Summary
嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）、上皮クロライドチャネルは、様々なタンパク質と相互作用し、重要な細胞プロセスを調節することが報告されているそれらの間でCFTR PDZモチーフを介する相互作用は十分に文書化されています。このプロトコルは、我々は複雑なシグナル伝達PDZ-依存性のCFTRの高分子を組み立てるために開発された方法について説明します。
Abstract
嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）、主に上皮細胞の頂端膜に位置するクロライドチャネルは、1〜3上皮液の恒常性に重要な役割を果たしている。嚢胞性線維症（CF 4）及び分泌性下痢5：CFTRは、二つの主要な疾患に関与している。 CFでは、CFTRのCl-チャネルの合成または機能活性が低下します。この疾患は、米国6の約1 2500の白人に影響を与えます。過度のCFTR活性はまた、腸内7でcAMPまたはcGMP産生を刺激する毒素によって誘導される分泌性下痢（例えば、コレラ毒素と熱安定性大腸菌エンテロトキシンによる）の症例に関与している。
証拠を蓄積すると、CFTRとトランスポーター、イオンチャネル、受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、信号を含む他のタンパク質の増加との間の物理的および機能的相互作用の存在を示唆る分子および細胞骨格要素、およびCFTRとその結合蛋白質との間でこれらの相互作用が非常にin vitroおよびin vivoでも8-19に CFTR媒介上皮イオン輸送の調節に関与していることが示されている。このプロトコルでは、メソッドだけに焦点を当て、そのタンパク質結合モチーフを持っているCFTRカルボキシル末端尾部の間の相互作用の研究を支援し、[モチーフPSD95/Dlg1/ZO-1（PDZ）と呼ばれる] PDZドメインと呼ばれる特定の結合モジュールが含まれている足場タンパク質のグループ。これまでのところ、いくつかの異なるPDZ足場タンパク質は、そのようなNHERF1などの様々な親和性、NHERF2、PDZK1、PDZK2、CAL（CFTR関連リガンド）、Shank2とCFTRのカルボキシル末端尾部に結合し、20から27を把握することが報告されている。 PDZ足場タンパク質によって認識されているCFTR内PDZモチーフはC末端（すなわち、ヒトCFTRの1477-DTRL-1480）20最後の4つのアミノ酸である。興味深いことに、CFTRは、様々な親和性を22とはいえ、NHERFsとPDZK1両方の複数のPDZドメインをバインドすることができます。 CFTRの結合に関しては、この多価は、PDZ足場タンパク質は、細胞16から18の特定/選択的かつ効率的なシグナリングのためのシグナル伝達複合体CFTRの高分子の形成を促進する可能性が示唆された、機能的意義のあることが示されている。
複数の生化学的なアッセイは、CFTR-含むそのような共免疫沈降、プルダウンアッセイでは、ペアワイズ結合アッセイ、ペアワイズ結合アッセイ比色し、高分子の複雑なアセンブリアッセイ16-19,28,29としてタンパク質相互作用を研究するために開発されている。ここでは、CFTR 16-19,28,29を含むタンパク質-タンパク質またはドメインドメインの相互作用を研究する我々の研究室で広く使用され、in vitroでのPDZモチーフに依存したCFTR含有高分子複合体を組み立てるの詳細な手順に焦点を当てています。
Protocol
1。細菌における組換えHisタグ融合タンパク質の発現および精製
- CFTR、LPA 2、MRP2、MRP4、β2 AR、そしてNHERFs（フルレングスまたはPDZ1またはPDZ2ドメインのC-テイル（C末端にPDZモチーフを含む最後の50から100アミノ酸）の定義された領域を増幅するPCR法による）。
- そのようなMBP-β2 AR CT、MBP-CFTR CTとしてMBP融合タンパク質（詳細については、GST-融合タンパク質のpGEX4T-1ベクター（例えば、GST-NHERFsとして、GST-MRP4 CT）やpMal-C2ベクターにPCR産物をクローニングし）、および彼の-S-融合タンパク質（例えば、彼の-S-CFTR CT、彼の-S-PDZK1など）のpET30。
- プロテアーゼ欠損E.に変換大腸菌株（BL21-DE3）可能な組換えタンパク質の分解を最小限に抑えます。
- 適切な抗生物質（例えばアンピシリンまたはカナマイシンなど）を含むルリア - ベルターニ培地（pH7.0）に37°Cで一晩培養する。 1:10に一晩培養物を希釈し、37℃でさらに2時間のために育つ℃、で0.5〜1メートル、Mは 30℃で、次の4時間IPTGでduce 8000遠心分離によってペレットは、細胞×gで10分間4℃で
- （50メートルMトリス-HCl、pH8.0で、1メートルM EDTA、1メートルM PMSF、10％ショ糖）がリゾチーム（1 mg / mL）は、0.2％トリトンX-100、およびプロテアーゼを含むショ糖バッファーで細胞を溶解阻害剤。細胞ペレットは、培養液1 Lに由来するための20mLを使用しています。
- 4℃で30分間ロータリーシェーカーに混ぜる
- 4℃で30分間20,000×gで遠心透明な上清を収集します。
- 透明な上清中には、以下の樹脂/アガロースビーズ（50％ショ糖バッファ内のスラリー）を1 mLを追加します。
- GST融合タンパク質のグルタチオンアガロースビーズ。
- 彼の-Sの融合タンパク質のタロンビーズ。
- MBP融合タンパク質のアミロース樹脂。
- 4℃で4時間混合°回転シェーカー上でC。
- 2マイルのために混合し、1×PBS（15mL）に再懸濁することによりビーズを洗浄2分、および廃棄上清を800×gで回転するN、。 6回のためにこの手順を繰り返します。
- それぞれの溶出バッファー（ビーズを1mLあたり2 mLの溶出バッファー）を用いて、ビーズからタンパク質を溶出します。
- GST融合タンパク質の溶出バッファー：25メートルMのTris-HCl（pH 8.0）で、140メートルM NaCl、および20メートルMは、グルタチオンを減少させた。
- 彼の融合タンパク質の溶出バッファー：20メートルMのTris-HCl（pH 8.0）で、500メートルM NaCl、および200メートルMイミダゾール。
- MBP融合タンパク質の溶出バッファー：20メートルMのTris-HCl（pH 8.0）で、200メートルMのNaCl、1メートルM EDTA、1メートルM DTT、10 M Mマルトース。
- 4℃（可能なタンパク質の分解を避けるため）での1X PBSを2 Lに対して溶出したタンパク質を透析。 PBSを4回4時間毎に変更します。 -80℃で小分けとしてセントリコンフィルタ（10,000 MWカットオフ、ミリポア）とストアを使用してタンパク質を濃縮℃に
- DETブラッドフォード法によるタンパク質濃度オコジョ。 SDS-PAGEは、標準としてBSAを用いてタンパク質の品質を評価します。タンパク質の整合性が十分でない場合は、そのようなゲルろ過やイオン交換などの二次精製手順を使用することができます。 （例えば、我々はさらにGST-融合タンパク質を精製するためにG-75セファロースカラムを使用している）。
2。細胞培養と細胞ライセートの調製
- 安定的に過剰発現CFTR-WTおよびCFTR-his10またはBHK細胞の一過性過剰発現フラグ-LPA 2重量またはフラグ-LPA 2ΔSTL、およびMadin-Darbyイヌ腎その文化ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞（MDCK 37℃でポリスチレンフラスコ内で10％ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンを含むイーグル最小必須培地（MEM）°5％CO 2とCの安定過剰発現MRP2た）細胞である。
- 文化、ヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞が安定的に過剰発現CFTR-WT及びダルベッコのCFTR-his10'、5％CO 2で37℃、10％ウシ胎児血清およびペニシリン/ポリスチレンフラスコ中のストレプトマイシンを補充したの改変イーグル培地（DMEM）。
- Lysis Bufferで細胞を溶解（PBS -トリトン-X-100は1メートルMのフェニルメチルスルホニルフルオライドを含むプロテアーゼ阻害剤の混合物を添加した0.2％、1μg/ mLのアプロチニン、1μg/ mLのロイペプチン、1μg/ mLのペプスタチン）の使用各60 mmのペトリ皿、各100 mmのペトリ皿1000μL溶解バッファー500μL溶解バッファー。
- 細胞は℃、4℃で15分間16,000遠心により不溶性物質×gを削除し4℃で20分間ライセートロックブラッドフォードアッセイによりタンパク質濃度を決定します。
3 CFTR含有高分子複合体の in vitro総会で （CFTR-PDZK1-MRP4）
- 溶解バッファー200μLのPBS（ - 0.2％トリトンX-100 +プロテアーゼ阻害剤）に、20μgの精製したGST-MRP4-C端子を追加する50 AA（CT50）の融合タンパク質。
- 彼の-S-PDZK1融合タンパク質を精製した種々の量（0-40μg）を追加します。
- 22 1-2°C hのロータリーミキサーの2つのタンパク質を混ぜ合わせます。
- タンパク質混合物に20μLグルタチオンビーズ（50％スラリー）を追加し、別の1時間ミックスを続けています。この手順は、ペアワイズ結合と呼ばれています。
- この間、HEK293細胞ライセートを調製する、上記ステップ2で説明したように過剰発現したFlag-CFTR（WT））。
- 溶解緩衝液で2回の複合体を洗ってください。各洗浄のために1分間800×gで遠心し、慎重にそれぞれの洗浄後の上清を吸引除去する。底にビーズを吸うしないように細心の注意を払ってください。
- ビーズに上記調製したHEK293細胞ライセートを追加し、軽く3時間（または一晩）を4℃で混合します。
- ステップ3.6）で説明したように溶解緩衝液で広範囲に三回ビーズを洗浄する。
- 30μLサンプルバッファー（5×）を使用してタンパク質を溶出：0.6 Mトリス-HCl（pH6.8）を、50％グリセロール、2％SDS、および青ブロモフェノール0.1パーセント、5％β-メルカプトエタノールを含む。
- 5000 10〜15分、スピン℃の水浴×gで30秒間ビーズを沈殿させた37にインキュベートします。
- 4から15までパーセントゲル上にすべての溶出液をロードします。
- 約30〜40分間SDS-PAGEを実行します。
- 1.5時間、PVDF膜にタンパク質のバンドを転送します。
- 5％無脂肪牛乳を含むTBS-Tweenでの膜をブロックします。
- 4の一次抗体（例えば抗CFTR抗体、R1104など）の膜℃、一晩インキュベートします。
- 5分、6回TBS-Tweenで膜を洗浄します。
- 22℃で45分間二次抗体（例えば、ヤギ抗マウスHRP標識第2抗体など）で膜をインキュベート
- 5分、6回TBS-Tweenで膜を洗浄します。
- ECLを介してタンパク質バンドを可視化することができます。
- 代表的なデータは、 図1に示されています。
in vitroで組み立てられたCFTR含有高分子のシグナル伝達複合体の例を図1に示されています。高分子複合体は、MRP4 C末端50アミノ酸（MRP4-CT50）PDZK1と、フルレングスCFTR（ 図1 下 ）の間に形成されました。複合体形成は、仲介蛋白質PDZK1（ 図1、 下 ）18の増加量の用量依存的に増加した。
図1：高分子複合体アッセイの絵画表現（ 上 ）。高分子複合体は、用量依存的に三つのタンパク質（GST-MRP4-CT50、彼の-S-PDZK1と、フラグ-CFTRwt）（ 底部 ）18を用いてin vitro で検出されました。
| CFTR-NHERF2-LPA 2（参考文献15） | CFTR-PDZタンパク質-MRP 2（参考文献17） | CFTR-PDZK1-MRP4（文献16） | ||
| アフィニティービーズ | アミロース樹脂 | S-タンパク質アガロース | アミロース樹脂 | グルタチオンアガロース |
| タンパク質-1を精製した | MBP-β2 AR CT | 彼の-S-CFTR CT | MBP-CFTR CT | GST-MRP4 CT |
| タンパク質-2を精製した | GST-NHERF1 | GST-NHERF2 | GST-PDZタンパク質 | 彼の-S-PDZK1 |
| （または細胞溶解液）タンパク質A-3を精製 | CFTR-WTまたはCFTR-his10（BHKまたはHEK細胞溶解物） | フラグ-LPA 2重量またはフラグ-LPA 2ΔSTL（BHK細胞ライセート） | MRP2（MDCK細胞溶解液） | フラグ-CFTR-WTまたはCFTR-his10（または細胞ライセート）を精製した |
| 抗体 | 抗CFTR抗体 | 抗Flag HRP | 抗IgG抗体MRP2 | 抗Flag HRP |
in vitroで組み立てられた様々なCFTR含有高分子複合体の表1にまとめ。
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Discussion
このプロトコルでは、前述の16-19,29,30を報告した in vitroで組み立て、精製タンパク質（またはタンパク質断片）および/ または細胞ライセートを用いて高分子シグナル伝達複合体を含むCFTRの検出方法を示した。最良の結果を達成するための準備プロセス中に次の重要なポイントは、特別な注意が必要です。
- これは、溶出緩衝液のpHは、ステップ1）で説明したように、GST-融合タンパク質を精製する際に還元型グルタチオンを添加した後8.0に調整することが重要です。 pHは、還元型グルタチオンを添加した後3.0などのように低くなることができます。 pHが溶出する前に調整されていない場合は、溶出の効率が大幅に削減されます。
- タンパク質がビーズから溶出されたとき、彼らはすぐに透析する必要があり、それ以外の場合は、精製タンパク質が溶液から出てくるかもしれません。蛋白質の透析は、右の溶出プロセスの後に可能でない場合は、タンパク質を溶出し、目でそれらを残していない電子アガロース/ビーズ。
- それは強くCFTR凝集が共通の問題としてウェスタンブロッティングのために準備CFTR含有高分子の複雑なサンプルを沸騰させないことをお勧めします。ゲルにロードされる前に代わりに、サンプルは10〜15分間37℃に加熱する必要があります。
- 低親和性相互作用を持つタンパク質複合体については、イムノブロットは、シグナルを高めるためにSuperSignalウェストフェムト（またはピコ）最大感度基質（Pierce）を用いて視覚化することができます。
ここで示した手法は、生化学的にCFTRを含む三次タンパク質複合体を定義するのに便利な、再現可能なアッセイを提供する。 表A-1に示すように、in vitroで CFTRの高分子複合体でアセンブルする方法は複数あります。
- 説得力のある結果を得るために、人は両方の方法、すなわち、i）での複合体を組み立てることを試みるべきであるCFTR - PDZ足場蛋白質（S） - 第3のタンパク質、ⅱ）第3のタンパク質 - PDZ足場タンパク質（S） - CFTR。
- PDZ高分子複合体形成のモチーフ依存性を示すために、CFTR-his10（CFTR-his10は 、C-末端尾部に10 His残基が含まれています。このタンパク質は、内部のPDZモチーフを持っており、NHERFs 29をバインドすることはできません）、その有するタンパク質PDZモチーフが変異または削除された（例えば、β2 AR-L413Aとして、LPA 2ΔSTL、など）だけでなく、高分子の複雑なアッセイで並行して使用することができます。
- 代わりに、また他の多くのコンポーネントが含まれているセルの全体のライセートを使用しないで、1は、ステップ3.7で精製したタンパク質を（第3のタンパク質など）を使用することができます）（例えば、MRP4-PDZK1-CFTRのアセンブリのように、我々はまた、精製を使用しフラグ-CFTR、参照18）。アセンブリ全体のシステムに含まれるわずか3精製したタンパク質が存在するので、これは、単にトライタンパク質複合体の説得力のある結果を提供します。
しかしながら、CFTRの高分子複合体の検出は、in vitroで purifiを使用して、EDのタンパク質（またはタンパク質断片）、または過剰発現CFTRまたは相互作用するタンパク質が高分子シグナル伝達複合体は、内因的にこれらの相互作用するタンパク質を発現する細胞に存在するかどうかを示すものではありませんという細胞からのライセート。この問題に対処するために、共免疫沈降は、このような気道上皮細胞などの細胞16の内因性のCFTRの複合体を評価し、上皮細胞17,18を腸に行うことができます。また、質量分析、2次元ゲル電気泳動29は CFTR未知の結合パートナーを識別するために実行することができます。しかし、これらの技術を実証するためにこのプロトコルの範囲を超えています。
さらに、in vivoでのタンパク質相互作用の細胞内局在性はまた、分子間相互作用に影響を与える可能性があります。 CFTRは頂端側膜に主に局在しているのに対し、それらがdeされているものの、例えば、MRP4は、心尖部と基底膜の両方で表現されることが示されているPDZ足場タンパク質PDZK1 18を介して互いに物理的、機能的に相互作用するmonstrated。さらに、組換えタンパク質の過剰発現は、現在のプロトコルで使用されるように、それらの細胞内局在に影響を与える可能性があり、したがって、それ以外発生しません相互作用を有効にしてください。データを解釈し、結果を外挿するときに、これらの可能性も考慮する必要があります。
現在のプロトコルは、PDZ-依存性のCFTR含有高分子複合体を組み立てるための手順に焦点を当てていますが、このプロトコルはまた、非CFTR関与多タンパク質複合体を（いずれかのPDZ-依存または非依存）組み立ての潜在的なアプリケーションを持っています。最近では、この高分子アセンブリアッセイを用いて、我々は、ケモカイン受容体CXCR2が物理的に好中球のNHERF1を介してその下流エフェクターPLCβ2媒介によるタンパク質複合体を形成し、このCXCR2高分子複合体が機能していることが示されているかなり複雑な（外因性CXCR2ペプチドを使用してを介して）減衰好中球機能31を混乱させるように関連性。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
私たちの仕事は、米国心臓協会（グレーター東南アジアアフィリエイト）昭和·助成金の0765185B、エルザU.パーディー財団研究助成金、ウェイン州立大学の学内のスタートアップ資金と血管研究所イシスイニシアティブ賞からの助成金によってサポートされています。 in vitroで CFTRの高分子複合体のアセンブリ内のこのメソッドは、もともと博士AP Naren（テネシー大学ヘルスサイエンスセンター）によって開拓された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGEX4T-1 vector | GE Healthcare | 28-9545-49 | formerly Amersham Biosciences |
| pMAL-C2 vector | New England BioLabs | ||
| pET30 vector | EMD Chemicals | 69077-3 | formerly Novagen |
| Glutathione agarose beads | BD Biosciences | 554780 | |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | |
| Talon beads | Clontech | 635501 | |
| reduced glutathione | BD Biosciences | 554782 | |
| imidazole | Fisher | BP305-50 | |
| maltose | Fisher | BP684-500 | |
| S-protein agarose | EMD Chemicals | 69704-3 | formerly Novagen |
| Anti-Flag HRP | Sigma | A8592 | |
| Anti-CFTR IgG | Custom-made | R1104 | mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734 |
| Anti-MRP2 IgG | Chemicon International | MAB4148 | Now a part of Millipore |
Table 2. Specific reagents and equipment. |
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References
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