Summary
本文详细介绍了如何使用连续流缺氧商会产生与定义的O浓度的大气
Abstract
氧气是必不可少的，所有的多细胞动物的生存与一个已知的例外1。降低O 2的可用性（缺氧）中出现的疾病，发育正常或在2-5环境条件的变化状态。了解细胞信号途径参与缺氧反应可以分为治疗策略提供新的见解，对不同的人类疾病，中风，癌症。已阻碍了这一目标，至少有一部分，控制低氧暴露在模式生物基因服从相关的技术困难。
线虫作为模式生物缺氧反应的研究，因为它非常适合容易培养和基因操纵。此外，它可能没有因为C.影响因子的细胞反应到具体缺氧O 2的浓度研究线虫获得O 2的 （和其他气体扩散），而不是一个促进呼吸道系统6。 在 C已知缺氧反应涉及的因素是保守线虫 。缺氧的实际响应依赖于特定的O 2浓度可用。 在 C 线虫 ，中度缺氧暴露引出一个主要介导的HIF-1的转录反应，高度保守的缺氧诱导转录因子6-9，C。线虫胚胎需要HIF-1在5,000-20,000 ppm的生存Ø2 7,10 。缺氧是一个“O 2的比正常少”的总称。常氧（O 2的正常），也可以是很难界定。我们普遍认为室内空气，这是21万ppm的O 2的是常氧。然而，它已被证明是C。线虫有行为偏好O 2的浓度从5-12％（50,000-120,000 ppm的氧 ）11。在Larvae和成年人，HIF-1的行为，以防止缺氧诱导滞育的5000 PPMØ2 12。然而，HIF-1不玩作用，在低浓度氧 （缺氧，<10 ppm的O 2的操作性定义）13。在缺氧，C。线虫进入一种假死的可逆状态，在所有显微镜下观察到的活动停止10。事实上，出现不同的生理反应，强调在不同条件下的缺氧O 2的浓度在实验控制的重要性。
在这里，我们提出了一个可靠和可重复性缺氧条件下产生的O 2浓度定义的环境商会的建设和实施方法。在不断流的方法，确保迅速达到平衡室，并增加了系统的稳定性。此外，透明度和无障碍商会让动物受到缺氧的直接可视化。我们进一步证明有效的方法收获C.线虫样本迅速缺氧暴露后，这是必须遵守许多的迅速反转的变化发生在缺氧10,14。这种方法提供了一个基本的基础，可以很容易地修改个别实验室的需求，包括不同的模型系统和各种气体。
Protocol
1。建设环境试验箱
- 选择最小的室为您的项目范围内的合理量。商会必须由气体（O）的防渗材料。高硼硅结晶菜，Anaeropack盒，或大型铸铁压克力盒（Ellard仪表），都可以使用。我们已经发现，9 50毫米的钢板可以在100×50 Kimex结晶菜适合。玻璃板可以用作耐热结晶菜肴的盖子。
- 在选定的腔钻一个洞，适合塑料软管倒钩接头（科尔帕默）男性露儿。配件可以保证管件或用环氧树脂。上安装了类似的容器，使气体流向和室对面的拟合。如果可能的话，抵消孔，以增加湍流混合。
- 获得压缩气体罐的定义O 2的浓度（平衡与N 2）认证标准为O 2合作的ntent，或缺氧条件下，纯N 2（<10 ppm的氧气 ）。使用自动开关超过监管的长期研究，以避免破坏商会的氧含量。
- 有机体缺氧反应，已被证明是随温度变化的15。放置在一个孵化室，不同温度下得以维持。孵化器内的温度可能是不平衡的，因此，它是审慎的温度数据记录器的使用，不断测量室内的温度。
2。连接气环境商会
- 对于所有连接，使用的八分之一英寸的外直径管材连接的任一单元连接器或压缩配件。油管应该是不透水和反应活性氧 ，如氟化乙烯丙烯（FEP）的或尼龙（科尔帕默）。为完成安装示意图， 见图1。
- 连接的COM压气罐，流量控制设备，如质量流量控制器（塞拉利昂工具）或浮子（奥尔堡）。确保坦克从上游的压力范围内流装置和软管倒钩配件。两个阶段的监管一般都采用与第二阶段设置所需的压力，选择适当的流量第三节]
- 天然气水合物通过蒸馏水使用熔块气缸的气体洗瓶由冒泡，然后直接到一个环境试验箱配件，离开尾气开放第二件（ 见图1）。对于短期研究，气体水化防止板dessication的，但湿度监测可能需要长期研究。
- 道康宁真空润滑脂可用于密封腔。室盖的地方权重，以确保不透气的密封。要确认密封和充足的流动，保持水的小水池，在手掌的y我们戴着手套的手出室装修和检查气泡。
3。选择流量
- 假设完美的混合，有90％的气态大气气体交换室的体积取代（菲克法）的时间。例如，在100毫升与100毫升/分钟的流量室，室在原来的房子空气将被替换为您想要1分钟后气体的90％，接近90％，每分钟将渐近完整的交换其后。
- 较高的流速和较小的容器将更快地达到你所需的氧气浓度。 100×50 Kimex容器（400毫升），120毫升/分钟的流量将达到99.9％，在10分钟的交流（交流）。这个流量是适合大多数氧条件。我们的知识，有没有一个系统的调查O 2浓度的变化速率如何影响反应在 C 线虫 。
- 暴露于缺氧条件下的蠕虫病毒通常逃脱琼脂平板表面。为了防止这种情况，周围板块边缘的棕榈酸（10毫克/毫升乙醇）放置一个环。棕榈酸会出来的解决方案，作为乙醇蒸发，形成了一个物理屏障。棕榈酸障碍，不影响产蛋，繁殖或在 C寿命率线虫 16,17。穴居在缺氧条件下不会发生更频繁，所以额外的预防措施，一般都不是必需的。
- 同步生成在碱性漂白液对非种子选手线虫的生长介质（NGM的）板18小滴漂白妊娠成人的人群。对比标准大批量的次氯酸钠漂白协议，挑NGM的钢板表面的漂白剂溶液滴在1-100动物，然后让漂白粉溶液吸收板
- 避免暴露漂白胚胎缺氧，因为这可以减少活力13。收集幼胚（2-4细胞），妊娠的成年人被砍伤，在水的体积小，用刀片和移动通过口吸管板胚胎随后暴露缺氧的。
- 同步生成在碱性漂白液对非种子选手线虫的生长介质（NGM的）板18小滴漂白妊娠成人的人群。对比标准大批量的次氯酸钠漂白协议，挑NGM的钢板表面的漂白剂溶液滴在1-100动物，然后让漂白粉溶液吸收板
- 在环境舱的密封板。在常氧（室内空气）控制动物应保持在相同的温度视为蠕虫。有没有观察到样品留在室内空气，保持室内空气流淌在他们的相同室之间的差异。启动气体流量和维护所需的时间曝光。为了确保在坡道均匀，一定要取代之前曝光的气体洗瓶水。
- 检测胚胎的生存，让蠕虫发展48小时后，返回到室内空气中，在这一点他们应该是第四阶段的幼虫/第一天的成年人。分数为求生存，以审查任何不能占的蠕虫。
- 可视化动物缺氧，移动蠕虫的M9上下降了22毫米2盖玻片，并在M9 18日到2％琼脂糖垫反转。如果必要，左旋咪唑（25毫米）或叠氮化钠（10毫米），可以用作麻醉剂。叠氮化钠和左旋咪唑由于毒性可能混淆了一些意见和应该被明智地使用19。
5。低氧暴露蠕虫（例如：HIF-1的西方分析的样品制备的快速收获）
许多缺氧诱导效应迅速扭转后，返回到室内空气中，包括恢复产蛋量12，有丝分裂表位的磷酸化13在胚胎发育和退化的HIF-1蛋白9,20。缺氧的动物的快速隔离是必需的，在这些条件下获得的重现效果。有了这个设置，动物可以收获和液氮冷冻，在不到两分钟。虽然手套箱缺氧商会在缺氧条件下，允许的样品操纵的成本和实用性比缺氧条件限制其效用。
- 布里斯托尔氮气蠕虫增长4个10厘米高增长（HG）板，直到大部分的蠕虫病毒是妊娠成人18。 15 mL锥形管中以1:5碱性漂白粉溶液洗蠕虫和轮流孵化，直到蠕虫开始溶解，不超过5分钟9。洗蠕虫与M9的三倍，在1500 XG彼此之间没有制动洗下来纺纱。
- 到8 150毫米NGM的板和板漂白胚胎允许发展到L4幼虫（〜48小时布里斯托尔氮气在22°C）。板块移动环境试验箱和暴露在低氧（百万分之一千，5000 PPM）和缺氧（N2），4个小时的条件。根据实验设计，曝光时间会有所不同。虽然暴露缺氧对产蛋率有立竿见影的效果，两个细胞的胚胎，16日至18日曝光12小时后死亡。与此低氧室设置，曝光下限受制于必要的气氛中交换达到平衡率。
- 一个标签为1.5 mL离心管和一个15毫升锥形管每个实验样本。缺氧的蠕虫更容易坚持管双方在收获。为了防止这种情况，地方100μL1％十二烷基硫酸钠（SDS），在每15毫升锥形管。如果SDS抑制下游应用，牛血清白蛋白（BSA）可以用来严防死守。常规使用的SDS或BSA似乎并不有一个明显的差异。加入50μL2X蛋白样染料（4％SDS，10％2 - 巯基乙醇和溴酚蓝30％甘油（W / V））1.5毫升离心管追踪。有液氮的杜瓦准备。
- 缺氧和记录删除蠕虫后，时间步骤。取下盖子缺氧室，一个样板，并重新密封腔。用蒸馏水洗到尼龙过滤器的蠕虫，然后倒入15毫升锥形管。在台式离心机旋转的蠕虫在1500 XG与制动的15-20秒。
- 使用真空大部分从管中取出上清液，留下的蠕虫病毒颗粒不变。
- 使用吸管，将在50微升至1.5 ml离心管中的蠕虫病毒颗粒。密封管和浸在液态氮。
- 重复，直到所有的样品已被隔离。室内空气样品的一致性控制遵循这些程序。样品可存放于-20°C。
6。代表结果
缺氧有机体的影响可以看出通过审查的可行性C 的成年线虫 （ 图2）。室内空气氧浓度（O 2的 21万PPM），奠定了野生型的布里斯托（N2）和HIF-1（ia04）缺失突变体的胚胎全部存活。 氮气蠕虫是能够适应和生存在5000 ppm的直径2至成年，而HIF-1的胚胎是不可行的。这表明，HIF-1是为适应不断变化的环境10氧水平的关键。无论是氮气，也不HIF-1的动物可以生存暴露于1,000 ppm的氧气 。
缺氧蠕虫直接可视化的使用范围和明确的容器（ 图3）解剖上是可行的。直接放置在低氧室的解剖范围，也没有必要从缺氧蠕虫观察有机体反应。的范围可以装有荧光illumation的（ 如图3
图1。低氧室。气流方向的例子是用箭头表示。气体存储在定义的O 2的浓度（1）和连接两个阶段调节器（2）压缩气体罐。气体进入流管（3）的底部，顶部的退出在正确的流量。气体，然后流入泡沫瓶（4），保湿气体（确保正确的连接，通过观察气泡泡沫瓶）。水合天然气，然后将其传递到流入阀（5）在低氧室，暴露样品缺氧。最后的气体通过排气口钻室的房间的通风口进入。
图2。胚胎暴露于1000ppm的O 2的 5000 PPMØ可行性
图3。 C 的可视化线虫缺氧显微镜。蠕虫暴露对缺氧的使用方法概述。直接置于透明的环境室（构建具有耐热结晶菜和玻璃板）上的解剖范围的阶段。两种观点都表明，一个包括整个气流量设置，只用显微镜舞台上腔。
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Discussion
这种方法提出了一个缺氧的环境，允许精确的氧气浓度维持在实验室环境建设的战略。这些商会提供了一个简单的方法暴露生物体特定的低浓度的O 2和监测的分子和生理输出。环境试验箱组装实验室，而不是商业购买，因此可以进行修改，以满足实验的需要。
这种方法的一个明显优势是连续流设计。这消除了通常与维护商会O 2的低浓度时，外部的氧浓度要高得多（21万PPM室内空气中的氧 ）所遇到的困难。另一种方法是停流的方法，在缺氧的环境中保持在一个密封腔。即使是小规模的泄漏，可能很难检测，预发泄维护缺氧条件下使用停流方法的。连续流动法不断交流室压缩空气罐中的氧气浓度与空气并保持正压，以防止破坏缺氧条件下的泄漏。
获取准确，预混合气体供应商的氧气浓度，解决了缺氧的另一个难题。测量O 2的浓度极低，这是相当困难的。大多数氧传感器扩散有限，而且相当昂贵。因为O 2的扩散缓慢，测量低O 2的浓度可缓慢或不准确21。相反，它是很容易产生气体混合物通过测量气体的重量。我们经常购买的混合物的认证标准是O 2所需的混合含量在2％以内。
这种方法可以用来引出观察Ĥ在ypoxia诱导有机体和分子水平的变化。虽然这种方法概述生存分析和快速分子实验的全虫隔离，有无数的可用于下游的读数。例如，这样的设计使蠕虫在缺氧的实时行为和记者结构的变化研究的可视化方向。可视化与解剖范围的蠕虫，装配室，使用透明包装盒，体积小，最小的高度。可以放在整个腔解剖的范围和最优的可视化是很容易的机动性（ 见图3）。它也有可能在更高的放大倍率灌注室用倒置显微镜观察样品。这需要一些适应的商会接口与管通常用于气体流量，并确定一个合适的流速。代表结果表明，仅划伤表面的实验possibilities，因为缺氧，已被证明影响DNA合成的蛋白质降解22,23蜂窝系统。
这种方法的实际性质并不局限于C。线虫。只要使用适当规模的室，这个方法是很容易适应几乎任何模型系统。适应液体介质或细胞培养，在溶液中的氧气扩散常数，从塑料和时间，以平衡文化出气，必须考虑到，它可能是最合适的使用O 2渗透文化板块24,25。
它是可以修改使用其他气体在此协议中提出的商会。例如，商会可以适应省略O 2的压缩气体罐，用来创建一个缺氧室充满氮气的平衡，只是提供一个缺氧的环境。这使得C 的观察线虫在SUSP截至动画（数据未显示）10,13,26。必须使用的气体混合物的性质的基础上稍作修改。使用管道燃气的进入和退出枪膛油管的组成可能有变化。有些塑料是渗透到CO 2，而另一些不兼容的腐蚀性气体，如硫化氢（H 2 S的 ）16,26。科尔 - 帕默的网站上可以找到兼容塑料列表。
对于有毒气体的气室的插座必须成为一个合格的通风柜和适当的个人防护，如探测器，发泄，必须雇用。此外，任何潜在的有害气体的实验开始前的EH＆高级职员应咨询。腐蚀性气体，可能还需要特别注意。例如，H 2 S的腐蚀许多标准油管材料以及黄铜配件，会腐蚀塑料。我们通常使确保任何潮湿泰德塑料法器与H 2 S的Kalrez或相当于某些气体可能与自来水中的杂质，所以DIH 2 0应使用泡沫瓶。可能还需要特别考虑有关玻璃器皿;例如，H 2 S的必要设备与湿润O形圈。
利用它可以在一天完成的实验观察有机体和分子的变化。这种能力迅速推出样品缺氧衰老和癌症的发展领域提供了一个宝贵的工具。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢米勒实验室成员讨论和批判性阅读的手稿。这项工作是支持的弥敦道冲击卓越中心由新研究者奖老化DLM和国家机构的健康奖R00为AG030550到DLM的生物学基础。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon | YO-95821-00 (1/8" FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8" PTFE)’ R-3603 | |
| Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16") 06363-62 (F. coupler 1/16") 06363-60 (M. coupler 1/8") 06363-61 (F. coupler 1/8") | |
| Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) | |
| Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) | |
| Compressed gas tank | AirGas | Made to order | |
| Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16") | |
| Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order | |
| Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4" nut) B-200-3 (1/8" union tee) B-400-set (1/4" ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8" male conn) | |
| Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | |
| AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) | |
| Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) | |
| Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 | |
| 100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |
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