Summary
Isolamento de linfócitos usando a Miltenyi MACs kit é uma maneira confiável para purificar as células de todo homogeneizados de tecido linfóide. Células purificadas usando o sistema Miltenyi são tipicamente ≥ 96% pura. Aqui, nós demonstrar as medidas tomadas para isolar células CD4 + T, um dos muitos kits oferecidos pela Miltenyi.
Abstract
Isolamento de células a partir da fonte primária é um passo necessário em muitos protocolos mais complexos. Miltenyi oferece kits para isolar as células de vários organismos, incluindo seres humanos, primatas não-humanos, ratos e, como descrevemos aqui, camundongos. Separação magnética de células baseado em grânulos permite tanto a seleção positiva (ou depleção de células), bem como seleção negativa. Aqui, demonstramos seleção negativa de CD4 ve intocadas ou nd + células T helper. Usando este protocolo padrão que normalmente purificar as células que estão ≥ 96% CD4 pura + / CD3 +. Este protocolo é usado em conjunto com a dissecação de protocolo e 2-Photon Imagens de linfonodos periféricos em camundongos publicado na edição de 7 de Jove, para purificação de células T e outros tipos de células para adotivamente transferência para fins de imagem. Embora nós não demonstramos análise FACS neste vídeo de protocolo, é altamente recomendável para verificar a pureza total de células isoladas usando os anticorpos adequados via FACS. Além disso, demonstramos o método não-estéril de isolamento de células T. Se as células estéreis são necessários para o seu aplicativo do usuário final particular, não se esqueça de fazer todos os procedimentos demonstrado na capa de cultura de tecidos sob condições padrão estéril. Obrigado por assistir e boa sorte com suas próprias experiências!
Protocol
Por favor, leia e siga o protocolo incluído no kit Miltenyi ou online em http://www.miltenyibiotec.com/ .
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Discussion
Isolamento de células a partir da fonte primária é um passo necessário em muitos protocolos mais complexos. Miltenyi oferece kits para isolar as células de vários organismos, incluindo seres humanos, primatas não-humanos, ratos e, como descrevemos aqui, camundongos. Separação magnética de células baseado em grânulos permite tanto a seleção positiva (ou depleção de células), bem como seleção negativa. Aqui, demonstramos seleção negativa de CD4 ve intocadas ou nd + células T helper. Usando este protocolo padrão que normalmente purificar as células que estão ≥ 96% CD4 pura + / CD3 +. Embora nós não demonstramos análise FACS neste vídeo de protocolo, é altamente recomendável para verificar a pureza total de células isoladas usando os anticorpos adequados via FACS. Além disso, demonstramos o método não-estéril de isolamento de células T. Se as células estéreis são necessários para o seu aplicativo do usuário final particular, não se esqueça de fazer todos os procedimentos demonstrado na capa de cultura de tecidos sob condições padrão estéril.
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Acknowledgments
Queremos agradecer Rebecca Paquett para a preparação de tampão MACS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS Buffer | Reagent | None | None | Prepare as described by Miltenyi. |
| CD4+ T cell Isolation Kit: Untouched Isolation | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-090-860 | For use with the Miltenyi system. |
| Sterile Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Reagent | For use in the preparation of MACS buffer. | ||
| Corning 35mm Not TC-Treated Culture Dish | Other | Corning | 430588 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 70 micron Cell Strainer | Tool | BD Biosciences | 352350 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 6 mL Syringe | Tool | Tyco Healthcare, Covidien | 8881516051 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Reagent | Invitrogen | 14200-075 | For use in RBC lysis. |
| Sterile Water | Reagent | Sigma-Aldrich | W4502 | For use in RBC lysis. |
References
- Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
- Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node. J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).
