Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Prionlar protein misfolding Döngüsel Amplifikasyon

Published: November 7, 2012 doi: 10.3791/4075
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Civil Engineering, University of Nebraska at Lincoln, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University

Summary

Protein misfolding siklik amplifikasyon (PMCA) Prion dönüşüm ve zorlanma ve tür engellerin çalışma için bir in vitro testtir. Aynı zamanda, bir prion saptama sistemi olarak da kullanılabilir.

Abstract

Prionlar hayvan ve insanlarda 9,18 olarak kaçınılmaz ölümcül bulaşıcı süngerimsi ensefalopati (TSE) neden bulaşıcı ajanlardır. Prion proteini iki farklı izoformu, bulaşıcı olmayan ana-kodlanmış protein (PrP C) ve enfeksiyöz protein (PrP Sc), PrP C 8 anormal katlanmış izoformu vardır.

Prion ajanlar ile çalışan zorluklardan biri öncesinde ev sahibi inokülasyon 13 sonrasında klinik bulguların gelişimi uzun bir kuluçka dönemidir. Bu geleneksel olarak uzun ve pahalı hayvan biyoassay çalışmaları görevlendirdi. Ayrıca, PrP Sc biyokimyasal ve biyofiziksel özelliklere kötü onların sıradışı konformasyon ve agregasyonu devletler nedeniyle karakterize edilir.

PrP Sc in vitro 14 PrP Sc PrP C tohum dönüşüm yapabilirsiniz. PMCA Adva alır bir in vitro bir tekniktirPrP C ve PrP Sc tohum 19 dakika miktarları aşan miktarda içeren bir sistem, giderek artan bir oranda, PrP Sc büyük miktarlarda üretmek için sonication ve inkübasyon döngüleri kullanarak bu yeteneği ntage. Bu teknik, etkili prion zorlanma girişime taklit etmek, PrP C PrP Sc dönüştürme türleri ve gerilme özgüllük özetlemek için, ve enfekte dokuları, sıvıları ve çevresel örneklerde 6,7,16 gelen PrP Sc çok düşük seviyelere yükseltmek için kanıtlanmıştır 23.

, Kontaminasyonu en aza tutarlı sonuçlar üreten, ve bu sonuçların ölçülmesi için öneriler içeren bu kağıdı ayrıntıları PMCA protokolü. Biz de bulaşıcı prion suşları, prion zorlanma girişim, ve çevre Prionların algılama üretimi ve karakterizasyonu gibi çeşitli PMCA uygulamaları tartışmak.

Protocol

1. Ekipman hazırlanması

  1. Bir Misonix 3000 veya 37 sabit bir sıcaklıkta tutmak için bir Thermo Electron NESLAB EX-7 su banyosu (Newington, NH) bağlı Misonix 4000 sonikatör (Farmingdale, NY) ° C kullanın Thermo Scientific (Waltham, MA) dan elde edilen kubbeli kapak ile 200 ul ince duvarlı tüp PCR şeritler örnekleri sonikasyon.
  2. Yepyeni sonikatör sürekli çalışma 9 bir "soygun" dönemi gerektirir. Bir iki ay aradan-in dönemi 10 ayarlanmış genlik seviyesi ile 40 saniye sonication patlama ve 10 dakikalık inkübasyon döngüleri oluşur. Bir titanyum mikroplaka boynuz (Şekil 1, panel B) yüzeyi boyunca erozyon uyulması gerekir. Dolaşan su titanyum mikroplak boynuz erozyon nedeniyle beyaz bulanık görünecektir. Günlük bu suyu değiştirin.
  3. PrP Sc amplifikasyon mikroplak boynuz boyunca değişir. En iyi PrP Sc amplifikasyon verim içinde elde edilebilirmikroplak boynuz (Şekil 1, panel C'ye bakınız) merkezine 5 cm yarıçapında.
  4. PMCA biri yuvarlak 144 döngüleri oluşur. Her döngü 5 saniye ile 10 dakika sonikasyon inkübasyondan oluşur. Bu kabaca PMCA yuvarlak başına 24 hr gerektirecektir.
  5. Sonikatör kontrol panelinde görüntülenen sonication ve güç çıkışı, sonikatör en raf ve su banyosundan dolaşan su sıcaklığı mevcut PCR tüpleri sayısına göre değişir. Su 37 ° C'de dengelenmiş olduğundan emin olun, ve sonikatör en tüp raf (Şekil 1, panel C)% 30'dan fazla doldurmayın. Mikroplak boynuzu ile PCR tüpleri duyurun. PCR tüp stripleri arasındaki boş alan en az bir satır var ve (Şekil 1, panel C) şerit başına birbirine bağlı en fazla dört tüpler sağlar.
  6. Sonikasyon gücü başarılı bir prion suşu amplifikasyonu için kritik önem taşımaktadır. Sonicating iken, bir güç çıkışı için genlik ayarlamak155 ~ 170 watt arasında değişen. Laboratuvarımızda güç seviyesi sırasıyla altı ve Misonix 3000 ve Misonix 4000 için yedi, ayarlanır.
  7. Sert su lekeleri birikmesini önlemek için su banyosunda distile su kullanın. Bu su haftalık değiştirin. Kuluçka ve sonication çevrimleri sırasında, su yoğuşması mikroplak korna kapağı içinde meydana gelecek. Şekil 1, panel A'da gösterildiği gibi yoğunlaşmayı önlemek için, sonikatör muhafazası kutusunun üstüne küçük bir akvaryumda ısı pedi takın

2. Hazırlanıyor

  1. Hayvanların kullanıldığı bütün işlemler Creighton Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanan ve Kullanım Kurulu ve Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ile uyumlu yapılmıştır. Herhangi bir doku toplama önce, hayvan anestetize ve transkardiyal buz gibi soğuk fosfat ile perfüze olmalıdır beyin kan kaldırmak ve inhibisyonu önlemek için pH 7.4, 5 mM EDTA ile tamponlanmış tuz çözeltisiKan 7 tarafından PMCA reaksiyon. Aseptik teknik kullanarak hızla hayvan dokuları toplayın ve her prion suşu için özel diseksiyon araçları vardır. Diseksiyonu sonra, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpünün içindeki doku yerleştirmek, flaş kuru buz üzerinde dondurma ve -80 saklayın ° C homojenizasyon kadar.
  2. PMCA alt tabaka (PrP C) çözelti hazırlamak için, bir Tenbroeck doku öğütücü kullanılarak buz gibi soğuk tampon dönüştürme ile bir% 10 ağırlık / hacim (ağırlık / hacim) çözeltisi (parça 3) için bir etkilenmemiş beyin hamsteri (BM BH) homojen hale getirilir. Homojenleştirici iken, çözüm köpük aşırı önlemek için taşlama içine hava almak için dikkatli olun. 30 sn ve kısım 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine süpernatant için 500 xg'de santrifüj çözümü netleştirin. -80 ° C'de saklayın, daha sonra kullanmak kadar.
  3. PMCA tohum (PrP Sc) çözeltisi hazırlamak için, buz Wate ile% 10 w / v çözüm bulaşıcı bir malzeme (beyin, dalak, lenf düğümleri, diğer dokulara veya kontamine toprak) homojenize0,6 ml mikrosantrifüj tüpleri r ve kısım çözüm. -80 ° C'de saklayın, daha sonra kullanmak kadar.

3. Dönüşüm Tampon Hazırlanması

  1. 50 ml'lik bir balon jojeye (sonuç Triton X-100,% 1 son konsantrasyon) (; Steinheim, Almanya Sigma-Aldrich GmbH) içinde Triton X-100, 0,5093 g tartılır.
  2. Biri Komple Proteaz İnhibitör Tablet (; Mannheim, Almanya Roche Diagnostics GmbH) ekleyin.
  3. EDTA 0,0931 g (bu EDTA, 5 mM nihai konsantrasyon neden olur (), Phillipsburg, NJ Mallinckrodt Baker, Inc) ekleyin.
  4. 1N NaOH ile pH 7.4 'e ayarlayın.
  5. Dulbecco Fosfat ile 50 ml hacim ayarlama (; Manassas, VA Mediatech Inc) (DPBS) Tamponlu Tuzlu.
  6. Bir vakumlu filtrasyon cihazı ile bir 0.45 mikron nitroselüloz membran ile çözelti filtre. Dönüşüm tampon fazla bir ay için 4 ° C sıcaklıkta saklanabilir.

4. PMCA kullanma Prion Suşlarının Amplifikasyon

  1. PCR tüp içine 1:20 oranında (PMCA tohum ve PMCA alt tabaka 95 ul, yani karışım 5 ul) de PMCA alt tabaka içine PMCA tohum seyreltilir. -80 15 ul kısım çıkarın ve saklayın ° unsonicated kontrolü için C; Bu unsonicated kontrolü Western Blot (WB) analizi takip proteinaz K (PK) sindirim yoluyla PrP Sc amplifikasyon ölçmek için kullanılacaktır. İlave bir kontrol unsonicated PMCA reaksiyon süresi boyunca 37 ° C sıcaklıkta bir ikinci 15 ul alikot yerleştirilmesi ile oluşturulur olabilir. Üç tekrarları en az istatistiki amaçlar için gereklidir.
  2. Konu Şekil 1 ile ilgili olarak tarif PMCA bir tur için örnek geri kalanı (70 ul) eklendi Panel A. çalkalayın tüpler PCR tüpün kubbeli kapak üzerinde su yoğuşmayı önlemek için her 5 saat.
  3. Numune tüpler aşağı döndü ve yavaşça homog sağlamak için herhangi bir işlem sonrası açmadan önce (çözüm kubbeli kapağı girmeyiz dikkatli olmak) vortekslenerek edilmelidireneity ve potansiyel kontaminasyon.
  4. Kısa bir kuluçka süresi suşları (örneğin, HY TME HaCWD, ya da 263K) seri PMCA (sPMCA) için taze enfekte olmamış 95 ul içine yuvarlak bir ikinci sonicated örnek 5 ul transfer ederek 1:20 oranında sonicated madde seyreltik beyin homojenatı (Şekil 2, Panel B).
  5. Uzun kuluçka süresi suşları (örneğin, DY TME, 139H, 22CH, 22AH, ya da ME7H) arasında sPMCA için, enfekte olmamış taze 50 ul içine yuvarlak bir ikinci sonicated örnek 50 ul transfer ederek 1:1 oranında sonicated madde seyreltik beyin homojenatı (Şekil 2, Panel B).
  6. Önceden seyreltilmiş sonicated karışımı (adımlar 4,4 ya da 4,5) iki alikotları 15 ul çıkarın ve -80 az biri depolamak 37 ° C'de ve diğer ° C (PMCA boyunca iki unsonicated kontrol çözümleri). Bir PMCA yuvarlak iki kalıntıları koşuluyla.
  7. Bu prosedür, süresiz olarak tekrar edilebilir. Laboratuvarımızda, bizdeğişmeden kalan zorlanma özellikleri ile, onbeş PMCA mermi kadar gerçekleştirdik.
  8. PK örnekleri sindirimi. Tipik bir DB, 5 örnek PK 80 ug / ml ila 5 ul (bu çözelti 40 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyon PK sahip olacaktır) ul ve bir saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir karıştırın. Jel yükleme tamponu 10 ul ekle. 10 dakika için bu çözelti kaynatılır. Çözüm soğumasını ve jel içine 10 ul yük olsun.
  9. Amplifikasyon başarı hesaplamak için ya bunları karşılaştırarak amplifiye PrP Sc miktarını tahmin etmek için PK-sindirilmiş örnekler üzerinde WB analizi gerçekleştirmek, unsonicated kontrolleri 20,21 Şekil 2, Panel C veya bilinen miktarda rekombinant PK-sindirilmemiş PrP.

5. Çapraz bulaşma kaçınmak

Kritik adımlar çapraz kontaminasyon ve proteaz dayanıklı ürünler de novo oluşumu nedeniyle yanlış pozitif oluşumunu en aza indirmek için alınması gerekir.

  • Her prion suşu için numune toplama için diseksiyon araçları özel bir kümesi (yani forseps, cımbız, makas) kullanın.
  • PMCA bir alt tabaka olarak kullanılmak üzere etkilenmemiş beyin homojenleştirme öncesinde,% 1 çamaşır suyu ile pipetler temizleyin. 10 dakika süreyle% 1 çamaşır suyu ile sonikatör en PCR tüp raf, doku homojenizatör ve PCR tüp depolama rafları ıslatın ve distile su ile iyice durulayın.
  • Bir taze Versi-kuru Lab Soaker yeni bir numune homojenize edilmesi için her zaman birlikte çalışma alanı Kapak, bir yeni deneme PMCA hazırlanması için, ya da sPMCA mermi arasında aliquoting.
  • Yeni eldivenler yeni örnekler (sPMCA mermi arasında alikotları aktarırken özellikle) ele alınır, her zaman kullanın.
  • Her PMCA döngü için kısa sonication patlamaları kullanın. 10 dakika inkübasyon ile birlikte 5 saniye sonication döngüleri de novo PrP Sc 1,20,21,23,24 oluşturmadan prionlar yükseltmek için yeterlidir. Diğer laboratuarlar gösterildiği gibi, artansonikasyon zaman, sonication genlik artırmak ve PMCA döngü sayısı uzanan de novo PrP Sc oluşumu 2 için olasılığını arttırmaktadır.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Protein misfolding siklik amplifikasyon (PMCA) İn vitro 7 PrP, Sc, 12, 14, 19, 24, yükseltmek için kullanılır. Başarılı amplifikasyon PrP Sc, Şekil 3'te gösterildiği gibi PK-dirençli prion proteini (hamsterden türetilmiş prion suşları için 19 ila 30 kDa geçiş) Western blot üzerinde bant yoğunluğunda bir artış ile gösterilmiştir. Kendi bant yoğunluk artışı sonra PMCA PK-dirençli PrP Sc malzeme amplifikasyon gösterir. Hamsterden türetilmiş prion proteini, HaCWD ve DY TME başarılı bir amplifikasyon PMCA önce (şerit 5 ve 7) ve (şerit 4 ve 6) sonra bant yoğunlukları karşılaştırılması ile, Şekil 3'ün WB analizi gösterilmektedir.

    PrP Sc PK sindirim sırasıyla di-, mono-ve unglycosylated prion proteini, karşılık gelen bir üst, orta ve alt bant göstermektedir WB analizi yapıldı. Bazı prion suşlar kendi elemanlar tarafından ayırt edilebilirctrophoretic hareketlilik. Örneğin, HaCWD ve DY TME prion suşları arasındaki geçiş içinde bir iki-kDa bir fark vardır. (Sırasıyla Şekil 3, yollar 1 ve 2).

    Yüksek bağlılık PrP ​​Sc amplifikasyon PMCA 1, 7, 12, 19, 23, 24 ile sağlanır. Şerit HaCWD ve DY TME için 1 ve 4 ve 2 & 6; bunlara karşılık gelen tohumlar (Şekil 3 ile karşılaştırıldığında PMCA amplifikasyon Bu yüksek sadakat PMCA amplifiye prion suşları (HaCWD ve DY TME) benzer elektroforetik göç görülmektedir sırasıyla).

    Hiçbir çapraz kontaminasyon veya de novo PrP Sc formasyonu oluşursa, sahte kontrol PMCA örneklerinin WB analizi PK sindirimi (Şekil 3, şerit 8 ve 9) sonra açık kalmalıdır.

    Şekil 1
    Şekil 1. Su yoğuşması önlemek için, düzenli bir akvaryum ısı pedi mikroplak boynuz (panel A) kapak üstüne yerleştirilir. Yepyeni sonikatör izin verilmelidir bir hırsızlık yaklaşık iki ay boyunca sürekli sonication dönemi. Panel B break-döneminden sonra titanyum mikroplak boynuzunda erozyon gösterir. Panel C örnekleri optimal bir sonikasyon izin verecek boru PCR bantı olası düzenlemesini göstermektedir.

    Şekil 2,
    Şekil 2.. PMCA (panel A), sPMCA (panel B), ve Dünya Bankası analizi (panel C) Akış şeması. PrP Sc PMCA tohum ve enfekte olmayan beyin homojenat (UN BH) PMCA substrattır. Her bir PMCA yuvarlak için güçlendirilmiş PrP Sc miktarının PMCA önce karşılık gelen bir bant yoğunluk ile PMCA sonra bant yoğunluk bölünmesi ile elde edilir.

    ys "> Şekil 3
    Şekil 3. PK-sindirilmiş HaCWD ve DY TME hamster türetilmiş prion suşların Western Blot. PrP Sc 3F4 anti-prion antikoru kullanılarak tespit edilir. WB Analizi bolluğu (blot yoğunluğu) ve PrP Sc elektroforetik hareketliliği gösterir. PMCA reaksiyon HaCWD (şerit 4-5) ya da DY TME (şerit 6-7) ajanlar, ya ile enfekte hamster beyin homojenatı ile ekildi. Denetimleri (şerit 4 ile 5 ve 7 ile 6 Karşılaştır) - kendi Yükseltilmemiş (PMCA) göre PMCA yapıldı Örnekleri (PMCA +) PrP Sc bolluk içinde bir artış göstermektedir. HaCWD ve DY TME (şerit 1-2) Prion proteinleri arasındaki elektroforetik göç iki kDa fark yoktur. Göç bu fark, HaCWD ve DY TME homojenatı (sırasıyla şerit 4 ve 6), kullanan PMCA üretilen örneklerde korunur. Bulaşmamış beyin (mock) Homojenat ile tohumlanan PMCA reaksiyonlar P yükseltmek için başarısızrP Sc (şerit 8). Moleküler işaretçileri 19 ve 21 kDa için yerle panelin sol için gösterilir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Yükseltici bulaşıcı prion proteinlerin Zorluklar in vivo deneyler uzun inkübasyon süreleri ve giderleri vardır. PMCA tekniği bulaşıcı prion ajanları güçlendirmek için uygun maliyetli bir yoludur. Birkaç laboratuar doğru vitro 7, 9, 12, 14, 19,24 içinde prion suşları yükseltmek için PMCA yeteneğini doğruladı.

    Prion hastalıkları türler arasında aktarılabilir. Bessen ve Marsh etkili iki ayrı hamsterden türetilmiş prion suşları 5 üretilen bulaşıcı vizon ensefalopati ile hamster inoküle var. Zarif bir çalışmada, Telling ve co-workers fare türetilmiş prion zorlanma, RML yükseltmek için sPMCA kullanılan, cervid PrP C ifade transgenik fareler kullanarak - PMCA substrat olarak (Tg (CerPrP) 1536 + /). Hastalık hızlı bir etki başlangıcına Tg aşılama (CerPrP) sonra gözlenmiştir 1536 + / - PMCA-uyarlanmış madde 12 ile. Benzer şekilde, Kurt ve ark. Yükseltmek mümkünolmayan cervid türler PMCA substrat 15 kullanılarak kronik israf hastalığı (CWD), cervids bir prion hastalığı. Bu veriler prion hastalıklarının tür bariyerini PMCA yoluyla in vitro atlanabilir öneririz.

    Bessen ve Marsh uzun kuluçka dönemi meslektaşı DY TME 3, 5 ile karşılaştırıldığında hamsteri en kısa kuluçka dönemi zorlanma, HY TME, daha hızlı bir PrP Sc birikimine sahip olduğunu göstermiştir. Benzer şekilde, kuluçka süresi ve birikim oranı arasındaki ilişki bu çeşitli hamsterden türetilmiş prion suşunun 1, 23, 24, PMCA sonra görülmektedir.

    Amplifikasyon oranı her bir suş için içsel bir özellik olduğunu. PMCA bu oran amplifikasyon ölçmek için kullanılmıştır. Ayers ve diğ., Belirli bir hamsterden türetilmiş prion suşu 1 için amplifikasyon oranını temsil eden bir numara birimsiz olarak adlandırıldı, amplifikasyon katsayısı, hesaplamak mümkün.

    Prionsuşların aynı ana mevcut zaman birbirlerine müdahale edebilirsiniz. Uzun bir kuluçka süresi suşunun varlığı kuluçka süresini uzatmak ya da hastalığa neden olduğu kısa bir kuluçka süresi gerilme kabiliyetini bloke edebilir. Kuluçka dönemi Bu uzantı gerginlik girişim denir. Gerilme parazit fareler ve hamsterler 22, 10 meydana geldiği gösterilmiştir. Bartz ve co-workers hamsterlarda prion gerginlik müdahale incelemek için PMCA kullandık. Onların sonuçları PMCA deneylerde in vivo 22, 23 benzer bir deney bulguları ile ilişkili olduğunu göstermektedir.

    Merkezi sinir sistemi dışındaki PrP Sc bir nispeten düşük düzeyde olduğundan, prionlar sadece doğru bir şekilde immünohistokimya takiben beyin disseksiyon yolu ile ölüm sonrası teşhis edilebilir. Bu PrP Sc 7 dakikalık miktarda yükselterek büyük bir yetenek göstermiştir beri PMCA bile hamsteri idrar sampl dan, tanı aracı olarak kullanılabilires 11.

    Prion ajan sert çevre koşullarına dayanacak ve 16,17 bulaşıcı kalmayı başarabilen. Bununla birlikte, çevre PrP Sc miktarı geleneksel teknikler örneğin WB kullanılarak tespit edilmesi için çok küçüktür. PMCA örneğin toprak ve su 16 gibi PrP Sc çevre miktarını yaklaşık olarak, 17, 20, 21 yükseltmek ve hesaplamak için kullanılmıştır.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Çıkar çatışması ilan etti.

    Acknowledgments

    Biz yazının eleştirel okuma için Dr Vesper Fe Marie Ramos teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 ve G20RR024001) ve Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü ve İnme (2R01 NS052609) tarafından desteklenmiştir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Misonix 3000 Misonix S-3000
    Misonix 4000 Misonix S-4000
    Tenbr–ck Tissue Grinder Kontes 885000-0007
    Neslab EX-7 Water Bath Thermo Electron Neslab EX-7
    0.2 ml PCR Tube Strips Thermo Scientific AB-0451
    Triton X-100 Sigma Aldrich T9284-100ML
    Complete Protease Inhibitor Roche 11 697 498 001
    EDTA J.T. Baker 4040-00
    DPBS Mallinckrodt Baker Mediatech 21-031-CV
    Versi-Dry Lab Soakers Fisher Scientific 14 206 28
    Repti Therm Heater Zoo Med Laboratories, Inc. RH-4

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease. PLoS pathogens. 7, e1001317 (2011).
    2. Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype. PLoS Pathog. 5, e1000421 (2009).
    3. Bessen, R. A., Marsh, R. F. Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent. J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).
    4. Bessen, R. A., Marsh, R. F. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).
    5. Bessen, R. A., Marsh, R. F. Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters. J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).
    6. Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, 757-768 (2008).
    7. Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. Cell-free propagation of prion strains. EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).
    8. Caughey, B., Raymond, G. J. The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive. J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).
    9. Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. Formation of native prions from minimal components in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).
    10. Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. Competition between different scrapie agents in mice. Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).
    11. Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. Detection of infectious prions in urine. FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).
    12. Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers. PLoS Pathog. 4, e1000139 (2008).
    13. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously. J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).
    14. Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature. 370, 471-474 (1994).
    15. Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N. Virology. 387, 3235-3240 (2009).
    16. Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. Environmental sources of scrapie prions. J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).
    17. Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area. Prion. 3, 171-183 (2009).
    18. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, 136-144 (1982).
    19. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411, 810-813 (2001).
    20. Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).
    21. Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type. Journal of virology. , (2011).
    22. Schutt, C. R., Bartz, J. C. Prion interference with multiple prion isolates. Prion. 2, 61-63 (2008).
    23. Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource. Journal of. 84, 5706-5714 (2010).
    24. Shikiya, R. A., Bartz, J. C. In vitro generation of high titer prions. Journal of virology. , (2011).
    25. Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA. Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).

    Tags

    İmmünoloji Sayı 69 Moleküler Biyoloji Genetik Viroloji prion prion algılama sonication PrP PrP Gerginlik, PMCA sPMCA
    Prionlar protein misfolding Döngüsel Amplifikasyon
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Saunders, S. E., Bartz, J. C.,… More

    Saunders, S. E., Bartz, J. C., Shikiya, R. A. Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions. J. Vis. Exp. (69), e4075, doi:10.3791/4075 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter