-
202.016 ABKQ010123
79.1

27.760-
28.508 EQ099711.1

1.903.569-
1.904.317

Tabela 1. Resultados BLAST das sequências de terminação BAC contra as montagens do genoma de An. gambiae.

Figura 1. Representação esquemática da preparação cromossômica de alta pressão. Os ovários do mosquito são mostrados no estágio correto de desenvolvimento.

Figura 2. Um esquema que representa FISH automatizado, varredura de lâminas e mapeamento cromossômico de andaimes genômicos.

Figura 3. Uma disseminação do cromossomo politênico 3 de An. gambiae obtida usando a técnica de alta pressão. 3L e 3R marcam os braços esquerdo e direito em seus telômeros. PH e IH indicam heterocromatina pericêntrica e intercalar, respectivamente.

Figura 4. Comparação de cromossomos politênicos de An. gambiae preparados usando a técnica tradicional (superior) e de alta pressão (inferior). As imagens cobrem as subdivisões 29A-30E do braço 3R (A) e 43D-46D do braço 3L (B).

Figura 5. FISH de clones BAC para cromossomos politênicos de An. gambiae. A) Hibridização de 102B24 (sinal vermelho) com o braço 2R. B) FISH de duas cores de 102B24 (sinal vermelho) e 142O19 (sinal azul) para as subdivisões 16C e 16D do braço 2R esticado, respectivamente. As setas indicam sinais de hibridização de clones BAC marcados com Cy3 (vermelho) e Cy5 (azul). C-a região centromérica. a/+ mostra a inversão heterozigótica 2La. Os cromossomos foram contracorados com o fluoróforo YOYO-1.

Discussion

A etapa mais crítica do procedimento de alta pressão é o esmagamento adequado das células da enfermeira ovariana isoladas no estágio III de desenvolvimento ovariano de Christopher¹³. O esmagamento inadequado pode levar a cromossomos insuficientemente espalhados, o que pode causar problemas ao tentar determinar os locais da sonda após o FISH. Se os cromossomos forem esmagados demais, eles podem ser quebrados ou alongados a ponto de perderem os padrões de bandas. A produção de várias lâminas deve levar a uma consistência ao tentar esmagar as lâminas usando a ferramenta Dremel, o que aumentará a eficiência geral da produção de lâminas. A técnica de alta pressão foi desenvolvida pela primeira vez para glândulas salivares recém-isoladas de D. melanogaster⁹. No entanto, os ovários dos mosquitos são rotineiramente preservados em solução fixadora de Carnoy modificada (3 metanol: 1 ácido acético glacial por volume) antes de serem usados para preparações cromossômicas. Portanto, modificamos o protocolo de alta pressão existente para torná-lo adequado para os cromossomos politênicos fixos de células enfermeiras ovarianas do mosquito da malária An. gambiae. Como a alta pressão é aplicada usando um torno de precisão que possui uma superfície de trabalho altamente paralela de toda a lâmina, leva significativamente menos tempo para preparar a abóbora cromossômica do que usar uma técnica tradicional de rosqueamento com uma borracha de lápis.

Outras etapas importantes incluem embeber suficientemente os folículos em ácido propiônico a 50% e aquecer a lâmina. Ambas as etapas são essenciais para ajudar a achatar os cromossomos. Se forem negligenciados, os cromossomos podem parecer brilhantes após a desidratação, o que potencialmente leva a uma superabundância de fundo que pode ser confundida com um sinal em FISH. A técnica de esmagamento de alta pressão também funciona bem usando as mesmas soluções ao fazer preparações de cromossomos mitóticos. O espalhamento e achatamento adicionais ajudam a expressar melhor os cromossomos de seus núcleos. A adição de pressão igual deve achatá-los de acordo para permitir medições e potencialmente melhor resolução das bandas visíveis da coloração. Os detalhes sobre o isolamento de cromossomos mitóticos de mosquitos são fornecidos em outro lugar¹⁵. Embora as preparações regulares de abóbora sejam suficientes para muitos propósitos, incluindo FISH ¹⁶ e imunocoloração¹⁷, o método de alta pressão não apenas reduz a variação potencial de uma lâmina para outra, mas também aumenta a qualidade geral do cromossomo, levando a mais detalhes ao mapear cromossomos. Este procedimento também pode ser usado para preparar lâminas de membrana cromossômica politênica para microdissecção por captura a laser.

As limitações do método de alta pressão incluem quebra de lâmina e alongamento excessivo dos cromossomos. A quebra da corrediça causada pela colocação de muita tensão na corrediça através do torno é possível, mas é limitada pelo uso das pressões indicadas no artigo. Para alongamento excessivo dos cromossomos, se a ferramenta Dremel for aplicada ao slide por um longo período de tempo, existe a possibilidade de que os cromossomos fiquem muito esticados e percam a resolução. Isso pode ser remediado aplicando a ferramenta por um breve período de tempo, verificando ao microscópio e aplicando mais tempo com a ferramenta Dremel se os cromossomos estiverem insuficientemente espalhados.

Um protocolo FISH tradicional inclui uma série de etapas de lavagem e incubação, que geralmente duram de 5 a 20 minutos e requerem atenção quase total de um pesquisador durante toda a duração do experimento. Além disso, o número de lâminas que podem ser manipuladas manualmente geralmente é limitado a algumas lâminas em um determinado experimento. Em contraste, um sistema automatizado de coloração de lâminas executa todas as etapas (incluindo lavagem, incubação, aplicação de sonda, desnaturação, hibridização, aplicação e remoção de lamínula) automaticamente. Isso libera de 6 a 8 horas de trabalho para um pesquisador em um experimento FISH. Além disso, um sistema FISH automatizado pode aumentar significativamente o rendimento. Por exemplo, o sistema Xmatrx é capaz de processar até 40 ensaios em lâminas de preparação simples e até 80 ensaios em lâminas de preparação duplas simultaneamente. Entre as limitações deste sistema está o fato de não ser eficiente para um pequeno número de experimentos FISH, pois requer a preparação de grandes volumes de soluções. Além disso, o protocolo FISH programado no sistema pode exigir modificações e ajustes para novas aplicações.

Um sistema de varredura de lâminas é uma versão automatizada de um microscópio fluorescente. A movimentação automatizada da platina e um painel de controle de microscópio simples liberam o tempo do pesquisador e tornam a operação do microscópio extremamente simples. Por exemplo, o software no sistema de digitalização ACCORD PLUS permite a captura fácil de vários canais de fluorescência e a aquisição de imagens fácil de gerenciar. Um exemplo disso é a inclusão da captura z-stack, em vez de tirar uma única imagem; O software captura uma pilha z configurável de imagens para garantir que pelo menos uma imagem permaneça em foco. Embora esse sistema seja feito mais para aquisição de várias imagens (muitas células em uma única lâmina), ele ainda torna a localização de cromossomos na lâmina muito mais fácil do que navegar pela lâmina manualmente.

Tanto o sistema automatizado de coloração de lâminas quanto o sistema de varredura são usados rotineiramente para diagnósticos FISH de anormalidades cromossômicas em células humanas por clínicas de citogenética. Neste estudo, desenvolvemos um protocolo que utiliza esses sistemas automatizados para uma aplicação de pesquisa básica. O protocolo automatizado de mapeamento físico de alto rendimento pode facilitar o rápido desenvolvimento de mapas cromossômicos físicos para qualquer espécie de interesse. Embora, neste relatório, tenhamos usado cromossomos politênicos para mapeamento físico, cromossomos mitóticos também podem ser utilizados com esses sistemas. Seria útil que o protocolo fosse ajustado aos cromossomos mitóticos porque a maioria dos organismos não desenvolve cromossomos politênicos legíveis. No entanto, os cromossomos politênicos, quando disponíveis, podem fornecer informações úteis sobre a correspondência dos domínios funcionais do genoma com a estrutura cromossômica na resolução mais alta. Os princípios organizacionais dos cromossomos politênicos, como padrões de bandas e interbandas, foram recentemente comparados aos dos cromossomos não politênicos regulares (interfase)¹⁸. Portanto, o mapeamento físico detalhado realizado em preparações cromossômicas de alta pressão tem o potencial de vincular sequências de DNA a estruturas cromossômicas específicas, como bandas, interbandas, puffs, centrômeros, telômeros e heterocromatina; assim, criando montagens de genoma baseadas em cromossomos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lamínulas de microscópio de 22x22 mm	Fisher	12-544-10
Lamínulas de microscópio de 18x18 mm	Fisher	12-553-402
Ácido acético	Fisher	A491-212
Metanol	Fisher	A412-4
Ácido propiônico	Sigma-Aldrich	402907
Ferramenta rotativa Dremel 200 com eixo flexível acessório	Rand		3" Mini Moedor de Bancada Multiuso (com limitador de taxa)
Especialmente projetado 200 μ l pontas de plástico (bordas de plástico frisadas) para ferramenta Dremel	Pipetman	F171300	Corte e aqueça a extremidade de gordura das pontas de pipeta
Morsa rápida revestida de estanho	Avenger Gold Toolmaker	MTC-200-1	Retificado de precisão quadrado e paralelo dentro de 0.00025
Chave de torque	Craftsman	44593
ThermoBrite Sistema de Desnaturação/Hibridização de Slides	Abbott Molecular	30-144110
Lâminas de barreira de 25 mm	Abbott Molecular	XT108-SL
lamínulas de 25 mm	Abbott Molecular	XT122-90X
Xmatrx Sistema de Coloração de Lâminas Automatizado	Abbott Molecular	08L46-001
MZ6 Estereomicroscópio Leica	Leica	VA-OM-E194-354	Um estereomicroscópio diferente pode ser usado
Microscópio de fase Olympus CX41 Olympus		CX41RF-5	Um microscópio de fase diferente pode ser usado
ACCORD PLUS Sistema de varredura automatizado	BioView (EUA)	BV-5000-ACCP
10x PBS	Invitrogen	P5493
10% NBF (formalina tamponada neutra)	Sigma-Aldrich	HT501128
99% formamida	Fisher Scientific	BP227500
sal de sódio sulfato de dextrano	Sigma	D8906
20x tampão SSC	Invitrogen	AM9765
Fosfato de sódio	Sigma-Aldrich	S3264
50x Solução de Denhardt	Sigma-Aldrich	D2532
Azida de sódio	Sigma-Aldrich	S2002
1 mM YOYO-1 solução de iodeto (491/509) em DMSO	Invitrogen	Y3601
Reagente antidesbotamento ProLong Gold	Invitrogen	P36930
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Fermentas	R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP	GE Healthcare	PA53022, PA55022
BSA	Sigma	A3294
DNA polimerase I	Fermentas	EP0041
DNase I	Fermentas	EN0521