Bioengineering

אינדוקציה של אותות הדבקה תלויי שימוש בעוצמה נמוכה אולטראסאונד

Published: May 8, 2012 doi: 10.3791/4024

James Roper¹, Andrew Harrison², Mark D. Bass¹

¹School of Biochemistry, University of Bristol, ²Smith and Nephew

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הגירוי של fibroblasts בתרבית עם אולטרה סאונד בעוצמה נמוכה פעמו, המניע ליצירת מוקדי הידבקות ו Rac1 ההפעלה על ידי חיקוי האירוסין של הקולטן הטרנסממברני מטריקס, syndecan-4. גישה זו מאפשרת חקירה של טכניקה קליני מוצלח ברמה התאית, ובכך לספק הזדמנויות עידון של טיפול.

Abstract

באורגניזמים תאיים, התנהגות התא מוכתב על ידי אינטראקציות עם תאי המטריצה. התוצאות של מטריקס מגוון, מעורבות של רגולציה של נדידת תאים ו ההפצה, על הפרשה ואף בידול. את האותות שבבסיס כל אלה תהליכים מורכבים נובעים אינטראקציות מולקולריות של קולטני תאי מטריקס על פני השטח של התא. Integrins הם קולטנים prototypic ולספק קישור מכני בין תאי מטריקס ו cytoskeleton, כמו גם ליזום כמה הידבקות תלויי מפלי איתות. עם זאת, זה הופך להיות ברור יותר ויותר כי הקולטנים הטרנסממברני נוספים לתפקד לצד integrins את להסדיר הן את עצמו integrin אותות במורד הזרם. האלגנטי ביותר של דוגמאות אלה היא proteoglycan הטרנסממברני, syndecan-4, אשר משתפת פעולה עם β ₅ α _1-integrin במהלך הדבקה על fibronectin. במודלים ב vivo demonstrאכלו את החשיבות של syndecan-4 איתות, כמו syndecan-4-בנוקאאוט עכברים להפגין פיגור ריפוי עקב ^1,2 פיברובלסטים יעיל ההגירה. ב wild-type בעלי חיים, נדידת fibroblasts כלפי הפצע מופעלת על ידי הופעתו של fibronectin כי ההדלפות נימים פגומים מופקד על ידי מקרופאגים ברקמה הפגועה. לכן יש עניין רב לגלות אסטרטגיות המשפרות fibronectin תלויי איתות יכול להאיץ את תהליכי התיקון.

הרכיבים integrin בתיווך syndecan ו-4-בתיווך של fibronectin תלויי איתות יכול להיות מופרדים על ידי תאים מגרה עם שברי fibronectin רקומביננטי. למרות מעורבות integrin חיוני הידבקות התא, fibronectin מסוימים תלויי אותות מוסדרים syndecan-4. Syndecan-4 מפעיל את האות Rac1 ובולטות ^3, גורם integrin חלוקה מחדש ^1, מפעילה גיוס של מולקולות cytoskeletal, כגון vinculin, אל מוקדהידבקויות ^4, ובכך גורם ³ כיווני ההגירה. בחנו את אסטרטגיות חלופיות עבור הפעלת אותות כאלה ומצא כי בעוצמה נמוכה אולטרסאונד פעמו (LIPUS) יכולים לחקות את ההשפעות של מעורבות-4 syndecan ^5. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השיטה שבאמצעותה 30 mW / cm ^2, 1.5 אולטרסאונד MHz, פעמו ב kHz 1 (איור 1) ניתן ליישם fibroblasts בתרבות (איור 2) לגרום Rac1 הפעלה היווצרות מוקדי הידבקות. גירוי אולטראסאונד מוחל לכל היותר 20 דקות, כי זה שילוב של פרמטרים כבר נמצא להיות יעיל ביותר עבור האצת תיקון שבר קליני ^6. השיטה משתמשת שברי fibronectin רקומביננטי לעסוק α β _{5 1-integrin,} ללא מעורבות של syndecan-4, והוא דורש עיכוב של סינתזת החלבון על ידי cycloheximide לחסום בתצהיר של מטריקס נוספת של fibroblasts ועוד, השפעה חיובית Oאולטרסאונד אישה על מנגנוני התיקון מתועדת היטב ^7,8, ועל ידי הבנת ההשפעה המולקולרי של אולטרסאונד בתרבות אנחנו צריכים להיות מסוגלים לשפר את הטכניקה הטיפולית כדי לשפר את התוצאות הקליניות.

Protocol

1. ציפוי משטחים עם ליגנד מטריקס

אולטראסאונד יחולו על תאים בגודל 3.5 ס"מ וולס, כמו גם מנות בודדות או צלחת 6 היטב. מבחני ביוכימיים, מעיל ליגנד ישירות על גבי פלסטיק. עבור immunofluorescence, זכוכית לרתיחה coverslips שלוש פעמים במים MilliQ ומקום 4 coverslips אל קרקעית הבאר זה.
משטחי זכוכית חייב להיות derivatized כדי להבטיח ציפוי ליגנד יעיל. ממיסים sulpho-M-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide אסתר ב PBS על 1 מ"מ. הוסף 2 מ"ל זה טוב דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לשטוף את המשטחים derivatized 3 פעמים עם PBS.
מעיל או זכוכית או פלסטיק derivatized מטופל עם ליגנד integrin. החל 2 מ"ל של 10 מיקרוגרם / מ"ל integrin ligand9, מומס PBS המכילה Ca ^{2 +} ו - Mg ^{2 +} זה טוב דגירה לילה ב 4 ° C.
הכן monoparticulate BSA על ידי חימום BSA 1%, מומסים PBS, עד 85 מעלות צלזיוס במשך 13 דקות. להתירלהתקרר ואז לעבור דרך מסנן 0.45-מיקרומטר.
לשטוף ליגנד מצופים משטחים 3 פעמים עם PBS ולחסום עם BSA monoparticulate במשך 30 דקות.

2. הכנת תאים

כדי לשלוט על סביבת מטריקס במהלך הניסוי, סינתזת החלבון צריך להיות חסום על ידי תוספת של cycloheximide מיקרוגרם / מ"ל 25-80% fibroblasts confluent למשך 2 שעות.
יש לשטוף cycloheximide שטופלו בתאים עם PBS ולנתק מהבקבוק התרבות באמצעות 0.5 מ"ג / מ"ל טריפסין / EDTA.
קציר תאים משפחתיים שנכתבו על ידי צנטריפוגה ב 500X גרם במשך 5 דקות.
תאים Resuspend ב DMEM/25 HEPES מ"מ, 25 מיקרוגרם / מ"ל cycloheximide.
ספירת צפיפות התאים של השעיה באמצעות haemocytometer ו לדלל עד 105 מ"ל-1.
דגירה תאים על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי להתאושש integrin פני השטח.
שוטפים את ליגנד מצופה, BSA, חסומים בארות 3 פעמים עם PBS.
2 זרעים מ"ל של תרחיף תאים לתוך היטב כל אחד מהם.
Alloתאים W כדי להתפשט עבור 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.

3. אולטראסאונד גירוי

לחמם פולט אולטרסאונד מערך ג'ל צימוד ל 37 ° C.
החל בועה אפונה בגודל של צימוד ג'ל כדי פולט כל אחד.
לבדוק כי כל אחד פולט הוא פונקציונלי באמצעות אינדיקטור אולטרסאונד גלאי דיודה.
מניחים את הבארות על מערך פולט. להחזיר מערך 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ולאפשר הטמפרטורה כדי לאזן במשך 10 דקות.
הפעל את האות אולטרסאונד.
האות אולטרסאונד יהיה לבטל אחרי 20 דקות, מחקה את המשטר הטיפולי. אם פעמים גירוי קצר נדרשים, צלחות יש להסיר מערך בתזמון הנכון נקודות. בכל המקרים להשתמש unstimulated צלחות כביקורת שלילית.

4. הדבקה ניתוח מיקוד ידי immunofluorescence

לניתוח של יצירת מוקדי הידבקות, החל את האות 20 דקות אולטרסאונדולאחר מכן אפשר לפתח עבור מבנים של 40 דקות נוספות על ידי שמירה על תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
Aspirate התקשורת לתקן את התאים על ידי הפעלת 2 paraformaldehyde מ"ל 4% ב PBS. דגירה במשך 14 דקות בטמפרטורת החדר.
Aspirate paraformaldehyde ולשטוף שלוש פעמים עם PBS, החלת PBS בעדינות את קצה גם כדי למנוע דור של כוחות גזירה.
להעביר את כל coverslip מן 3.5 ס"מ גם לצלחת 24 גם עבור מכתים immunofluorescent שלאחר מכן.
להרוות paraformaldehyde שיורי על ידי יישום 0.5 מ"ל 0.1 מ 'גליצין ב PBS לכל אחד 24 בארות. דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
Aspirate גליצין ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.
Permeabilise תאים על ידי יישום 0.5 מ"ל 0.5% טריטון X-100 (w / v) ב PBS. דגירה במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
Aspirate טריטון X-100 ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.
חסום על ידי יישום 0.5 מ"ל 3% (w / v) BSA ב PBS. דגירה בין לילה ב 4 & Dלמשל, ג
כתם vinculin המכילים הידבקות עם מוקד הנוגדן-1 hVIN מדולל 1:400 בבלוק BSA. דגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר.
יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
החל fluorophore (DyLight 488), מצומדות נוגדנים משני (מדולל 1:200) ו אקטין עם כתם TRITC-מצומדות phalloidin (דילול 1:200) בבלוק BSA. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS, ופעם עם מים.
הר בשקופית כוס בעמדה הפוכה באמצעות להאריך mountant זהב.

5. כימות הפעלת Rac1 ידי assay הנפתח

לצורך ניתוח של הפעלת Rac1, החל את האות 20 דקות אולטרסאונד לתאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. כאשר הערכת זמני תגובה ארוכים יותר מ -20 דקות, החל את האות אולטרסאונד במשך 20 דקות ולשמור על תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עבור הזמן שנותר כדי לאפשר תגובה לפתח.
Aspirate התקשורת המקום היטבים על הקרח. יש לשטוף את הבארות עם 2 מ"ל PBS קר ו aspirate. ודא PBS כל שיורי מוסר על ידי השארת בארות מוטה לרגע 1 ואחריו השאיפה יסודית.
Lyse תאים על הקרח עם חיץ 35 תמוגה μl (גליצרול 10%, 20 Hepes mM pH 7.4, 140 מ"מ NaCl, 1% NP40, Deoxycholate נתרן 0.5%, 4 מ"מ EGTA, 4 mM EDTA, 1 × מעכב פרוטאז מלאה) לכל טוב. בדוגמה זו, 6 בארות משמשים בכל נקודת זמן כדי לייצר 210 μl של lysate התא. בארות יותר או פחות יכול לשמש אך נפח lysate סך צריך להסתכם ~ 200 μl.
תאים שריטות היטב מגרד התא כדי להבטיח תמוגה התא המלא ולהשאיר בארות מוטה לרגע 1 כדי לאפשר lysate לבריכה.
העברת lysate כדי צינור קר כקרח microfuge 1.5 מ"ל (lysates מתאגדים ממשטר טיפול זהה) ואת הספין ב 21000 × גרם ל -2 דקות 4 ° C עד פסולת הסלולר גלולה.
העברת 180 μl של lysate לקור קרח 1.5-מ"ל microfuge צינורות המכילים 130 μl של חיץ תמוגה ו 25 μl PAK-שפעathione agarose חרוזים ^10. שמור lysate גולמי הנותרים ב -20 מעלות צלזיוס להפרדת ג'ל לאחר מכן.
לכידת Rac1 פעיל החרוזים PAK-גלוטתיון agarose ידי סיבוב צינורות במשך 40 דקות 4 ° C.
קציר agarose חרוז conjugates ידי צנטריפוגה ב 2000 × גרם לדקה 1 ב 4 ° C.
לשטוף חרוז conjugates שלוש פעמים עם מאגר 500 תמוגה μl, קציר חרוזים על ידי צנטריפוגה ב 2000x G ו השלכת supernatant לאחר כל שטיפה. בזהירות להסיר כל חיץ הנותרים לשטוף תמוגה עם פיפטה 200 μl.
Elute כל דגימה על ידי הוספת 35 μl חיץ SDS-PAGE ההעמסה דגירה על 85 מעלות צלזיוס על גוש חום רועד במשך 5 דקות. הסר חרוזים על ידי צנטריפוגה ב 21000 × גרם לדקה 1.
לפתור eluate חרוז על ידי SDS-PAGE, להעביר nitrocellulose ו בדיקה עבור Rac1.

6. נציג תוצאות

בפרוטוקול זה אנו מתארים גיוס של vinculin-כתםאד מוקד הידבקויות ו Rac1 פעילות לפי אולטרסאונד. לצורך ניסוי הדבקה מוקד, העמדה הבסיסית היא כי fibroblasts הפזורים על ליגנד של ₅ β α _1-integrin לא יוצרים vinculin המכילים הידבקויות (איור 3 א) אלא אם הקולטן fibronectin 2, syndecan-4, עוסקת על ידי תוספת של ליגנד מסיס (איור 3 ב) ^3,4. עם זאת, גירוי עם אולטרסאונד גורם להיווצרות מוקדי הידבקות באותה מידה כמו מעורבות של syndecan-4 (איור 3 ג), המציין כי גירוי אולטרסאונד יכול להחליף רכיבים מסוימים של מסלול fibronectin תלוי איתות ^5. המשוכה מפתח עם פרוטוקול זה הוא ביטול הקמת מוקד הדבקה בהעדר ממריץ. עיכוב בלתי שלמה של סינתזת החלבון על ידי cycloheximide יאפשר בתצהיר מטריקס כי היא מספקת את התאים אוטומטית לעורר. צפיפות יתר של תאים יכול גם להוביל formatio ברמה נמוכה הידבקות מיקודn ו תגובה גרועה אולטרסאונד כמו crosstalk בין תאים תאים ותא סיכות קשר יסבך הניסוי אשר נועד לבודד גירוי אחד. התפתחות של assay הבסיסית שאנו מציגים אותו ניסוי, חזר עם fibroblasts חסרי syndecan-4 (איור 4). Fibroblasts אלה עדיין להגיב אולטרסאונד (איור 4C), אך אינם מגיבים ליגנד syndecan-4 (איור 4B). הניסוי באמצעות Sdc4 - / - fibroblasts אולטרסאונד מדגים כי אכן יכול לעקוף את הצורך fibronectin קולטנים מסוימים, מדגים כיצד פרוטוקול פשוט ניתן לפתח כדי לקבל מידע נוסף על מסלול איתות.

לצורך ניסוי ביוכימי אנחנו מדגימים אולטרסאונד שיכול לגרום הפעלת Rac1, באמצעות assay הנפתח כי הוא עיבוד של השיטה המתוארת על ידי דל פוסו et al. ^10. משקעים של פעיל Rac1 0, 10, 30 ו -60 דקות לאחר initiation של גירוי אולטרסאונד מגלה כי Rac1 פסגות פעילות 10-30 דקות, לפני החזרה לקו הבסיס (איור 5). סופג lysates הגולמי של vinculin מבטיח הטעינה שווה בין נקודות זמן. התוצאה דומה הפעלת Rac1 על ידי מעורבות של syndecan ^3-4, אבל הוא מעט ממושך יותר מאשר הפעלה באמצעות fibronectin. לכן 8-10 חזרות נדרשים בדרך כלל כדי להשיג נתונים משמעותיים. הפעלת Rac1 אחראי המחויבות של תאים להיווצרות מוקדי הידבקות, ועל הידבקויות מוקד המתהווה מתחיל להיווצר על 10-30 דקות, בד בבד עם הפעלת Rac1. יזם ברגע, הידבקויות אלו ימשיכו להבשיל לתוך הפלאק הדבקה גדולים המוצגים דמויות 3 ו -4.

באיור 1. טופס גל אולטרסאונד. אולטראסאונד מהווה אות לסירוגין 1.5 MHz כי בשל משרעת נמוכה (30 mW / cm <sup> 2, ממוצע מרחבית, הממוצע הזמני) אין כל השפעה חימום.

איור 2. ייצוג סכמטי של עבודה להכנת וגירוי של תאים עם אולטרסאונד.

איור 3. אינדוקציה אולטראסאונד של היווצרות מוקדי הידבקות ב fibroblasts. Fibroblasts פוזרו על שבר integrin מחייב של fibronectin (א ') לפני גירוי עם שבר syndecan-4-מחייב של fibronectin (ב) או אולטרסאונד (C). בעקבות גירוי 60 דקות, התאים היו קבועות, מוכתם עבור vinculin ו אקטין, וצילמו ידי epifluorescence. בר = 10 מיקרומטר.

איור 4. אינדוקציה אולטראסאונד של היווצרות מוקדי הידבקות ב fibroblasts חסרי syndecan-4. Sdc4 - / - fibroblasts היו fibronectin, חסר רגישות, אולטרסאונד המושרה עדיין היווצרות הידבקות מרחק, מה שמצביע אולטרסאונד עוקף מעורבות הקולטן מטריקס. בר = 10 מיקרומטר.

איור 5. הפעלת Rac1 באולטרסאונד. התאים היו מגורה דקות 0, 10, 30 ו 60 עם 6 בארות המשמשים לכל נקודת זמן. כמות ה-Rac1 GTP בדגימות מן כמובן Rac1 הנפתח זמן assay היה דמיינו ידי הדגירה עם נוגדנים נגד Rac1 על כתם המערבי (תמונה למעלה). כימות עוצמת הלהקה (ממוצע של 8-10 משכפל) מגלה גדל Rac1ctivity כתוצאה האות אולטרסאונד ב 10 ו 30 דקות, לפני חזרתם של רמת הבסיס ב 60 דקות (גרף). ברים שגיאה מייצגים SEM

Discussion

בפרוטוקול זה אנו מתארים את שיטת הטיפול שחל בדרך כלל בבני אדם ניתן להשתמש בתא מבוססי ניסויים. המטרה הסופית היא להבין את המנגנון המולקולרי של פעולת אולטרסאונד, כך הטיפול יכול להיות מעודן. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) כמערכת מודל התא, אך אולטרסאונד כבר גם נמצא כיעיל העיקריים fibroblasts העורלה האדם ^5, בתאי גזע mesenchymal, osteoblasts ו chondrocytes ^6. אנו משתמשים Rac1 ההפעלה כמו assay למשל ביוכימי, אך השיטה יכולה לשמש באותה מידה לבחון רגולציה של זירחון חלבונים או היווצרות של קומפלקסים חלבונים על ידי immunoprecipitation. לדוגמה immunofluorescent אנחנו מדגימים אולטרסאונד משפיעים על היווצרות מוקדי הידבקות, אך חלוקה מחדש של מולקולת כל יכול להיבחן. לדוגמה, אפשר לבחון גיוס של גורמים cytosolic קרום פלזמה, colocalisation של proteתוספות ב שלפוחית סחר או לבחון את ההשפעה של אולטרסאונד על הארגון ציר mitotic. עד כה יש לנו את עצמנו מוגבלים לבדיקת fibronectin תלויי המסלולים, על ידי ההשפעה של אולטרסאונד על תאים על קולגן, או בנוכחות גורמי גדילה יכול להיבדק על מנת לבנות תמונה של איך אולטרסאונד משפיע על התנהגות התא בסביבה מורכבת יותר דומה למצב in vivo. אתגר גדול יותר יהיה לבחון את ההשפעה של אולטרסאונד באמצעות זמן לשגות הדמיה, שם הנוכחות של פולט חוסם את נתיב האור תנודות מן המכשולים אולטרסאונד הנוכחי טכניים נוספים. עם זאת, העובדה כי יישום טיפולי דורש רק 20 דקות של גירוי ליום עולה כי ניתוח של התנהגות התא לאחר פרץ של גירוי עשויים להיות יעילים.

Disclosures

אנדרו האריסון הוא עובד של Smith & Nephew בבריטניה מוגבלת.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי Wellcome Trust מענק 088,419 ל MDB וחסות של Smith & Nephew באנגליה בע"מ

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester	Fisher Scientific	PN22312	25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C
6-well tissue culture plate	Corning	3516	Plastic from other companies can coat poorly
13-mm glass coverslip	Scientific Laboratory Supplies LTD	MIC3336	Glass from other companies can coat poorly
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
PBS, Ca²⁺ Mg²⁺	Sigma-Aldrich	D8662
50K integrin ligand (fibronectin fragment)			Construct description and preparation in ⁹, ¹¹. Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways
BSA	Sigma-Aldrich	A3059
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698	Can be stored as 10mg/ml stock in water
DMEM/25 mM HEPES	Sigma-Aldrich	D6171
Exogen 4000+	Smith & Nephew Inc.
Ultrasound coupling gel	Smith & Nephew Inc.
SAFHS indicator	Smith & Nephew Inc.
hVIN-1	Sigma-Aldrich	V9264
DyLight 488-conjugated anti-mouse	Stratagene, Agilent Technologies	715-485-150
TRITC-labelled phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930
cOmplete protease inhibitor (EDTA free)	Roche Group	056 489 001	100× stock made up from tablet stored at -20°C
PAK-glutathione agarose beads			Construct description and preparation in ¹⁰
Glycerol	Fisher Scientific	G/0650/17
Hepes	Apollo Scientific	BI8181	Make 1M stock and pH to 7.4
NaCl	Fisher Scientific	S/0160/65
NP40	Sigma-Aldrich	I3021
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134