Summary
Questo articolo descrive prima di una procedura per isolare cellule endoteliali umane da vena ombelicale e poi mostra come utilizzare queste cellule per esaminare la trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso. Utilizzando un basso volume camera di flusso realizzati da un polimero con le caratteristiche ottiche di vetro, live-cellula imaging a fluorescenza di popolazioni di cellule rare è anche possibile.
Abstract
I neutrofili sono il tipo più abbondante di globuli bianchi. Essi costituiscono una parte essenziale del sistema immune innato 1. Durante l'infiammazione acuta, i neutrofili sono le prime cellule infiammatorie a migrare verso il luogo della ferita. Assunzione di neutrofili a un sito della lesione è un processo graduale che comprende in primo luogo, la dilatazione dei vasi sanguigni per aumentare il flusso di sangue, in secondo luogo, microvascolari cambiamenti strutturali e la fuga di proteine del plasma dal sangue, in terzo luogo, rolling, adesione e la trasmigrazione dei neutrofili attraverso l' accumulo di neutrofili e quarto al sito della lesione 2,3; endotelio. Una vasta gamma di in vivo e in vitro è evoluto per consentire lo studio di questi processi 4. Questo metodo si concentra sulla trasmigrazione neutrofili attraverso cellule endoteliali umane.
Un metodo popolare per esaminare i processi molecolari coinvolti nella trasmigrazione dei neutrofili utilizza umana neutrophils interagiscono con le cellule primarie umane vena ombelicale endoteliali (HUVEC) 5. L'isolamento dei neutrofili è stato descritto visivamente altrove 6; così questo articolo mostrerà il metodo per l'isolamento di HUVEC. Una volta isolate e coltivate a confluenza, le cellule endoteliali vengono attivate causando la sovraregolazione di molecole di adesione e di attivazione. Ad esempio, l'attivazione di cellule endoteliali con citochine come TNF-a risultati aumentati E-selectina e IL-8 espressione 7. E-selectina media di cattura e di rotolamento dei neutrofili e IL-8 di attivazione media e ferma adesione dei neutrofili. Dopo l'adesione dei neutrofili trasmigrare. Trasmigrazione può avvenire paracellularly (mediante giunzioni di cellule endoteliali) o transcellularly (attraverso la cellula endoteliale stesso). Nella maggior parte dei casi, queste interazioni avvengono in condizioni di flusso presenti nel sistema vascolare 7,8.
Il parallelo camera di flusso piatto è un sistema largamente utilizzato, che mimicrofoni il taglio idrodinamico sollecitazioni trovato in vivo e permette lo studio del reclutamento dei neutrofili in condizioni di flusso in vitro 9,10. Diverse aziende producono parallele camere di flusso di targa e hanno ciascuno vantaggi e svantaggi. Se fluorescente immagini è necessario, vetro o un polimero otticamente simile deve essere utilizzato. Le cellule endoteliali non crescono bene su vetro.
Presentiamo qui un metodo semplice e rapido per l'imaging a contrasto di fase, DIC e fluorescente di trasmigrazione neutrofili con un basso volume di diapositiva canale ibidi fatto di un polimero che supporta l'adesione e rapida crescita di cellule endoteliali e ha qualità ottiche comparabili a vetro. In questo metodo, le cellule endoteliali sono state coltivate e stimolata in μslide ibidi. I neutrofili sono stati introdotti in condizioni di flusso e la trasmigrazione è stata valutata. Imaging a fluorescenza delle giunzioni attivato in tempo reale la determinazione del grado di paracellulare rispettotrasmigrazione transcellulare.
Protocol
1. Isolamento e manutenzione di cellule endoteliali vascolari umane
- Procedure di biosicurezza di livello 2 deve essere utilizzato quando si lavora con sangue umano e dei tessuti. Utilizzando forbici tagliare il cordone dalla placenta e poi esaminate con attenzione il cavo di coaguli di sangue ei danni causati dalla chiusura il cavo durante il parto. Tagliare ed eliminare queste porzioni del midollo.
- Preparare la soluzione fresca collagenasi a 1 mg / ml versando 50 ml di tampone cavo caldo in un tubo che contiene 50 mg di collagenasi.
- Cambia in guanti sterili e aprire un vassoio contenente sterilizzati sterilizzato strumento cannule smussate, pinze, forbici, corda a tre vie stop-galli e garza in una cappa a flusso laminare.
- Identificare le due arterie e il presente singola vena nel midollo. Le arterie sono più piccole e tendono ad essere strettamente ristretto, mentre la vena è grande e facile da incannulare. Per lavare il sangue dalla vena, inserire delicatamente una cannula con una bidirezionale rubinetto collegato ad esso inPer una estremità della vena e del luogo una fascetta intorno cannula per tenere saldamente in posizione. Perfusione buffer di cavo attraverso la vena. Ripetere fino flusso attraverso chiaro e poi serrare l'estremità del cavo.
- Collagenasi perfusione nella vena, chiudere il rubinetto, posizionare il cavo in un bicchiere contenente tampone caldo cavo e incubare per 10 minuti. Dopo 10 minuti, rimuovere il cavo e massaggiare delicatamente il cavo di sciogliere le cellule endoteliali dal lume della vena. Scolate la soluzione nella provetta contenente i media delle cellule endoteliali (ECM). Lavare con tampone cavo due volte per rimuovere le cellule rimanenti. Scolate la soluzione nel tubo stesso.
- Centrifugare le cellule a 350 xg per 10 minuti per agglomerare le cellule endoteliali.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 10 ml di ECM al pellet. Risospendere delicatamente le cellule in ECM, poi trasferire le cellule a un pallone T75 pre-rivestito con 0,2% di gelatina. Pre-rivestimento con gelatina è stato fatto per almeno 1 ora a 37 ° C. Crescere le cellule a 37 ° C e 5% CO 2.
- Il giorno dopo, scuotere delicatamente il pallone rimuovere eventuali globuli rossi, quindi rimuovere il surnatante e lavare con una soluzione salina bilanciata di Hank calda (HBSS). Rimuovere HBSS e nutrire le cellule con 10 ml di ECM caldo. Esaminare le cellule con il microscopio per assicurare che i globuli rossi sono stati rimossi. Valutare il grado di confluenza e della morfologia delle cellule endoteliali. Le cellule endoteliali, in questa fase dovrebbe essere allungata senza alcun segno di vacuoli.
- Continuare a cambiare il supporto ogni tre giorni finché le cellule raggiungano la confluenza, le cellule poi dividere con una soluzione 0,08% di tripsina contenente 1 mM EDTA. Piatto cellule endoteliali in piatti desiderati pre-rivestito con 0,2% di gelatina. Le celle dovrebbero raggiungere la confluenza in 3-6 giorni.
- Quando si utilizza ibidi camere, pre-coat ogni camera con il 0,2% di gelatina. Rimuovere eccesso gelatina e fibronectina e quindi aggiungere 1,5 X 10 6 / ml di cellule endoteliali sospese in ECM nella camera. Modificare i media a giorni alterni fino al confluent. Le celle dovrebbero essere confluenti in 2-3 giorni a seconda del cavo.
2. Preparazione di neutrofili
- I neutrofili sono stati isolati dal sangue periferico di volontari sani mediante centrifugazione densità. Un protocollo dettagliato con una dimostrazione visiva per l'isolamento dei neutrofili può essere trovato nel numero precedente di questa rivista 6. Una volta isolato, neutrofili risospendere ad una concentrazione di 1x10 6 / mL in HBSS contenente 0,5% di albumina umana.
3. Impostazione della Camera Ibidi
- Coltivare cellule endoteliali in una gelatina rivestita camera ibidi. Esaminare ogni giorno con microscopio a contrasto di fase fino a quando diventano ben confluenti.
- Stimolare le cellule endoteliali per aumentare l'espressione di molecole di adesione e di attivazione. Ai fini di questo protocollo, le cellule endoteliali sono state stimolate con 10 ng / ml di TNF-α ricombinante per quattro ore a 37 ° C e 5% CO
- Preparare il microscopio, e la pompa a siringa visivamente descritto da Wiese e colleghi 11 con una camera vuota ibidi.
- Principali differenze tra questo protocollo e la procedura di Wiese comprendono pre-riempimento del tubo per evitare l'esposizione delle cellule endoteliali in aria, mantenendo il tampone a 37 ° C con un bagno d'acqua, utilizzando un tubo in PharMed di mantenere il buffer di perdere temperatura e con differenti obiettivi sul microscopio a seconda che l'imaging con contrasto di fase o fluorescenza.
- Una volta che il microscopio è impostato e il tubo è pieno di HBSS, chiudere tutti i rubinetti e togliere la camera vuota ibidi.
- Collegare la camera contenente ibidi TNF-α stimolato le cellule endoteliali al tubo.
4. Reclutamento dei neutrofili e Trasmigrazione
- Visualizza il monostrato delle cellule endoteliali nel microscaprir con un obiettivo 10x contrasto di fase.
- Impostare la pompa a siringa per ritirare ed iniziare il flusso di HBSS alla sollecitazione di taglio desiderata (tipicamente tra 0,5-2 dine / cm 2).
- Sul lato di ingresso, passaggio da HBSS al neutrofili isolati (1x10 6 / mL), girando a tre vie rubinetto.
- Iniziare la registrazione utilizzando una fotocamera CCD connesso ad un registratore DVD o collegato direttamente al computer. Avviare il timer quando neutrofili entrare nella camera. Perfusione neutrofili per quattro minuti. Un totale di 3 ml della sospensione neutrofili è sufficiente per un singolo esperimento.
- Dopo quattro minuti, tornare a HBSS per prevenire l'attacco di neutrofili nuovi. Se i dati per le interazioni totali, laminazione e ferma adesione sono desiderate, immagini 6 campi casuali per 10 secondi ciascuno utilizzando un obiettivo 10x contrasto di fase tra 4 e 5 minuti.
- Passare a un obiettivo 40x e registrare un singolo campo di vista tra 5 e 10 minuti. A 10 minuti, raccoglieretra 5 e 10 campi casuali di vista.
- Arrestare il flusso e passare alla camera successiva.
5. Imaging fluorescente in condizioni di flusso utilizzando una camera Ibidi
- Le cellule endoteliali sia etichette o neutrofili con una sonda fluorescente di interesse. Ad esempio, un anti-VE-caderina coniugato a Alexa-[547] può essere utilizzato per visualizzare giunzioni delle cellule endoteliali.
- Montare camera ibidi su un microscopio con contrasto di interferenza differenziale (DIC) e le capacità fluorescenti. Usiamo un FluoView 1000 confocale (Olympus), con una camera climatica. Messa a fuoco con un obiettivo progettato per il lavoro DIC e fluorescenti.
- Acquisire le immagini simultanee DIC e fluorescenza utilizzando il software fornito dal produttore mentre si segue l'andamento temporale descritto nella sezione 4.
6. Analisi del reclutamento dei neutrofili
- Analisi di laminazione e interagire cellule è descritto da Wiese et al 11. Per misurare la percentuale di neutrofili rotolamento sul monostrato endoteliale contare il numero di neutrofili che sono spostati più del diametro di cella in un periodo di 5 secondi. Dividere questo numero per il numero totale di leucociti in campo per determinare la percentuale di cellule di laminazione. Per estensione, le cellule rimanenti sono considerate saldamente aderente.
- Misurare la velocità di rotazione dei neutrofili calcolando la distanza percorsa neutrofili in un determinato periodo di tempo e poi dividendolo per quel tempo in secondi.
- Trasmigrazione è determinata contando il numero di neutrofili che hanno cambiato forma e migrato sotto il monostrato 10. Questi neutrofili sono identificati dal fatto che cambiano dall'essere fase luminosa quando sopra del monostrato ad essere scuro fase quando sotto il monostrato 10. Il numero di cellule trasmigrato può essere espresso come percentuale delle cellule totali nel campo visivo o come insensibile primaer di cellule trasmigrato per unità di area. In questo sistema modello, il 50% di neutrofili trasmigrano dopo 10 minuti.
7. Risultati rappresentativi
Le cellule endoteliali stimolate non supportano il reclutamento dei neutrofili. Al contrario, stimolando le cellule endoteliali con TNF-alfa si traduce in neutrofili rolling, adesione e la ferma. Un esempio di questi dati è mostrato nelle figure 1 e 2. Figura 1A mostra neutrofili interagiscono con TNF-α-stimolate cellule endoteliali. Queste interazioni possono essere quantificato, rivelando il numero totale dei neutrofili interagiscono con le cellule endoteliali, nonché il numero di neutrofili laminazione, saldamente aderente o trasmigrato (Figura 2). Trasmigrazione dei neutrofili può avvenire in giunzioni cellulari o attraverso le cellule endoteliali stesse. Per distinguere tra queste due condizioni, le cellule endoteliali vengono etichettati con un anti-VE-c anticorpi adherin e trasmigrazione è stato segnato come si verificano paracellularly o transcellularly (Figura 1B e C). In questo modello, quasi tutti trasmigrazione è paracellulare 7.
Figura 1. DIC simultanea e imaging di fluorescenza in condizioni di flusso utilizzando una camera ibidi. (A) image DIC fresco isolato neutrofili umani che migrano tra le cellule umane endoteliali della vena ombelicale. La freccia gialla indica uno dei neutrofili aderente, la freccia bianca mostra uno dei neutrofili trasmigrando. (B) giunzioni delle cellule endoteliali sono state colorate con un anticorpo anti-VE-caderina coniugato con Alexa-[547] e immaginata. (C) mostra sovrapposizione del canale A e B, rivelando che la quasi totalità trasmigrando in questo modello è paracellulare. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Cellule endoteliali sono state stimolate lasciati o sono state stimolate con 10 ng / ml di TNF-α. Dopo 4 ore, una camera di flusso parallelo piastra è stata assemblata e neutrofili sono stati perfusi in 1 a dine / cm 2. (A) le interazioni neutrofili sono stati esaminati e misurati utilizzando il software ImageJ dal NIH. Le cellule interagenti totali sono stati caratterizzati come (B) al rotolamento, saldamente aderente o (C) trasmigrando. I dati rappresentano la media + SEM di tra 3 e 5 esperimenti. La differenza tra il controllo e TNF in pannelli A e C è significativa (p <0,001).
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Discussion
I ricercatori hanno utilizzato di routine cellule endoteliali da diversi letti vascolari per studiare il reclutamento dei neutrofili e trasmigrazione. Esempi includono, ma non sono limitati a, derma cellule endoteliali microvascolari 12, fegato cellule endoteliali sinusoidali 13 e cellule endoteliali di vena ombelicale umano 10. Tra questi HUVEC acquisito vasta popolarità a causa della loro relativa facilità di isolamento e di disponibilità. HUVEC sono un potente modello in vitro che imita molti processi endoteliali che si verificano in vivo. Questo sistema modello ha aiutato nella identificazione di molecole di adesione e chemochine critici nel reclutamento di molte sottoclassi dei leucociti e abilitato l'analisi dettagliata di come questi processi sono regolati. Nel lavoro in vitro con HUVEC ha costituito la base per studi in vivo che in ultima analisi hanno fornito un una migliore comprensione e il trattamento per le malattie umane 14.
e_content "> In questo articolo presentiamo un metodo rapido e semplice per studiare il reclutamento dei neutrofili in vitro utilizzando una camera di flusso ibidi. Questo tipo di camera ha diversi vantaggi rispetto ad altre camere a piastre parallele, descritte in precedenza in questa rivista 11. Ibidi camere sono costituite da un polimero con caratteristiche ottiche simili al vetro che permette all'utente di prendere immagini fluorescenti e DIC in aggiunta a contrasto di fase immagini. sono camere che utilizzano vetrini per consentire imaging a fluorescenza, ma crescita delle cellule endoteliali su vetro è una sfida come l'adesione proprietà di queste cellule cambiare in modo significativo sulle superfici di vetro 15. cellule endoteliali aderire bene alla superficie di plastica, ma l'imaging di fluorescenza sulla superficie plastica non è realizzabile. Utilizzando la μ ibidi scorre non solo elimina questi problemi, ma anche il volume del campione che richiedono molto meno rispetto agli altri metodi . Questi scivola anche consentire simultanee esperimenti paralleli con un solo lieve modificzione.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Pina Colarusso e Live strumento imaging cellulare per la loro assistenza, con immagini e analisi di immagine, la signora Lailey per la sua assistenza tecnica, e 51 unità presso l'Ospedale Foothills in Calgary, AB per la fornitura di cordoni ombelicali umani. Dr. KD Patel è un Innovates Alberta: Salute Scientist Solutions. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di funzionamento degli Istituti canadesi di ricerca Salute e contributi per investimenti fissi e delle infrastrutture da parte della Fondazione canadese per l'innovazione e la scienza Alberta e Autorità di ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
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