Мы описываем подготовки Т-клеток фактор роста для в пробирке расширения антиген-специфических Т-лимфоцитов крыс линии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка T фактор роста клеток от Крыса Спленоциты
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Поддержание антиген-специфических Т-клеток линий или клонов в культуре требует раундов антиген-индуцированной активации разделенных фаз клеточного 1,2 экспансии. Добавление интерлейкина-2 в культуре средств массовой информации во время фазы расширения необходимо предотвратить гибель клеток и достаточно для поддержания краткосрочной линии Т-клеток, но было показано, что увеличение Th1 поляризации 3. Замена интерлейкин 2, Т-клеточный фактор роста (TCGF), который содержит смесь цитокинов является более эффективным, чем интерлейкина-2 в поддержании долгосрочной линии Т-клеток в пробирке 3. Более того, TCGF могут быть легко получены в больших количествах в лаборатории и намного дешевле, чем рекомбинантный интерлейкин 2.
Здесь мы покажем, как готовить TCGF от крыс спленоцитов супернатантах культуры. Для этой процедуры, жмем селезенки от наивных крыс Льюиса эвтаназии для тимуса и сбора крови. Мы готовим одноклеточных суспензий из селезенки, лизировать эритроциты от осмотического шока, и семян спленоцитов в культуральной среде. Клетки стимулировали конканавалин, митоген, что не-выборочно активирует все лимфоцитов крыс T, вызывая продукцию цитокинов. Культуры supernantant собирается через 48 часов andexcess конканавалин связан с альфа-метил mannoside, чтобы предотвратить его активации Т клеточных линий на которых TCGF будет добавлен. TCGF затем стерильно фильтруют, аликвоты и хранили при температуре -20 ° C.
Протокол
- Возьмите Льюис крысы селезенки (крысы между 160-200г лучше). Dilacerate на льду в чашке Петри содержащие PBS + антибиотики (PBS-ПС) с использованием ячейки фильтра. Положить в 50 мл трубки. Залейте PBS-PS.
- Спиновые течение 10 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
- Вымойте клетки в два раза.
- Ресуспендируют пеллет в NH 4 Cl 0,15 М (5 мл на селезенки). Осторожно перемешать и постоянно с пипеткой в течение 3 минут на льду лизировать эритроциты. Заполните трубку со средой.
- Спиновые течение 10 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
- Вымойте клетки в два раза.
- Граф клеток. Крыса селезенки дает 200-250 миллионо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы готовим TCGF из спленоцитов крыс Льюиса, так как мы регулярно эвтаназии наивные крыс от этого штамма для сбора сыворотки и thymi стимулировать Льюис крыс линии Т-клеток в пробирке. Это TCGF может быть использована для поощрения роста и выживания Т клеточных линий из других штаммов крысы. TCGF также могут быть получены от других штаммов крыс.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.
Материалы
Для подготовки полной культуральной среде добавьте следующие строки в 500 мл бутылка RPMI 1640 и стерильный фильтр: 10% FCS, 1 бутылка ПСЖ, 5 мл RPMI витаминов; 5 мл пирувата натрия, 5 мл без незаменимых аминокислот, 50 мкМ бета-меркаптоэтанол, 2 мкг / мл конканавалин А.
Ссылки
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
- Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
