L'induzione di segnali di adesione-dipendenti utilizzando ultrasuoni a bassa intensità

Summary

Questo protocollo descrive la stimolazione dei fibroblasti in coltura a bassa intensità ultrasuoni pulsato, che guida la formazione di adesione focale e Rac1 attivazione imitando l'impegno del recettore transmembrana matrice, Syndecan-4. Questo approccio consente di indagine di una tecnica di successo clinico a livello cellulare, fornendo così opportunità per la raffinazione della terapia.

Abstract

In organismi multicellulari, il comportamento cellulare è dettata dalle interazioni con la matrice extracellulare. Conseguenze della matrice impegno vanno dalla regolazione della migrazione e proliferazione cellulare, alla secrezione e anche la differenziazione. I segnali base di ciascuno di questi processi complessi derivano dalle interazioni molecolari di recettori della matrice extracellulare sulla superficie della cellula. Le integrine sono i recettori prototipici e fornire un collegamento meccanico tra la matrice extracellulare e il citoscheletro, nonché avviare alcune delle cascate di segnalazione adesione-dipendenti. Tuttavia, è sempre più evidente che recettori transmembrana aggiuntivi operato lungo le integrine di regolare sia la stessa integrina e segnali a valle. La più elegante di questi esempi è il proteoglicano transmembrana, Syndecan-4, che coopera con ₅ α β _1-integrina durante l'adesione alla fibronectina. Modelli in vivo demonstrmangiò l'importanza della segnalazione Syndecan-4, come Syndecan-4-topi knockout presentano ritardo di guarigione a causa di ^1,2 inefficiente la migrazione dei fibroblasti. In animali di tipo selvatico, la migrazione di fibroblasti verso una ferita viene attivato dalla comparsa di fibronectina che fuoriesce da danneggiato capillari e viene depositato mediante macrofagi nel tessuto danneggiato. Quindi c'è grande interesse per scoprire le strategie che aumentano fibronectina-dipendenti di segnalazione e potrebbe accelerare i processi di riparazione.

I componenti integrina-mediati e Syndecan-4-mediata di fibronectina-dipendenti segnalazione possono essere separate da stimolando le cellule con frammenti di fibronectina ricombinanti. Anche se l'impegno integrina è essenziale per l'adesione cellulare, fibronectina alcuni segnali dipendenti sono regolate da Syndecan-4. Syndecan-4 attiva il segnale di Rac1 protrusiva ^3, provoca integrina redistribuzione ^1, trigger reclutamento di molecole del citoscheletro, come vinculin, di focale⁴ adesioni, e induce così ³ direzionale di migrazione. Abbiamo cercato strategie alternative per l'attivazione di tali segnali e ha scoperto che a bassa intensità ultrasuoni pulsato (LIPUS) in grado di simulare gli effetti di Syndecan-4 di fidanzamento ^5. In questo protocollo si descrive il metodo di 30 mW / cm ^2, 1,5 MHz ultrasuoni, impulsi a 1 kHz (Fig. 1) può essere applicato a fibroblasti in coltura (Fig. 2) per indurre Rac1 attivazione e la formazione di adesione focale. Stimolazione ad ultrasuoni viene applicato per un massimo di 20 minuti, in quanto questa combinazione dei parametri è stato trovato per essere più efficace per l'accelerazione di riparazione delle fratture clinica ^6. Il metodo utilizza frammenti di fibronectina ricombinanti per impegnare ₅ α β _1-integrina, senza impegno di Syndecan-4, e richiede l'inibizione della sintesi proteica cicloeximide per bloccare deposizione di matrice supplementare dai fibroblasti., L'effetto positivo of ultrasuoni sui meccanismi di riparazione è ben documentata ^7,8, e per comprendere l'effetto molecolare degli ultrasuoni nella cultura dovremmo essere in grado di affinare la tecnica terapeutica per migliorare gli esiti clinici.

Protocol

1. Le superfici di rivestimento con Ligand Matrix

1. Ultrasound sarà applicata alle cellule in 3,5-cm pozzi, sia come piatti individuali o come una piastra da 6 pozzetti. Per saggi biochimici, ligando strato direttamente sulla plastica. Per immunofluorescenza, vetro bollire coprioggetto tre volte in acqua MilliQ e 4 coprioggetti posto sul fondo di ciascun pozzetto.
2. Superfici di vetro deve essere derivatizzato per garantire rivestimento efficiente ligando. Sciogliere solfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide estere in PBS a 1 mM. Aggiungere 2 ml a ciascun pozzetto ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Lavare le superfici derivatizzati 3 volte con PBS.
4. Coat vetro oppure derivatizzato o plastica trattata con ligando integrina. Applicare 2 ml di 10 ug / ml integrina ligand9, disciolto in PBS contenente Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +} a ciascun pozzetto ed incubare durante la notte a 4 ° C.
5. Preparare monoparticulate BSA riscaldando 1% BSA, disciolto in PBS, a 85 ° C per 13 minuti. Consentireraffreddare e poi passare attraverso un filtro da 0,45-um.
6. Lavare ligando superfici rivestite 3 volte con PBS e il blocco con BSA monoparticulate per 30 minuti.

2. Preparazione delle cellule

1. Per controllare l'ambiente di matrice durante l'esperimento, la sintesi proteica deve essere bloccata mediante aggiunta di 25 pg / ml cicloeximide al 80% fibroblasti confluenti per 2 ore.
2. Risciacquare cicloeximide cellule trattate con PBS e staccare dal pallone di coltura utilizzando 0,5 mg / ml di tripsina / EDTA.
3. Cellule Harvest staccati di centrifugazione a 500x g per 5 minuti.
4. Risospendere le cellule in DMEM/25 HEPES mm, 25 mcg / ml cicloeximide.
5. Contare densità cellulare della sospensione utilizzando un emocitometro e diluire a 105 ml-1.
6. Incubare le cellule a 37 ° C per 20 minuti per recuperare integrina superficie.
7. Risciacquare le ligando rivestita, BSA-bloccati pozzetti 3 volte con PBS.
8. Seme 2 ml della sospensione di cellule in ciascun pozzetto.
9. Allow celle a sviluppa per 2 ore a 37 ° C, 5% CO _2.

3. Ultrasuoni Stimolazione

1. Scaldare l'array emettitore ultrasuoni e gel di accoppiamento a 37 ° C.
2. Applicare un pisello blob di gel ad ogni emettitore.
3. Verificare che ciascun emettitore è funzionale con un indicatore rivelatore ultrasuoni diodo.
4. Posizionare i pozzetti sulla matrice emettitore. Ritorna matrice a 37 ° C, 5% di CO ₂ e temperatura consente di equilibrare per 10 minuti.
5. Accendere il segnale ad ultrasuoni.
6. Il segnale ad ultrasuoni si disattiva dopo 20 minuti, imitando il regime terapeutico. Se i tempi di stimolazione più brevi sono necessarie, le piastre devono essere rimossi dalla matrice al momento opportuno time-points. In tutti i casi non stimolate utilizzare piastre come controllo negativo.

4. Adesione Analisi focale mediante immunofluorescenza

1. Per l'analisi di formazione di adesione focale, applicare il 20-minuti segnale ultrasonicoe quindi consentire di sviluppare strutture per altri 40 minuti, mantenendo le cellule a 37 ° C, 5% CO _2.
2. Aspirare media e fissare le cellule applicando 2 ml di paraformaldeide al 4% in PBS. Incubare per 14 minuti a temperatura ambiente.
3. Aspirare paraformaldeide e sciacquare tre volte con PBS, applicando il PBS dolcemente lungo il bordo del pozzo per evitare la generazione di forze di taglio.
4. Trasferire ciascun coprioggetto da 3,5 cm e ad una piastra da 24 pozzetti per la successiva colorazione di immunofluorescenza.
5. Quench paraformaldeide residuo applicando 0,5 ml di 0,1 M glicina in PBS a ciascuno dei 24 pozzetti. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
6. Aspirare glicina e sciacquare tre volte con PBS.
7. Permeabilise cellule applicando 0,5 ml 0,5% Triton X-100 (w / v) in PBS. Incubare per 4 minuti a temperatura ambiente.
8. Aspirare Triton X-100 e sciacquare tre volte con PBS.
9. Bloccare applicando 0,5 ml 3% (w / v) BSA in PBS. Incubare per una notte a 4 & deg; C.
10. Stain vinculin contenenti adesione focale con hVIN-1 anticorpo diluito 1:400 in blocco BSA. Incubare per un'ora a temperatura ambiente.
11. Risciacquare tre volte con PBS.
12. Applicare fluoroforo (DyLight 488) coniugato anticorpo secondario (diluito 1:200) e actina macchia con TRITC coniugato phalloidin (diluito 1:200) nel blocco BSA. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
13. Risciacquare tre volte con PBS, e una volta con acqua.
14. Montare su un vetrino in posizione invertita utilizzando Prolungare mon-Gold.

5. Quantificazione di Rac1 Attivazione da Pull-down Assay

1. Per l'analisi di Rac1 attivazione, applicare il 20-minuti segnale ultrasonico a cellule a 37 ° C, 5% CO _2. Nel valutare tempi di reazione più lunghi di 20 minuti, applicare il segnale a ultrasuoni per 20 minuti e mantenere le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ per il tempo rimanente per permettere la risposta di sviluppare.
2. Aspirare il terreno e luogo bens su ghiaccio. Sciacquare i pozzetti con 2 ml di PBS freddo e aspirato. Assicurarsi che ogni residuo PBS viene rimosso lasciando pozzi inclinati per 1 minuto seguito da aspirazione profonda.
3. Lisare le cellule su ghiaccio con 35 microlitri di tampone di lisi (10% glicerolo, 20 mM Hepes pH 7,4, 140 mM NaCl, 1% NP40, desossicolato di sodio allo 0,5%, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 × inibitore di proteasi completo) per pozzetto. In questo esempio, 6 pozzetti sono utilizzati per punto di tempo per generare 210 microlitri di lisato cellulare. Pozzi più o meno quelli che possono essere utilizzati, ma il volume totale di lisato dovrebbero ammontare a circa 200 microlitri.
4. Raschiare accuratamente le cellule con raschietto cella per assicurare completa lisi delle cellule e lasciare pozzi inclinato per 1 minuto per consentire lisato alla piscina.
5. Trasferire il lisato ad una ghiacciata 1,5 ml provetta per microcentrifuga (lisati pooling dal regime stesso trattamento) e centrifugare a 21000 × g per 2 minuti a 4 ° C a detriti pellet cellulare.
6. Trasferire 180 microlitri di lisato di ghiacciata 1,5 ml provette da microcentrifuga contenente 130 microlitri di tampone di lisi e 25 microlitri PAK-glutathione perline di agarosio ^10. Mantenere rimanente lisato grezzo a -20 ° C per la successiva separazione gel.
7. Cattura Rac1 attivo sulle PAK perline di glutatione-agarosio ruotando provette per 40 minuti a 4 ° C.
8. Harvest agarosio tallone coniuga mediante centrifugazione a 2000 × g per 1 minuto a 4 ° C.
9. Wash tallone coniuga tre volte con 500 microlitri tampone di lisi, perline raccolta per centrifugazione a 2000x g e scartando supernatante dopo ogni lavaggio. Rimuovere con cautela qualsiasi residuo di lavaggio tampone di lisi con una pipetta 200 pl.
10. Eluire ciascun campione con l'aggiunta di 35 microlitri SDS-PAGE di tampone di caricamento e incubare a 85 ° C su un blocco di calore agitazione per 5 minuti. Rimuovere perline per centrifugazione a 21.000 xg per 1 minuto.
11. Risolvere eluato tallone mediante SDS-PAGE, trasferimento in nitrocellulosa e sonda per Rac1.

6. Risultati rappresentativi

In questo protocollo si descrive l'induzione di vinculin-macchiaEd adesioni focali e Rac1 attività con l'ecografia. Per l'esperimento adesione focale, la posizione di base è che i fibroblasti distribuite su un ligando di ₅ α β _1-integrina non formano vinculina contenenti aderenze (Fig. 3A) a meno che un recettore secondo fibronectina, Syndecan-4, viene impegnato dalla aggiunta di ligando solubile (Fig. 3B) ^3,4. Tuttavia, la stimolazione con ultrasuoni induce la formazione focale adesione nella stessa misura di impegno Syndecan-4 (Fig. 3C), che indica che la stimolazione ad ultrasuoni può sostituire alcuni componenti della fibronectina-dipendente via di segnalazione ^5. L'ostacolo chiave con questo protocollo si elimina la formazione di adesione focale in assenza di stimolante. Incompleta inibizione della sintesi proteica da parte cicloeximide permetterà di deposizione della matrice che è sufficiente per le cellule per l'auto-stimolano. Il sovraffollamento delle cellule può portare anche a basso livello Formatio adesione focalen ed una scarsa risposta a ultrasuoni come diafonia tra cellula-cellula e cellula-matrice contatti complicare un esperimento che è progettata per isolare un singolo stimolo. Come sviluppo del saggio di base si mostra lo stesso esperimento, ripetuto con fibroblasti privi Syndecan-4 (Fig. 4). Questi fibroblasti di rispondere a ultrasuoni (Fig. 4C), ma non riescono a rispondere alle Syndecan-4 legante (Fig. 4B). L'esperimento utilizzando Sdc4 - / - fibroblasti dimostra che gli ultrasuoni possono effettivamente bypassare la necessità di certi recettori fibronectina, e illustra come il protocollo semplice può essere sviluppato per ottenere informazioni aggiuntive sul percorso di segnalazione.

Per l'esperimento biochimico dimostriamo che gli ultrasuoni possono indurre l'attivazione di Rac1, utilizzando un pull-down saggio che è un adattamento del metodo descritto da Del Pozo et al. ^10. Precipitazione di attivo Rac1 0, 10, 30 e 60 minuti dopo iniziazione di stimolazione ultrasuoni rivela che RAC1 picchi di attività a 10-30 minuti, prima di tornare alla linea di base (Fig. 5). Blotting lisati greggio per vinculin assicura carico equivalente tra i punti temporali. Il risultato assomiglia attivazione di Rac1 da un blocco del Syndecan-4 ^3, ma è leggermente più lunga di attivazione da parte fibronectina. Pertanto 8-10 ripetizioni sono tipicamente necessari per ottenere dati significativi. Attivazione di Rac1 è responsabile per l'impegno alla formazione delle cellule adesione focale e nascenti adesioni focali cominciano a formarsi a 10-30 minuti, in coincidenza con Rac1 attivazione. Una volta avviato, tali aderenze continuerà a maturare nelle placche di adesione grandi illustrate nelle figure 3 e 4.

Figura 1. La forma d'onda ad ultrasuoni. Ecografia comprende un segnale intermittente 1,5 MHz che, a causa di bassa ampiezza (30 mW / cm <sup> 2, media spaziale, media temporale) non ha alcun effetto di riscaldamento.

Figura 2. Rappresentazione schematica del flusso di lavoro per la preparazione e la stimolazione delle cellule con ultrasuoni.

Figura 3. Induzione Ecografia di formazione adesione focale nei fibroblasti. I fibroblasti sono stati sparsi sul integrina-binding frammento di fibronectina (A) prima della stimolazione con il Syndecan-4-binding frammento di fibronectina (B) o ultrasuoni (C). Dopo 60 minuti di stimolazione, le cellule sono state fissate, colorate per vinculina e actina, e ripreso da epifluorescenza. Bar = 10 micron.

Figura 4. Induzione Ecografia di formazione adesione focale in fibroblasti carenti Syndecan-4. Sdc4 - / - fibroblasti erano fibronectina-insensitive, ecografia ancora indotto la formazione di focale adesione, indicando che l'ecografia esclude l'impegno matrice recettore. Bar = 10 micron.

Figura 5. Attivazione di Rac1 da ultrasuoni. Le cellule sono state stimolate per minuto 0, 10, 30 e 60 con 6 pozzetti utilizzati per punto di tempo. La quantità di GTP-Rac1 presenti nei campioni da un pull-down Rac1 corso del test il tempo è stato visualizzato mediante incubazione con l'anticorpo anti-Rac1 su un Western Blot (immagine in alto). Quantificazione dell'intensità band (media di 8-10 replicati) rivela un aumento Rac1 unoettività risultante dal segnale ad ultrasuoni a 10 e 30 minuti, prima di tornare ai livelli basali a 60 minuti (grafico). Le barre di errore rappresentano sem

Discussion

In questo protocollo è descritto il metodo con cui un trattamento che viene normalmente applicato a pazienti umani possono essere utilizzati in esperimenti basati su celle. L'obiettivo finale è quello di comprendere il meccanismo molecolare di azione degli ultrasuoni in modo che la terapia può essere raffinato. In questo protocollo, si usa fibroblasti embrionali di topo (MEF) come sistema modello di cella, ma ad ultrasuoni è stato anche stato trovato per essere efficace in fibroblasti primari umani prepuzio ^5, cellule staminali mesenchimali, osteoblasti e condrociti ^6. Usiamo Rac1 attivazione come un saggio biochimico esempio, ma il metodo può essere utilizzato anche per testare regolazione di fosforilazione proteica o la formazione di complessi proteici di immunoprecipitazione. Per l'esempio immunofluorescenza si dimostra una ecografia effetto sulla formazione di adesione focale, ma la ridistribuzione di qualsiasi molecola potrebbe essere esaminato. Ad esempio, si potrebbe verificare assunzione di fattori citosolici alla membrana plasmatica, colocalisation di proteins in vescicole traffico o esaminare l'effetto degli ultrasuoni sull'organizzazione mitotico mandrino. Finora ci siamo limitati a noi stessi di test della fibronectina dipendenti percorsi, per effetto degli ultrasuoni sulle cellule sul collagene, o in presenza di fattori di crescita potrebbe essere testato per costruire un quadro di come gli ultrasuoni influenza il comportamento delle cellule in un ambiente complesso che più assomiglia una situazione in vivo. Una sfida maggiore sarà per testare l'effetto di ultrasuoni utilizzando time-lapse imaging, dove la presenza di emettitore bloccare il percorso di luce e vibrazioni dagli attuali ultrasuoni ulteriori ostacoli tecnici. Tuttavia, il fatto che l'applicazione terapeutica richiede solo 20 minuti di stimolazione al giorno suggerisce che l'analisi del comportamento delle cellule dopo un burst di stimolazione può anche essere produttiva.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester	Fisher Scientific	PN22312	25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C
6-well tissue culture plate	Corning	3516	Plastic from other companies can coat poorly
13-mm glass coverslip	Scientific Laboratory Supplies LTD	MIC3336	Glass from other companies can coat poorly
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
PBS, Ca2+ Mg2+	Sigma-Aldrich	D8662
50K integrin ligand (fibronectin fragment)			Construct description and preparation in 9, 11. Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways
BSA	Sigma-Aldrich	A3059
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698	Can be stored as 10mg/ml stock in water
DMEM/25 mM HEPES	Sigma-Aldrich	D6171
Exogen 4000+	Smith & Nephew Inc.
Ultrasound coupling gel	Smith & Nephew Inc.
SAFHS indicator	Smith & Nephew Inc.
hVIN-1	Sigma-Aldrich	V9264
DyLight 488-conjugated anti-mouse	Stratagene, Agilent Technologies	715-485-150
TRITC-labelled phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930
cOmplete protease inhibitor (EDTA free)	Roche Group	056 489 001	100× stock made up from tablet stored at -20°C
PAK-glutathione agarose beads			Construct description and preparation in 10
Glycerol	Fisher Scientific	G/0650/17
Hepes	Apollo Scientific	BI8181	Make 1M stock and pH to 7.4
NaCl	Fisher Scientific	S/0160/65
NP40	Sigma-Aldrich	I3021
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134