Summary
En teknikk for å identifisere translasjonelle pause områder på mRNA blir beskrevet. Denne prosedyren er basert på isolasjon av begynnende polypeptider samler på ribosomer under in vitro oversettelse av et mål mRNA, etterfulgt av størrelsen analyse av de begynnende kjedene bruker en denaturering gel elektroforese.
Abstract
Satsen for translatorisk tøyelighet er ikke-uniform. mRNA sekundær struktur, kodon bruk og mRNA tilhørende proteiner kan endre ribosomet bevegelse på meldingen om overprøving se en. Men det er nå allment akseptert at synonymt kodon bruk er den primære årsaken til ikke-uniforme translasjonelle forlengelse priser 1. Synonyme kodon ikke brukes med identisk frekvens. En skjevhet finnes i bruk av synonyme kodon med noen kodon brukes oftere enn andre 2. Kodon skjevhet er organismen samt vev bestemt 2,3. Dessuten er frekvensen av kodon bruk direkte proporsjonal med konsentrasjonen av cognate tRNAs 4. Dermed vil en ofte brukt kodon har høyere mengde tilsvarende tRNAs, noe som ytterligere innebærer at en hyppig kodon vil bli oversatt raskere enn en sjelden en. Dermed vil områder på mRNA anriket i sjeldne kodon (potensiell pause nettsteder) som regel tregere ribosomet bevegelse på Message og årsak akkumulering av begynnende peptider av de respektive størrelser 5-8. Disse pause nettstedene kan ha funksjonell innvirkning på protein uttrykk, mRNA stabilitet og protein folding for vurdering se ni. Faktisk ble det vist at lindring av slike pause nettstedene kan endre ribosomet bevegelse på mRNA og deretter kan påvirke effektiviteten av co-translatorisk (in vivo) proteinfolding 1,7,10,11. For å forstå prosessen med protein folding in vivo, i cellen, som er slutt koblet til prosessen med protein syntese er det viktig å få omfattende innsikt i effekten av kodon bruk / tRNA innhold på bevegelsen av ribosomer langs mRNA under translasjonsforskning tøyelighet .
Her beskriver vi en enkel teknikk som kan brukes til å lokalisere større oversettelse pause områder for et gitt mRNA oversatt i ulike celle-frie systemer 6-8. Denne prosedyren er basert på isolasjon av begynnende polypeptider accumulating på ribosomer under in vitro oversettelse av et mål mRNA. Begrunnelsen er at lavfrekvente kodon, økningen i oppholdstid av ribosomene resulterer i økte mengder begynnende peptider av tilsvarende størrelse. In vitro transkribert mRNA brukes til in vitro translasjonelle reaksjoner i nærvær av radioaktivt merket aminosyrer å tillate deteksjon av begynnende kjedene. For å isolere ribosomet innbundne begynnende polypeptid komplekser oversettelsen reaksjonen er lagdelt på toppen av 30% glycerol løsning etterfulgt av sentrifugering. Gryende polypeptider i polysomal pellet er videre behandlet med ribonuklease A og løses av SDS PAGE. Denne teknikken kan potensielt brukes til noe protein og tillater analyse av ribosome bevegelse langs mRNA og påvisning av de store pause nettsteder. I tillegg kan denne protokollen tilpasses studere faktorer og forhold som kan endre ribosomet bevegelse og dermed potensielt kan også endre the funksjon / konformasjon av protein.
Protocol
1. DNA Mal Forberedelse og in vitro Transkripsjon
- Genet av interesse er klonet etter T7 og / eller f.eks SP6 transcriptional promoter.
- For in vitro transkripsjon malen DNA er lineært med en passende restriksjonsenzym kutte nedstrøms ORF stopp kodon og / eller mRNA 3 'enden. Man trenger å verifisere fullstendig linearisering av plasmid DNA ved å kjøre begrensning fordøyelse produktet på agarose gel elektroforese.
- Den lineær plasmidet brukes til in vitro transkripsjon reaksjon. Ulik konsentrasjon av mal DNA kan bli testet for å identifisere optimal DNA konsentrasjon er nødvendig for in vitro transkripsjon. Vanligvis med Ambion sin MEGAscript høy kapasitet Transcription Kit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), gir en mikrogram lineært DNA 40-60 mikrogram av mRNA. In vitro transkripsjon er gjort etter produsentens anvisninger (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY).
- Etter in vitro transkripsjon av mRNA blir renset ved lithium klorid ventet ifølge produsentens instruksjon (Ambion sin MEGAscript høy kapasitet Transcription Kit).
- mRNA integritet blir ytterligere bekreftet av elektroforese på akrylamid eller agarose gels.
2. In vitro Cell Free Translation
For in vitro oversettelse ved hjelp av R abbit R eticulocyte lysate, RRL (Promega, Madison, WI) Følg fremgangsmåten nedenfor:
- Forbered 100 mL in vitro oversettelse reaksjon følgende produsentens instruksjoner. Kort, i nuklease fritt vann tilsett 2 mL aminosyre blanding minus metionin (1 mm), 10 enheter av RNase inhibitor (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 μCi av radioaktivt [35 S]-metionin (MP Biomedicals, Solon, OH), 70 mL av Rabbit retikulocytt lysate (Promega, Madison, WI).
- Inkuber the reaksjon ved 30 ° C i 5 min til pre varm oversettelsen reaksjonen. Tilsett 2 mikrogram av mRNA til oversettelse reaksjon og Inkuber ved 30 ° C i 5 min.
- Stopp reaksjonen ved å plassere oversettelse reaksjon på is.
3. Isolering av begynnende polypeptider fra in vitro Translation Reaction
- For å isolere gryende polypeptid bundet til ribosomer (polysome) er oversettelse reaksjon lagvis oppå 4,5 ml 30% glycerol i 10 mM Tris-HCl buffer pH 7,6, som inneholder 100 mM KCl, 10 mM MgCI 2, og sentrifugeres på 100 000 X g i en TLA-110 rotor (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA) for en time ved 4 ° C.
- Supernatanten er videre forsiktig fjernet.
- Den polysomal pellet inneholder begynnende polypeptider er resuspendert i et lite volum (10-15 mL) av en mM Tris-HCl buffer pH 7,6, som inneholder 0,5 mg / ml ribonuklease A (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), og inkuberes 30 min ved 37 ° C. Forå forbedre hydrolyse av peptidyl-tRNA ester obligasjon, er NaOH lagt til en endelig konsentrasjon på 10 mm, og inkubasjon er fortsatt for ytterligere 30 min.
In vitro oversettelse reaksjon monteres uten mRNA og utføres under samme vilkår (etterfulgt av isolasjon av begynnende peptider som har blitt beskrevet) ville tjene som en viktig kontroll. Behandling av oversettelsen reaksjon (er) med puromycin før utsette ekstrakt til tettshetsgradient sentrifugering kan tjene som en ekstra kontroll.
4. Løse den gryende polypeptid på Tris-tricine SDS PAGE
- De isolerte begynnende polypeptider er løst og analysert på Tris-tricine SDS-PAGE. Vær oppmerksom på at mengden av materialet lastet på gel vil avhengig av effektiviteten av protein merking, effektivitet på protein oversettelse og mange andre parametere. Mengden av belastede materiell bør justeres empirisk å tillate BESt visualisering og separering av individuelle gryende polypeptidkjeder.
- Etter elektroforese gels er faste, tørkes med vakuum gel Dyer og utsatt for autoradiografi. Fordelingen av begynnende polypeptider er observert ved hjelp phosphoimaging.
5. Representative Resultater
Bovine Gamma-B Crystallin ble oversatt i Rabbit retikulocytt lysate samt i E. coli S30 Extract Systems (Promega, Madison, WI) etterfulgt av isolasjon av gryende polypeptidkjeder. Figur 1 viser trinnene involvert i isolering av ribosome bundet gryende kjedene. I den foreliggende studien var målet å teste, hvis endre miljøet av oversettelse dvs. repertoar av tRNAs (kjent for å være vesentlig annerledes i pattedyr (RRL) og prokaryote (E. coli) systemer på grunn av forskjeller i kodon skjevhet mellom organismer) kan endre ribosom bevegelse langs mRNA og påvirke fordelingen av oversettelsen pause nettsteder.Altered ribosom bevegelse bør føre til endringer i fordelingen av størrelser begynnende polypeptider oppsamling under oversettelse, samt deres relative intensiteter. Relative intensiteter av bandene reflekterer varigheten av pausen. De begynnende polypeptider ble isolert og løst på 16,5% T, 6% C Tris-tricine SDS PAGE (figur 2). Gamma-B Crystallin er en 20 kDa protein. Observasjonen av begynnende polypeptider av ikke-identiske lengder og intensitet i RRL og E. coli-systemer viser at bevegelsen av ribosomer langs mRNA i disse to systemene følger annen oversettelse kinetikk. For eksempel, observerte vi en fremtredende bandet på 17,7 kDa i E. coli lysate og ikke i RRL system, noe som tyder på at det er en ekstra translasjonell pause nettstedet i 3'-enden regionen mRNA (koding C-terminal regionen Gamma B Crystallin), når det er oversatt i E. coli-systemet. Vi registrerer at Gamma-B Crystallin havner tandem Arg kodon (AGG 153 og AGA 154) som er hyppig i mammalske systemer, men er kjent for å være ekstremt sjelden og sakte oversatt i E. coli. En roman begynnende peptid akkumuleres i E. coli-systemet (~ 17,7 kDa figur 2.2) er sannsynligvis forårsaket av ribosomet pause på disse tandem sjeldne kodon. Vær oppmerksom på at ingen band kan observeres i fravær av mRNA (figur 2.3) og at puromycin behandling fjerner det meste av den gryende kjedene fra polysomes (figur 2.3). Langvarig behandling med puromycin (> 15 min) fjerner alle begynnende kjedene (data ikke vist). Dette bekrefter at de observerte polypeptid produktene er ribosomet tilknyttede begynnende kjeder, snarere enn mRNPs cosedimenting med polysomes.
Som nevnt ovenfor, er kodon skjevhet organismen samt vev spesifikk. Den representativt eksempel beskrevet her, indikerer tydelig at endring av miljøet i oversettelse dvs. repertoar av tRNAs / kodonskjevhet kan føre til endret bevegelse av ribosome langs mRNA. Tydeligvis kan denne enkle teknikken ikke bare tillate identifisering av translasjonsforskning pause steder langs mRNA, men også tillater rask sammenligning av oversettelsen pause nettstedene mellom ulike systemer.
Figur 1. Skjematisk forklare trinnene involvert i å isolere ribosomet innbundne gryende polypeptider. Bovine Gamma-B Crystallin ORF sekvens (528 basepar) ble klonet nedstrøms av T7 promoter i pBSKS +. For in vitro transkripsjon malen DNA ble lineært ved å behandle den med EcoRI. Lineært malen ble brukt til in vitro transkripsjon. T7 promoter i DNA-malen er anerkjent av T7 RNA polymerase som transcribes nedstrøms Gamma-B Crystallin genet. mRNA blir renset ved hjelp av lithium klorid nedbør metode. Den rensede mRNA brukes til in vitro oversettelse. Etterinkubasjon oversettelse reaksjon er lagdelt på toppen av 30% glyserol løsning og sentrifugeres i 1 time ved 4 ° C ved 100 000 X g å isolere ribosomet bundet gryende polypeptider.
Figur 2. Isolering av storfe Gamma-B Crystallin begynnende polypeptider oversatt i Rabbit retikulocytt lysate (RRL) og E. coli lysate. 2 mikrogram mRNA ble blandet i 100 mL reaksjon inneholder RRL eller E. coli S30 Extract System (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens anvisninger og med 20 μCi [35 S]-metionin og inkubert ved 30 ° C i 5 min. Etter inkubering oversettelsen reaksjonen ble lagvis oppå 4,5 ml 30% glycerol i 10 mM Tris-HCl buffer pH 7,6, som inneholder 100 mM KCl, 10 mM MgCI 2, og sentrifugeres i 1 time ved 4 ° C og 100 000 X g i en TLA-110 rotor (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA). Den isolerte polyribosome pelleten var RESUspended i 20 mL av en mM Tris-HCl pH 7,6, som inneholder 0,5 mg / ml ribonuklease A (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), etterfulgt av behandling med NaOH (som beskrevet i protokollen avsnitt). Gryende polypeptider ble løst på 16,5% T, 6% C Tris-Tricine SDS PAGE gel. Gelen ble tørket og utsatt for autoradiografi. Etter eksponering gelen ble skannet ved hjelp av GE Healthcare sin Typhoon Imaging Scanner. Figur 2.1 viser gel med begynnende polypeptider isolerte og løst etter oversettelse reaksjoner gjort i to ulike systemer (RRL og E. coli). Figur 2.2 Gelen ble analysert av Image Quant TL , viser v2005 programvare og brukes her som et eksempel for å vise at den molekylære vekt og intensitet av den gryende polypeptider akkumulert seg i to systemer kan lett analyseres og sammenlignes figur 2.3 to sett kontroller:. begynnende polypeptider isolerte og vedtok SDS PAGE etter oversettelse reaksjonene ble samletuten mRNA og / eller etter oversettelse reaksjonene ble behandlet med puromycin (5 min, endelig kons. 1 mm) før reaksjonen ble utsatt for sentrifugering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For reproduserbare resultater, kvalitet og konsentrasjon av komponentene som brukes for in vitro transkripsjon og oversettelse reaksjoner er kritiske. I denne studien har vi brukt kommersielt tilgjengelige kits og ekstrakter som gir svært reproduserbare data, hvis håndteres forsiktig. Imidlertid kan oversettelse-kompetente ekstrakter være forberedt fra cellen av ens valg, om nødvendig. Kvalitet av mRNA kan påvirke oversettelsen, så det er av største betydning for å teste integriteten til mRNA før du bruker den under in vitro oversettelse.
Videre har varigheten av in vitro oversettelse reaksjon å være optimalisert for hver enkelt protein. Dette er et kritisk punkt for isolering av gryende polypeptider. Utvidet inkubasjon fører til syntese av full-lengde protein og utgivelsen av flertallet av begynnende polypeptider fra ribosomer. Inkubasjonstiden kan optimaliseres ved å utføre in vitro oversettelse reactions med forskjellige tidspunkter. Når minste tid for oversettelse av full-lengde protein er etablert, er neste steg å gjøre et annet sett av eksperimenter rundt dette tidsrom og identifisere inkubasjonstiden, der de fleste av begynnende polypeptider skulle likevel bundet til ribosomet (e ) (dvs. oversettelse start og avslutning prosesser ville være fortsatt i likevekt). Oversettelsen reaksjonen kan også bli stoppet ved å legge antibiotika som ble arrestert translasjonell forlengelse (f.eks cycloheximid). Det er åpenbart at dette eksperimentelt system ville tillate oppløsning og analyse av de store pause steder langs mRNA og løse kapasitet på gel systemet skal brukes ville ha en stor innvirkning på kvaliteten av resultatene. Tricine-natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel elektroforese tillater separasjon av proteiner i området 1-100 kDa er sterkt anbefalt for bruk i disse typer eksperimenter 12. Det bør bemerkes at denne strategienkan også tilpasses til analysen av plasseringen av Pause nettstedene under protein uttrykk in vivo (i cellene). I den senere tilfelle bør total polysomal fraksjonen fra metabolsk merket celler isoleres først. Polysomes oversette spesifikke mRNA av interesse bør deretter isolert ved immunoprecipitation med anti-(protein av interesse) spesifikke antistoffer og analyse av merket begynnende kjedene bør gjøres som beskrevet. Det er å foretrekke å bruke antistoffer rettet mot N-terminal regionen av protein av interesse. Om nødvendig, kan protein av interesse merkes med f.eks FLAG-peptid for å sikre effektiv dra ned. Et alternativ som er basert på selektiv isolering av oversetter ribosomer bundet til en biotin-merket mRNA har også nylig beskrevet 13. Det bør bemerkes at for mer nøyaktig fastsettelse av oversettelsen pause nettsteder, spesielt for store proteiner kan man bruke micrococcal nuklease beskyttelse analysen fem. En endring av than senere analysen, som er basert på dyp sekvensering av ribosome-beskyttede mRNA fragmenter og muliggjør undersøkelse av protein translasjonelle dynamikk på genom-wide nivå har også blitt beskrevet 14.
Den enkle og svært tilpasningsdyktig teknikk beskrevet i denne artikkelen kan brukes til å følge bevegelsen av ribosomer langs mRNA, bidra til å identifisere oversettelse pause nettsteder og også teste faktorer og forhold som kan endre ribosomet bevegelse under translasjonsforskning tøyelighet. Det kan potensielt brukes til optimalisering av co-translatorisk proteinfolding i heterologe system (er) ved å justere de riktige stedene til de store oversettelse pause områder ved å benytte synonyme kodon erstatninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Human Frontier Science Program stipend RGP0024.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 | |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 | |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
References
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity. Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2, e221 (2006).
- Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).
- Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model. J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).
- Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).
- Komar, A. A., Jaenicke, R. Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding. FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).
- Thanaraj, T. A., Argos, P. Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).
- Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses. J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
