Summary
小肠移植已成为一种公认的不可逆肠衰竭患者的治疗选择。我们作为一个可靠的工具，以解决潜在的免疫和炎症过程的复杂小肠移植大鼠原位小肠移植的实验模型。
Abstract
小肠移植已成为公认的短肠综合征和失败的肠外营养（不可逆肠衰竭）患者的临床治疗选择。在专门的医疗中心，提高操作和管理策略导致了优异的短期和中期患者和移植物存活率，同时提供高品质的生活1,3。不同的是较常见的其他实体器官移植（ 即心脏，肝脏）许多潜在的诱导小肠移植的移植肾功能和免疫学改变的机制尚不完全清楚6,7。发作的急性排斥反应，败血症，慢性移植物功能衰竭的主要障碍仍然较为有利的长期结果，并阻碍更广泛的就业的过程中，尽管越来越多的家庭肠外营养的患者可能受益于这样的移植。小肠包含乘客白细胞的大量的，通常被称为作为肠相关的淋巴系统（GALT）肠道接枝的高免疫原性的原因，这是一部分的一部分。许多共生和病原体在肠道中的存在和靠近解释脓毒症发作的严重程度，一旦接枝粘膜的完整性受到损害（例如，通过抑制）。为了推动该领域的肠和多器官移植产生的数据更可靠和可行的动物模型是必要的。本文结合该模型的可靠性和可行性一旦确立以标准化的方式，可以在底层的复杂的分子，细胞和功能的机制所触发的小肠移植提供了宝贵的见解。我们已经成功地使用超过5年以上的在我们的实验室8-11细化所描述的过程。朱庇特的视频格式是特别有用的，表现出复杂的多项式dure，避免最初的规划，建立原位啮齿动物模型研究小肠移植组的陷阱。
Protocol
1。供体手术
- 应该保持供体鼠禁食24小时（水/葡萄糖溶液的免费访问）。
- ，引起吸入异氟醚麻醉，开始以2％的标准雾化器，然后降低到1％后进行剖腹手术。执行脚趾捏了把检查镇静。
- 刮腹部和清洁皮肤准备3次（Kodan）。然后执行后正中切口皮下给药的镇痛。
- 后移植物包裹在生理盐水浸泡过的纱布，分离胰腺和升结肠，轻轻地用一个Q-尖端（6倍放大倍率的显微镜下的手术）的生理之间的粘连。
- 7-0丝，右和中间回盲部结肠血管结扎和分裂。之后蔓延到升结肠右侧肠系膜上静脉（SMV），可以发现回盲部，右，中结肠血管结扎和部门使用7-0关系。
- 向上缩回胃，从而使整个SMV的理顺和暴露。退回时使用一只蚊子夹。钳持有的形成形状的橡皮泥质量。
- 从SMV的胰十二指肠静脉结扎和分裂。 ，必须仔细确定所有小从SMV的胰十二指肠静脉，结扎用7-0丝和分之前可以从胰腺组织移植物。
- 失去结缔组织包括所有SMV和腹主动脉之间的淋巴管结扎和分裂。与接枝仍然在腹部右侧，失去包括SMV和腹主动脉是可访问所有的淋巴管之间的结缔组织。这结缔组织必须使用7-0丝连接，并从移植肠分为以避免术后lymphorrhea的。
- 结扎及分右肾动脉。后分为结缔组织，右肾动脉变得accessibl的e和分离结扎7-0丝。
- 全身heparinise的大鼠，通过阴茎静脉使用200个单位的肝素IV。
- 边缘动脉结扎，然后再除以十二指肠空肠交界处的小肠和回肠末端。
- 近端主动脉连接的SMA的起源。合流与脾静脉门静脉横断。移植物与主动脉段SMA血管蒂组成的收获。
2。 Backtable程序
- 用3ml大学在4℃UW液（UW）通过主动脉导管灌注移植和灌溉用30毫升的泌尿Nebacetin氮营养液在4°C（流明灌溉是强制性的肠腔从空肠端） 。
提取移植，主动脉导管后，立即用3毫升冷UW液灌注。对于这一点，20 G静脉导管上使用10毫升注射器。应当观察到的灌流液，从分割的门静脉自由流出。对于肠道Nebacetin灌溉，50毫升注射器使用。
- 移植物存放在4℃UW液的准备过程中的收件人。
3。接收方操作
- 应保存的收件人大鼠禁食24小时（水/葡萄糖溶液的免费访问）。
- ，引起吸入异氟醚麻醉，开始以2％的标准雾化器，然后降低到1％后进行剖腹手术。执行脚趾捏了把检查镇静。
- 刮腹部和清洁皮肤准备3次（Kodan）。然后执行卡洛芬5毫克/公斤的资深大律师术中镇痛皮下给药后正中切口。
- 生理盐水浸湿的纱布包裹的收件人肠道，并把它放在收件人的胸部。
- 直言Q-提示，打开后腹膜，暴露腹部信号主动脉和下腔静脉的正下方的肾血管的电平下降到髂血管，如果必要还可以使用microscissors。结扎的小腰和脊髓tribuaries的主动脉和下腔静脉用7-0丝，以避免失血。 （要做到这一点，在手术显微镜放大到16倍。）
- 交叉钳位低于左侧肾血管近侧和远侧使用微血管片段上方的髂骨分支的主动脉和下腔静脉。只有一个夹具近端和远端同时夹住两艘船。切开两艘船前方使用microknife，洗出剩余的血。
- 创建一个到另一侧吻合移植的主动脉段和收件人的腹主动脉采用连续10-0的聚丙烯缝线之间..最初，接枝上腹部的右侧（大鼠的头部定位在12点）来执行的较低的逗留缝合动脉吻合和捆扎的后壁线圈被放置。钍烯，被翻转的接枝到左侧腹部（在9点钟位置的大鼠的头），以暴露和缝合吻合术的前壁。
- 同样到另一侧吻合之间的移植门静脉和收件人的IVC进行连续缝合用10-0的聚丙烯。与大鼠仍然侧身躺着（头在9点钟的位置）中，接枝位于腹部的左侧和放置低级逗留缝合。吻合术开始与从容器内部的背面壁。低级逗留缝合后是并列的，前壁线圈可以从外部进行。
- 移除的前端夹具第一，然后由上夹具。任何控制的直接压力，采用Q-提示吻合口出血。移植应平等和快速再灌注检查。
- 切除整个收件人的小肠的肠系膜血管结扎后。收件人进行次全切除肠切除术，保留2-3厘米的亲ximal空肠和回肠末端1厘米。
- 还原肠溶连续性由近端（空肠 - 空肠造口术）和远端（回肠回肠造口术）最终结束肠吻合用一个中断的一个层缝合用6-0 Monocryl。需要完成约16缝合吻合。
- 直到清洁用生理盐水冲洗腹腔。管理2毫升生理盐水腹腔内补液。然后关闭腹部的肌肉层，加上一个连续的皮肤缝合用3-0薇乔连续缝合。
- 在术后的大鼠应保持空腹（水和葡萄糖溶液），另外24小时，然后重新启动标准大鼠饲料和水自由采食。应给予镇痛卡洛芬3日（见剂量下面）。
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Representative Results
术后正常
移植的动物迅速恢复的过程中，下加热灯约1小时。低温的术后死亡率的一个重要原因，应谨慎地避免内和术后。皮下注射2.5毫升生理盐水加2.5毫升的5％葡萄糖每8个小时，第24小时，术中的流体损失，必须更换。大鼠也应该有术后第一个24小时免费使用葡萄糖溶液（或凝胶饮食）和水区。在此期间，他们应该免费使用标准大鼠饲料和水自由采食恢复正常进食行为。卡洛芬5毫克/公斤SC日常管理控制疼痛三天，在麻醉诱导管理的第一枪。围手术期预防性抗生素只需要在同种异体设置，并且可以超过5-7天（氨苄青霉素15毫克/千克皮下注射，q的12小时）给药。一般外观，皮毛状况以及黏膜的外观应该是正常的。后POD活性水平恢复到术前状态，淡漠的或不正常的行为表明早期手术的并发症。在最初的损失高达20％的体重的老鼠会开始发胖术后6-8各地，并再次将达到90％左右。他们的术前体重正常的，术后第14天（无排斥反应）的同源设置。
手术后并发症;
如上所述，腹胀，淡漠的行为，停止喂养和一般外观（竖起皮毛，眼睛分泌）的变化，应考虑可能出现的并发症的症状。动物应被视为由外科医生和一名兽医。条件，如脱水，炎症状态，由于腹膜炎，肠梗阻，由于肠吻合口的狭窄，没有足够的止痛药和其他国家必须是规则D OUT和治疗。如果动物不能恢复虽经治疗，停止实验必须按个别评估情况下根据应用动物实验规定。
图1a。仪器。
1。显微镜（LEICA）
2。麻醉设备（EICKEMEYER）
图1b。仪器。
3。剃须刀
4。电子手术刀（GEIGER）
5。手术钳
6。狄见贝基钳弯曲
7。小弯钳
8。微型镊子弯曲
9。科技钳直1
10。科技钳直2
11。微针持有人
12。持针器
13。蚊式钳
14。剪刀1
15。剪刀2
16。 Microscissors
17。微型手术刀
图1c。仪器。
18。 Microclamps
19。 canulas和Q-提示（未示出）
20。针筒（50毫升，10毫升，2.5毫升，1毫升）
图1c。仪器。
21。 UW移植存储解决方案
22。移植流明灌溉抗生素（泌尿nebacetin N）
23。 UW移植灌注
24。生理盐水
25。菜用生理盐水（为backtable）
图2。平均的术后体重（累计数据）。图2显示了原位小肠移植后的平均术后体重。最初的损失高达20％的体重，大鼠后开始发胖，再次将达到90％，其术前术后6-8各地术后第14天（在无排异反应/免疫抑制剂等基因的设置图2）。erative重量通常约为表示重量损失数据，而不是求生存，以提供动物数量的减少来衡量减肥主要是由于动物实验sacrifing。
图3。从结肠的胰腺组织（箭头所示）已被删除。
图4。后结扎，将失去结缔组织，包括所有SMV和腹主动脉之间的淋巴管，右肾动脉（箭头）被分为丝连字。
图5。通过动脉导管移植与UW液灌注。
图6。后准备的收件人腔静脉和主动脉的血管暴露，准备用于夹紧。
图7。十字钳上腔静脉和主动脉同时使用microclamps。
图8（a）本主动脉主动脉吻合使用逗留缝线进行。 （b）在完成的主动脉主动脉吻合，门腔吻合将接下来执行。较低的住宿缝合的是已经到位。
图9（a）本门腔吻合住所述第二缝合后开始是到位。 （二）完成腔静脉吻合ompletion的。
图10除去后的接枝reperfuses很好的夹具。
图11。（一）安置入住缝合肠吻合术。 （b）已完成肠吻合术。
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Discussion
最近采用的模型大鼠小肠移植模型中被描述为早在1970ies 5涉及异位小肠移植使用不同的技术13。异位一般程序的优点是更容易的显微外科技术，更容易获得移植物的评估，异位小肠移植有很大的缺点，不考虑的移植小肠的收缩活动功能等方面的多重相互作用黏膜屏障功能提供了广阔的主机的共生和病原体的背景下，原位移植的特点。我们的团队已获得了大量的经验，本文描述的的原位模型和我们的研究结果表明，许多具体的改变引起的炎症免疫和适应性免疫反应的功能性亲的情况下，必须加以评估，perties的移植小肠的收缩和黏膜的完整性等。值得注意的是，这里采用的技术的吻合不包括动脉或静脉的袖口，其中有些已被证明是方便的程序，并降低的临界热缺血时间，特别是在模型中的multivisceral移植12,14的用法。虽然它可能有必要聘请袖口的complicative潜在的袖口multivisceral移植，使我们避免了类似的技术在这个模型中，单一的小肠移植技术在啮齿类动物模型。我们并没有试图在这个模型中使用的门户排水技术。除了技术上的挑战（小门静脉直径可能导致静脉回流的问题），这将使得整个模型的建立更加困难 - 这是一个事实，即在大多数情况下，使用在临床小肠移植的系统性排水。因此，所描述的技术REFL学分临床实践相结合的技术可行性。门户排水系统的移植还没有被证明是与卓越的成果，在一些临床和实验研究2,4。这种模式的学习曲线完成后可以达到足够短的缺血时间约35分钟。稳定的动物生存所必需的。
进行约30-40程序后，根据本协议的原位小肠移植可以学到的显微资深研究员。可视化，实现由朱庇特的格式可以直接目视观察和准确地再现的技术，可能会导致更快地建立的方法和减少动物的牺牲。关键点出血，缺血时间和冷，暖肠吻合口狭窄/不全。冷缺血时间在这个实验设置是至关重要的，因为温暖的缺血澳门国际机场的时间，但不应超过45分钟。热缺血时间应在35分钟左右，也不要超过45分钟，因为这可能会导致术后死亡率较高。理想的供体和收件人重量大约是200克的，因为较小的影响不容忍的程序和重量，300克与腹腔内脂肪过度。大鼠失去多达20％的体重在直接术后时期，但应该开始发胖后，再次手术后6-8天（ 图2）。每日应进行健康检查（包括警觉性，皮毛和黏膜的外观，重量，大便质量和频率），直到动物被牺牲。我们建议每天至少前三天，上述抗生素和镇痛的管理。经过初步实践，特别是微血管和肠吻合，该模型提供了可靠，稳定的长期生存同源设定在80％-90％左右。在allogeNIC设置的生存普遍较低，主要取决于急性和慢性排斥反应的免疫学等现象，并根据使用和测试的免疫抑制方案可能有很大的不同。
技术说明：供体手术时间约45分钟。收件人的操作应该没有太大的超过1.5小时。一个加热垫，应常规使用，以避免在收件人的低温。为了便于血管通路，收件人的侧面尾静脉中，可以在开始的过程中，使用22 G静脉导管插管。灌溉肠腔，如上所述可能没有必要，省略此步骤中有我们的知识对结果和死亡率没有负面的影响。
动物实验要求：动物被关根据应用的德意志联邦共和国，北莱茵-威斯特伐利亚州的法律，法规。其中t证明文件号码他的实验获得批准，可以从相应的作者。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| University of Wisconsin (UW) solution (ViaSpan) | Bristol-Myers Squibb | ||
| Uro-Nebacetin N solution | Nycomed | 6967855 | |
| Ampicillin | Ratiopharm | ||
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer | ||
| Prolene 10-0 unresorbable suture | Ethicon | ||
| Monocryl 6-0 resorbable suture | Ethicon | ||
| Vicryl 3-0 resorbable suture | Ethicon | ||
| i.v. Catheter G 20 1.1x33 mm | Braun | ||
| i.v. Catheter G 22 0.9x25 mm | Braun | ||
| Kodan Skin Prep | Schülke | ||
| NaCl 0.9% Infusion solution | Braun | ||
| Curved forceps small | FineScienceTools | 11009-13 | |
| Micro forceps curved | AESCULAP | BD 333 | |
| Micro forceps curved | AESCULAP | FD281R | |
| Micro forceps straight 1 | WPI | 5 | |
| Micro forceps straight 2 | WPI | 2 | |
| Micro needle holder | WPI | 14081 | |
| Micro scissors | FineScienceTools | 15006-09 | |
| Micro scalpel | MANI | Ophthalmic knife | |
| Micro clamps | AESCULAP | FB329R |
References
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