Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

In vitro analyse van PDZ-afhankelijke CFTR Macromoleculaire signaalcomplexen

Published: August 13, 2012 doi: 10.3791/4091
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Wayne State University School of Medicine, 2Cardiovascular Research Institute, Wayne State University School of Medicine, 3Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine

Summary

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), een epitheliale chloride kanaal, is gemeld om te communiceren met verschillende eiwitten en belangrijke cellulaire processen te reguleren, onder wie de CFTR PDZ motief-gemedieerde interacties zijn goed gedocumenteerd. Dit protocol beschrijft methodes die we ontwikkeld tot een PDZ-afhankelijke CFTR macromoleculaire signaleren van complexe monteren

Abstract

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), een chloride kanaal voornamelijk gevestigd zijn op de apicale membranen van epitheliale cellen, speelt een cruciale rol in transepitheliaal vloeistof homeostase 1-3. CFTR is betrokken bij twee belangrijke ziekten: cystische fibrose (CF) 4 en secretoire diarree 5. In CF, is de synthese of functionele activiteit van het CFTR Cl-kanaal verminderd. Deze aandoening treft ongeveer 1 op de 2.500 blanken in de Verenigde Staten 6. Overmatige CFTR-activiteit is ook betrokken in geval van toxine-geïnduceerde secretoire diarree (bijvoorbeeld door cholera toxine en warmte stabiele E. coli enterotoxine), die cAMP of cGMP productie in de darm 7 stimuleert.

Opstapelen van bewijsmateriaal dat suggereert het bestaan ​​van fysieke en functionele interacties tussen CFTR en een groeiend aantal andere eiwitten, waaronder vervoerders, ionkanalen, receptoren, kinasen, fosfatasen, signaaling moleculen en cytoskelet elementen en deze interacties tussen CFTR en bindende eiwitten aangetoond kritisch bij de regulering CFTR-gemedieerde transepitheliaal ionentransport in vitro en in vivo 8-19. In dit protocol richten we ons alleen op de methoden die helpen bij de studie van de interacties tussen CFTR carboxyl-terminale staart, die een eiwit-bindend motief bezit [aangeduid als PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motief], en een groep van raamwerk eiwitten die een specifieke binding module bevatten genoemd PDZ domeinen. Tot nu toe zijn verschillende PDZ raamwerk eiwitten is gerapporteerd dat de carboxyl terminal staart van CFTR binden met verschillende affiniteiten zoals Nherf1, Nherf2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-geassocieerde ligand), Shank2 en 20-27 bevatten. De PDZ motief in CFTR dat wordt herkend door PDZ steiger eiwitten is de laatste vier aminozuren aan de C-terminus (dat wil zeggen, 1477-Dtrl-1480 in de menselijke CFTR) 20. InteressantCFTR kunnen binden meer dan een PDZ-domein van zowel NHERFs en PDZK1, zij het ​​met verschillende affiniteiten 22. Dit multivalency met betrekking tot CFTR binding is gebleken functionele betekenis suggereert dat PDZ raamwerk eiwitten kunnen vorming van CFTR macromoleculaire vergemakkelijken signaalcomplexen specifieke / selectieve en efficiënte signalering in cellen 16-18.

Meerdere biochemische testen zijn ontwikkeld om te studeren CFTR-met eiwit interacties, zoals co-immunoprecipitatie, pull-down test, paarsgewijs bindingstest, colorimetrische paarsgewijs bindingstest, en macromoleculaire complexe assemblage-test 16-19,28,29 . Hier richten we ons op de gedetailleerde procedures voor het samenstellen van een PDZ motief-afhankelijke CFTR-bevattende macromoleculaire complex in vitro, die op grote schaal wordt gebruikt door ons laboratorium om eiwit-eiwit of domein-domain interacties van CFTR 16-19,28,29 te bestuderen.

Protocol

1. Expressie en zuivering van recombinante Tagged fusie-eiwitten in bacteriën

  1. Versterken gedefinieerd gebieden van de C-staart (de laatste 50 tot 100 aminozuren met de PDZ motieven in C-terminus) voor CFTR, LPA 2 MRP2, MRP4, β 2 AR en NHERFs (full-length of PDZ1 of PDZ2 domeinen ) met PCR benadering.
  2. Kloon de PCR producten in pGEX4T-1 vector voor GST-fusie-eiwitten (zoals GST-NHERFs, GST-MRP4 CT) pMAL-C2 vector voor MBP-fusie-eiwitten (zoals MBP-β 2 AR CT, MBP-CFTR CT ) en pET30 voor zijn-S-fusie-eiwitten (zoals His-S-CFTR CT, zijn-S-PDZK1).
  3. Transformeer in een protease-deficiënte E. coli stam (BL21-DE3) mogelijke recombinant eiwitafbraak minimaliseren.
  4. 'S nachts Grow de cultuur bij 37 ° C in Luria-Bertani medium (pH 7,0) met de juiste antibiotica (zoals ampicilline of kanamycine). Verdun de nacht cultuur 1:10 en groeien nog 2 uur bij 37 ° C. Induce met 0,5-1 m M IPTG komende 4 uur bij 30 ° C. Pellet de cellen door centrifugeren bij 8000 g gedurende 10 min bij 4 ° C.
  5. Lyseren van de cellen in Sucrose buffer (50 m M Tris-HCl, pH 8,0, 1 m M EDTA, 1 m M PMSF en 10% sucrose) met lysozym (1 mg / ml), 0,2% Triton X-100, en protease remmers. Gebruik 20 ml voor celpellet afkomstig van 1 L van cultuur.
  6. Meng op een roterende schud gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
  7. Spin bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Verzamel de heldere bovenstaande vloeistof.
  8. In de heldere supernatant, voeg 1 ml van de volgende hars / agarose parels (50% slurry in Sucrose Buffer):
    • Glutathion agarose parels voor GST fusie-eiwitten.
    • Talon kralen voor Zijn-S fusie-eiwitten.
    • Amylose hars MBP fusieproteïnen.
  9. Mix gedurende 4 uur bij 4 ° C op een roterende schudder.
  10. Was de kralen door resuspenderen in 1x PBS (15 ml), het mengen van 2 min, spinnen bij 800 x g gedurende 2 minuten en de supernatant. Herhaal deze stap voor zes keer.
  11. Elueer het eiwit van de bolletjes met respectieve elutiebuffer (2 ml elutiebuffer per 1 ml van korrels).
    • Elutiebuffer voor GST fusieproteïnes: 25 m M Tris-HCl (pH 8,0), 140 m M NaCl en 20 m M gereduceerd glutathion.
    • Elutiebuffer Zijn fusieproteïnen: 20 m M Tris-HCl (pH 8,0), 500 m M NaCl en 200 m M imidazool.
    • Elutiebuffer voor MBP fusieproteïnen: 20 m M Tris-HCl (pH 8,0), 200 m M NaCl, 1 m M EDTA, 1 m M DTT en 10 m M maltose.
  12. Dialyze het geëlueerde eiwit tegen 2 L van 1x PBS bij 4 ° C (mogelijke eiwitafbraak vermijden). Wijzig PBS om de 4 uur voor vier keer. Concentreer de proteïne met een Centricon filter (10.000 MW afgesneden, Millipore) en slaan de kleine aliquots bij -80 ° C.
  13. Dethermelijnen de eiwitconcentratie van de Bradford methode. Beoordelen eiwitkwaliteit door SDS-PAGE met BSA als standaard. Als de integriteit van het eiwit niet bevredigend is de secundaire zuivering zoals gelfiltratie of ionenwisseling worden. (Bijvoorbeeld, hebben wij een G-75 Sepharose kolom verder te zuiveren GST-fusie-eiwit).

2. Cel Cultuur en cellysaat Voorbereiding

  1. Cultuur baby hamster nier (BHK) cellen die stabiel over-express CFTR-wt en CFTR-his10 of BHK cellen die tijdelijk over-express Flag-LPA 2-wt of Flag-LPA 2-ΔSTL en Madin-Darby Canine Kidney (MDCK ) cellen die stabiel overexpressie MRP2 in Minimum Essential Medium Eagle's (MEM) 10% foetaal kalfsserum en penicilline / streptomycine in polystyreen flessen bij 37 ° C met met 5% CO2.
  2. Cultuur humane embryonale nier 293 (HEK293) cellen die stabiel over-express CFTR-wt en CFTR-his10 in Dulbecco'S gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum en penicilline / streptomycine in polystyreen flessen bij 37 ° C met 5% CO2.
  3. Lyseren van de cellen in lysisbuffer (PBS - 0,2% Triton-X-100 aangevuld met een mengsel van proteaseremmers die 1 m M fenylmethylsulfonylfluoride, 1 pg / ml aprotinine, 1 pg / ml leupeptine, 1 pg / ml pepstatine) gebruik 500 ul lysisbuffer per 60 mm petrischaaltje en 1000 ul lysisbuffer per 100 mm petrischaal.
  4. Rock de cellysaten gedurende 20 min bij 4 ° C en het onoplosbare materiaal door centrifugeren bij 16.000 xg verwijderen gedurende 15 min bij 4 ° C. Bepaal de eiwitconcentratie van de Bradford-test.

3. In Vitro Montage van een CFTR-bevattende Macromoleculaire Complex (CFTR-PDZK1-MRP4)

  1. In 200 ul van lysis buffer (PBS - 0,2% Triton-X 100 + protease-remmers), voeg 20 ug gezuiverd GST-MRP4-C terminal50 aa (CT50) fusie-eiwit.
  2. Voeg verschillende hoeveelheden (0-40 ug) gezuiverd His-S-PDZK1 fusieproteïne.
  3. Meng de twee eiwitten in een roterende menger bij 22 ° C gedurende 1-2 uur.
  4. Voeg 20 ul glutathion parels (50% suspensie) in het eiwitmengsel, en verder mengen nog 1 h. Deze stap wordt ook wel paarsgewijze binding.
  5. Gedurende deze tijd, de voorbereiding van de HEK293 cellysaten met een overexpressie van Vlag-CFTR (WT), zoals hierboven in stap 2 beschreven).
  6. Tweemaal wassen complex met lysisbuffer. Spin op 800 xg gedurende 1 min voor elke wasbeurt en zorgvuldig het supernatant te zuigen na elke wasbeurt. Wees voorzichtig niet te zuigen uit de kralen in de bodem.
  7. Voeg de hierboven bereide HEK293 cellysaten de kralen en voorzichtig bij 4 ° C gedurende 3 uur gemengd (of een nacht).
  8. Was de korrels uitgebreid driemaal met lysisbuffer zoals beschreven in stap 3.6).
  9. Elueer de eiwitten met behulp van 30 ul monster buffer (5 ×): 0,6 M Tris-HCl (pH 6,8), 50% glycerol, 2% SDS en 0,1% broomfenolblauw, bevattende 5% β-mercapto-ethanol.
  10. Incubeer in 37 ° C waterbad gedurende 10-15 min, en draaien bij 5000 g gedurende 30 s te precipiteren de korrels.
  11. Laad alle het eluaat op 4-15% gel.
  12. Run SDS-PAGE voor ongeveer 30-40 minuten.
  13. Overdracht eiwitbanden de PVDF membraan, 1,5 uur.
  14. Blok het membraan TBS-Tween met 5% niet-vet melk.
  15. Incubeer de membraan met primaire antilichaam (zoals anti-CFTR IgG, R1104) bij 4 ° C, 's nachts.
  16. Was het membraan met TBS-Tween gedurende 5 minuten zes keer.
  17. Incubeer de membraan met secundair antilichaam (zoals geit anti-muis HRP geconjugeerde antistof 2e) gedurende 45 min bij 22 ° C.
  18. Was het membraan met TBS-Tween gedurende 5 minuten zes keer.
  19. Visualiseer de eiwitbanden via ECL.
  20. Representatieve zijn weergegeven in figuur 1.
jove_title "> 4. representatieve resultaten

Een voorbeeld van CFTR bevattende macromoleculair complex signaal is gemonteerd in vitro is weergegeven in figuur 1. Een macromoleculaire complex werd gevormd tussen MRP4 C-terminale 50 aminozuren (MRP4-CT50), PDZK1, en ​​full-length CFTR (Figuur 1, onderaan). De complexvorming verhoogde dosisafhankelijk met toenemende hoeveelheden van de intermediaire eiwit PDZK1 (figuur 1 onder) 18.

Figuur 1
Figuur 1. Een aanschouwelijke representatie van de macromoleculair complex assay (boven). Een macromoleculair complex waargenomen in vitro met drie eiwitten (GST-MRP4-CT50, zijn-S-PDZK1 en Flag-CFTRwt) in een dosis-afhankelijke wijze (onder) 18.

2 AR (ref. 14) CFTR-Nherf2-LPA 2 (ref. 15) CFTR-PDZ eiwitten-MRP-2 (ref. 17) CFTR-PDZK1-MRP4 (ref. 16)
Affiniteit kralen Amylose hars S-eiwit agarose Amylose hars Glutathion agarose
Gezuiverd eiwit-1 MBP-β 2 AR CT His-S-CFTR CT MBP-CFTR CT GST-MRP4 CT
Gezuiverd eiwit-2 GST-Nherf1 GST-Nherf2 GST-PDZ eiwitten His-S-PDZK1
Gezuiverd eiwit-3 (of cellysaten) CFTR-wt of CFTR-his10 (BHK-of HEK cellysaten) VlagLPA-2-wt of Flag-LPA 2-ΔSTL (BHK cellysaten) MRP2 (MDCK cellysaten) Gezuiverd Flag-CFTR-wt of CFTR-his10 (of cellysaten)
Antilichaam Anti-CFTR IgG Anti-Flag HRP Anti-MRP2 IgG Anti-Flag HRP

Tabel 1. Samenvatting van verschillende CFTR-bevattende complexen macromoleculaire gemonteerd in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit protocol we aangetoond dat een werkwijze voor in vitro montage en detectie van een CFTR met macromoleculaire signaleringscomplex met gezuiverde eiwitten (of eiwitfragmenten) en / of cellysaten Zoals eerder 16-19,29,30. Om dit te bereiken de beste resultaten de volgende kritische punten tijdens de voorbereiding vereisen speciale aandacht:

  • Het is belangrijk dat de pH van de elutiebuffer aangepast tot 8,0 na toevoegen gereduceerd glutathion als zuivering van GST-fusieproteïne zoals beschreven in stap 1). De pH kan zo laag als 3,0 na de toevoeging van gereduceerd glutathion. Indien de pH niet bijgesteld voor elutie wordt het rendement van elutie drastisch verminderd.
  • Wanneer eiwit wordt geëlueerd uit de kralen, moeten ze meteen worden gedialyseerd, anders, het gezuiverde eiwit zou kunnen komen van de oplossing. Als eiwit dialyse niet mogelijk is direct na de elutie proces, niet elueren het eiwit en laat ze met ee agarose / kralen.
  • Het wordt sterk afgeraden om het CFTR-bevattende macromoleculaire complex monsters voorbereid op Western Blot en CFTR-aggregatie is een veelvoorkomend probleem koken. In plaats daarvan moet de monsters worden verwarmd bij 37 ° C gedurende 10-15 minuten voor dat in de gel.
  • Voor het eiwit complex met lage affiniteit interactie, kan de immunoblot worden gevisualiseerd met behulp van SuperSignal West Femto (of Pico) Maximale gevoeligheid Substraat (Pierce) om het signaal te verhogen.

De techniek blijkt hier biedt een handige en reproduceerbare test voor het biochemisch definiëren van een CFTR-bevattende tertiaire eiwitcomplex. Er zijn meerdere manieren om de montage in vitro CFTR macromoleculaire complexen zoals aangegeven in tabel-1.

  • Met het oog op overtuigende resultaten te verkrijgen, moet men proberen om de complexe montage in beide richtingen, dat wil zeggen, i) CFTR - PDZ scaffold proteïne (s) - de derde eiwit, ii) de derde eiwit - PDZ steiger eiwit (s) - CFTR.
  • Om aan te tonen de PDZ motief afhankelijkheid van de macromoleculaire complexvorming CFTR-his10 (CFTR-his10 bevat 10 zijn residuen in het C-terminale staart dit eiwit een interne PDZ motief en niet binden NHERFs 29), eiwitten met PDZ motieven gemuteerde of verwijderd (zoals β 2 AR-L413A, LPA 2 ΔSTL, enz.) kunnen worden gebruikt in parallel in de macromoleculair complex assay ook.
  • In plaats van de gehele lysaten van cellen bevatten vele andere componenten kan men gezuiverde eiwitten (de derde eiwit) gebruikt in de stap 3.7) (zoals bij de assemblage van MRP4-PDZK1-CFTR, we ook het gezuiverde Flag-CFTR, ref 18).. Dit biedt haar gevolg van een enkel tri-eiwit complex, daar slechts 3 gezuiverde eiwitten in het geheel systeem.

Echter, de detectie van het CFTR macromoleculair complex in vitro met zuiveringed eiwitten (of eiwitfragmenten) of lysaten van cellen die een overexpressie van CFTR of de interagerende eiwitten niet aangeven of de macromoleculaire signalering complex bestaat in cellen die endogeen uitdrukkelijke deze interactie eiwitten. Om dit probleem aan te pakken, kan co-immunoprecipitatie worden uitgevoerd om de endogene CFTR complexen in cellen, zoals epitheelcellen 16 te beoordelen en epitheelcellen gut 17,18. Bovendien kan massaspectrometrische analyse en 2-dimensionale gelelektroforese 29 worden uitgevoerd om onbekende bindingspartners voor CFTR te identificeren. Het is echter buiten het kader van dit protocol deze technieken tonen.

Bovendien kan de subcellulaire lokalisatie van eiwitten in vivo interactie beïnvloeden moleculaire interacties. Zo is MRP4 aangetoond worden uitgedrukt in zowel apicale en basolaterale membraan, terwijl CFTR voornamelijk gelokaliseerd in het apicale membraan, maar zij zijn deRingrot om fysiek en functioneel met elkaar via de PDZ schavot eiwit PDZK1 18. Bovendien overexpressie van het recombinante eiwitten, zoals in het huidige protocol kan van invloed zijn subcellulaire lokalisatie en dus kunnen interacties die anders zou optreden. Deze mogelijkheid moet ook rekening worden gehouden bij het interpreteren van de gegevens en extrapolatie van de bevindingen.

Hoewel het huidige protocol richt zich op de procedure in elkaar te zetten PDZ-afhankelijke CFTR-bevattende macromoleculaire complexen, dit protocol heeft ook mogelijke toepassingen bij het monteren van niet-CFTR betrokken multi-eiwit complex (hetzij PDZ-afhankelijke of onafhankelijke). Meest recent, het gebruik van deze macromoleculaire assemblage test, hebben we aangetoond dat een chemokine receptor CXCR2 fysiek een eiwit complex vormt met zijn downstream-effector PLCβ 2 gemedieerde via Nherf1 in neutrofielen, en dit CXCR2 macromoleculaire complex beschikt over functionelerelevantie als het verstoren van de complexe (via het gebruik van een exogene CXCR2 peptide) aanzienlijk verzwakt neutrofiele functies 31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Ons werk werd ondersteund door subsidies van de American Heart Association (Groot-Zuidoost Affiliate) Begin-subsidie-in-aid 0765185B, de Elsa U. Pardee Foundation onderzoek te verlenen, en Wayne State University intramurale het opstarten van het fonds en de Cardiovascular Research Institute Isis Initiative award. Deze methode van in-vitro-CFTR macromoleculaire complexe assemblage werd oorspronkelijk ontwikkeld door dr. AP Naren (University of Tennessee Health Science Center).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pGEX4T-1 vector GE Healthcare 28-9545-49 formerly Amersham Biosciences
pMAL-C2 vector New England BioLabs
pET30 vector EMD Chemicals 69077-3 formerly Novagen
Glutathione agarose beads BD Biosciences 554780
Amylose resin New England BioLabs E8021S
Talon beads Clontech 635501
reduced glutathione BD Biosciences 554782
imidazole Fisher BP305-50
maltose Fisher BP684-500
S-protein agarose EMD Chemicals 69704-3 formerly Novagen
Anti-Flag HRP Sigma A8592
Anti-CFTR IgG Custom-made R1104 mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734
Anti-MRP2 IgG Chemicon International MAB4148 Now a part of Millipore

Table 2. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, M. P. Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity. Science. 253, 202-205 (1991).
  2. Bear, C. E. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR. Cell. 68, 809-818 (1992).
  3. Quinton, P. M. Chloride impermeability in cystic fibrosis. Nature. 301, 421-422 (1983).
  4. Cheng, S. H. Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis. Cell. 63, 827-834 (1990).
  5. Gabriel, S. E., Brigman, K. N., Koller, B. H., Boucher, R. C., Stutts, M. J. Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model. Science. 266, 107-109 (1994).
  6. Li, C., Naren, A. P. CFTR chloride channel in the apical compartments: spatiotemporal coupling to its interacting partners. Integr. Biol (Camb). 2, 161-177 (2010).
  7. Chao, A. C. Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase. Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).
  8. Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship. Nature. 363, 263-268 (1993).
  9. McNicholas, C. M. Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8083-8088 (1996).
  10. Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells. J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).
  11. Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D. 2nd, Soleimani, M. CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF. Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).
  12. Ahn, W. Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct. J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).
  13. Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates. Embo. J. 17, 898-908 (1998).
  14. Naren, A. P. Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms. Nature. 390, 302-305 (1997).
  15. Naren, A. P. Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents. J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).
  16. Naren, A. P. A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).
  17. Li, C. Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions. J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).
  18. Li, C. Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia. Cell. 131, 940-951 (2007).
  19. Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer. Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).
  20. Hall, R. A. A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).
  21. Short, D. B. An apical PDZ protein anchors the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the cytoskeleton. J. Biol. Chem. 273, 19797-19801 (1998).
  22. Wang, S., Yue, H., Derin, R. B., Guggino, W. B., Li, M. Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity. Cell. 103, 169-179 (2000).
  23. Sun, F. E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells. J. Biol. Chem. 275, 29539-29546 (2000).
  24. Cheng, J. A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression. J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).
  25. Scott, R. O., Thelin, W. R., Milgram, S. L. A novel PDZ protein regulates the activity of guanylyl cyclase C, the heat-stable enterotoxin receptor. The Journal of biological chemistry. 277, 22934-22941 (1074).
  26. Lee, J. H. Dynamic regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by competitive interactions of molecular adaptors. The Journal of biological chemistry. 282, 10414-10422 (2007).
  27. Gee, H. Y., Noh, S. H., Tang, B. L., Kim, K. H., Lee, M. G. Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking via a GRASP-dependent unconventional secretion pathway. Cell. 146, 746-760 (2011).
  28. Naren, A. P. Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function. Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).
  29. Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane. The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).
  30. Li, C., Naren, A. P. Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes. Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).
  31. Wu, Y. A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases. J. Biol. Chem. , (2011).

Tags

Biochemie Moleculaire Biologie Scheikunde CFTR macromoleculaire complex eiwit interacties PDZ scaffold proteïne epitheelcellen cystic fibrosis
<em>In vitro</em> analyse van PDZ-afhankelijke CFTR Macromoleculaire signaalcomplexen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y., Wang, S., Li, C. In… More

Wu, Y., Wang, S., Li, C. In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes. J. Vis. Exp. (66), e4091, doi:10.3791/4091 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter