本文详细介绍了如何使用连续流式缺氧室来生成具有特定氧气浓度的环境2 以理解生物体对氧气浓度降低的响应2该系统易于安装和维护，且具有足够的灵活性，可适应多种O2 浓度与模型系统
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本文内容
摘要
摘要
氧气对所有后生动物的生存至关重要，已知仅有一种例外情况1. 氧气减少2 缺氧状态可能在疾病、正常发育或环境条件变化过程中出现2-5理解细胞在缺氧反应中所涉及的信号通路，可为从中风到癌症等多种人类疾病的治疗策略提供新的见解。这一目标在一定程度上受到技术难题的阻碍，这些难题与在遗传操作便利的模式生物中实现可控缺氧暴露相关。
线虫 秀丽隐杆线虫 非常适合作为研究缺氧反应的模式生物，因其易于培养且可进行遗传操作。此外，还可用于研究细胞对特定缺氧氧浓度的响应2 浓度不会产生混杂效应，因为 秀丽隐杆线虫 获得 O2 （及其他气体）通过扩散作用进行交换，而非通过协助性呼吸系统6已知参与缺氧反应的因子在进化上是保守的 秀丽隐杆线虫实际的缺氧反应取决于 O₂ 的特定浓度2 可获得的。在 秀丽隐杆线虫，暴露于中等程度缺氧会引发主要由 hif-1，高度保守的缺氧诱导型转录因子6-9. C. elegans 胚胎需要 hif-1 在 5,000–20,000 ppm O₂ 条件下存活27,10缺氧是“低于正常氧气水平”的通用术语2. 常氧（正常 O2）也难以界定。我们通常将含210,000 ppm O₂的室内空气视为标准2 为常氧状态。然而，已有研究表明 秀丽隐杆线虫 对 O 具有行为偏好2 浓度为 5-12%（50,000-120,000 ppm O）2)11在幼虫和成虫中， hif-1 可防止在 5,000 ppm O₂ 条件下由缺氧诱导的滞育212。然而， hif-1 在对较低浓度 O 的反应中不起作用2 （缺氧，操作性定义） <10 ppm O2)13在缺氧条件下， 秀丽隐杆线虫 进入一种可逆的休眠状态，其中所有显微镜下可观测的生命活动均停止10不同条件下会产生不同的生理反应，这一事实凸显了在实验中精确控制氧气低浓度水平的重要性。2.
本文介绍一种用于构建和实施环境舱的方法，该环境舱可产生浓度定义明确、可靠且可重复的低氧条件2持续流动法可确保腔室快速达到平衡，并提高系统的稳定性。此外，腔室的透明性和可及性使得能够直接观察暴露于低氧环境中的动物。我们进一步展示了一种有效的收获方法 秀丽隐杆线虫 缺氧暴露后迅速采集样本，这对于观察缺氧条件下发生的诸多快速可逆性变化至关重要10,14该方法提供了一个基本框架，可根据不同实验室的需求进行简便修改，包括适用于不同的模型系统和多种气体。
方案
1. 环境室的构建
- 根据实验规模选择所需最小合理体积的密闭室。密闭室必须由对气体（O2）不渗透的材料制成。可使用Pyrex结晶皿、Anaeropack培养盒或大型铸塑丙烯酸盒（Ellard Instrumentation）。我们发现，一个100 × 50 mm的Kimex结晶皿中可容纳9个50 mm的培养皿。玻璃板可用作Pyrex结晶皿的盖子。
- 在选定的密闭室上钻孔，并安装塑料公鲁尔接头转软管接头（Cole Parmer）。可通过管件接头或环氧树脂固定接头。在容器的另一侧安装类似的接头，以允许气体流入和流出密闭室。如有可能，将孔位错开以增强气体湍流混合效果。
- 准备含有特定O2浓度（以N2平衡）并经O2含量认证的标准压缩气瓶；对于无氧条件，使用高纯N2（<10 ppm O2）。在长期实验中，建议使用自动切换调压阀，以避免干扰密闭室内的氧浓度。
- 已有研究表明，生物体对低氧的反应具有温度依赖性15。通过将密闭室置于培养箱中，可维持不同温度条件。由于培养箱内温度可能分布不均，建议使用温度数据记录仪持续监测密闭室内部的温度。
2. 将气体连接至环境培养箱
- 所有连接均使用外径为1/8英寸的管路，并通过快接接头或压紧式....
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讨论
该方法提供了一种构建低氧环境的策略，可在实验室中维持精确控制氧气浓度的环境。这些培养舱为将生物体暴露于特定低浓度氧气条件下提供了一种简便的方法。2 并监测分子和生理层面的输出结果。所述环境舱由实验室自行组装，而非商业购买，因此可根据实验需求进行调整和修改。
该方法的一个显著优势在于其连续流动设计。这消除了通常在维持低浓度O2 在腔室中，当外部 O2 浓度要高得多（210,000 ppm O2 在室温空气条件下）。另一种方法是停流法，即在密闭腔室中维持低氧环境。即使存在微小泄漏（可能难以检测），也会导致无法通过停流法维持低氧条件。连续气流法通过压缩空气罐中设定氧浓度的气体持续置换腔室内的空气，并维持正压状态，从而防止泄漏干扰低氧环境的稳定。
从气体供应商处获取精确的预混氧气浓度可解决缺氧研究中的另一个难题。测量极低浓度的O2非常困难。大多数O2传感器受限于扩散作用，且价格昂贵。由于O2
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致谢
感谢Miller实验室成员对本文的讨论和审阅。本工作由Nathan Shock衰老基础生物学卓越中心授予DLM的新研究者奖以及美国国立卫生研究院授予DLM的R00 AG030550奖资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 管路（FEP 和 PTFE） | Cole Parmer Tygon | YO-95821-00 (1/8" FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8" PTFE)’ R-3603 | |
| 压缩接头 | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16") 06363-62 (F. coupler 1/16") 06363-60 (M. coupler 1/8") 06363-61 (F. coupler 1/8") | |
| 流量管 | Aalborg | PMR3-010073 (3 输出) PMR1-013520 (1 输出) | |
| 质量流量控制器 | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) | |
| 压缩气体钢瓶 | AirGas | 定制 | |
| 塑料公鲁尔接头转软管接头 | Cole Parmer | 45505-41 (500 系列 1/16") | |
| 铸塑丙烯酸盒 | Ellard Instrumentation | 定制 | |
| 管件（黄铜或不锈钢） | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4" 螺母) B-200-3 (1/8" 三通接头) B-400-set (1/4" 卡套) B-QM2-B1-200 (QM 本体 QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8" 公接头) | |
| 道康宁真空润滑脂 | Sigma-Aldrich | Z273554 | |
| 厌氧袋盒（AnaeroPack box） | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 升) R685025 (2.5 升) R685070 (7.0 升) | |
| Pyrex 气体洗涤瓶 | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) | |
| 棕榈酸 | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| 山羊抗小鼠 IgG-辣根过氧化物酶 | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 | |
| SuperSignal West Pico 化学发光底物 | Pierce Chemical | 34077 | |
| 100 x 50 玻璃结晶皿 | Kimax Kimble | 23000 |
参考文献
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30(2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Ce....
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