Summary
Eine detaillierte Beschreibung der Maus Inselisolierung wird beschrieben unter Verwendung der Technik der in situ-pankreatischen duktalen Kanülierung und Perfusion einer Kombination von gereinigten Collagenase und neutralen Protease.
Abstract
Die Vernehmung der Beta-Zellen die Genexpression und Funktion in vitro hat direkt über die Jahre aus der Studie von Nagetier tumorigenen Zelllinien zur Untersuchung von isolierten Nager Inseln verschoben. Primäre Inseln bieten den entscheidenden Vorteil, dass sie mehr getreues Bild der Biologie der intrazellulären Signalwege und sekretorischen Antworten. Während das Verfahren Inselisolierung mit gewebespezifischen dissoziierenden Enzyms (TDE) Zubereitungen ist gut in vielen Laboratorien etablierten 1-4, begrenzen Variationen in der Konsistenz von Inselzellen Ausbeute und Qualität von jedem beliebigen Stamm Nagetier das Ausmaß und die Machbarkeit der primären islet Studien. Diese Schwankungen treten häufig als Folge der teilweise gereinigten rohen TDES im Inselisolierung Verfahren verwendet; TDES zeigen häufig viel zu Charge Schwankungen in der Aktivität und erfordern oft Anpassungen der Dosis des eingesetzten Enzyms. Eine kleine Anzahl von Berichten verwendet gereinigten TDES für Nagerzelle Isolierungen 5, 6 7, 8, in dem die TDES direkt in den Pankreasgang von Mäusen perfundiert, durch rohe Gewebe Fraktionierung durchgezogen beschriebenen Basis einen Histopaque Gradienten 9 und Isolierung des gereinigten Inselchen. Ein signifikanter Unterschied in unserem Protokoll ist die Verwendung von gereinigten Collagenase (CI Enzym MA) und neutrale Protease (CI Enzym BP) Kombination. Die Collagenase wurde durch die Verwendung eines 6-Fluoreszenz Kollagen abbauenden Aktivität (CDA)-Assay, Fluoreszenz-markierten löslichen Kalbshaut Fibrillen als Substrat 6 Verwendete ist. Dieses Substrat ist prädiktiven der Kinetik der Kollagen-Abbau in der Gewebe-Matrix, da es auf natives Kollagen setzt als Substrat. Die Protease war characterized mit einem Fluoreszenzfarbstoff kinetischen Assay 10. Mit Hilfe dieser verbesserten Assays zusammen mit mehr traditionellen biochemischen Analyse ermöglichen die TDE konsequenter hergestellt werden, was zu einer verbesserten Leistung Konsistenz zwischen Lose. Die hier beschriebene Protokoll wurde für maximale Ausbeute und Inselzellen optimale islet Morphologie mit C57BL / 6 Mäuse optimiert. Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurden mehrere Kombinationen von Kollagenase und neutrale Proteasen bei verschiedenen Konzentrationen untersucht, und die endgültige Verhältnis von Collagenase: neutralen Protease von 35:10 darstellt Enzymleistung vergleichbar Sigma Typ XI. Da signifikante Variabilität im Durchschnitt Insel Erträge aus verschiedenen Stämmen von Mäusen und Ratten berichtet worden, sollten zusätzliche Modifikationen der TDE Zusammensetzung hergestellt, um den Ertrag und die Qualität von Inseln aus verschiedenen Arten und Stämme wieder zu verbessern.
Protocol
A. Benötigte Materialien: Siehe Tabelle 1 (Reagenzien) vor der Zubereitung
- HBSS (P / S): 100 ml 10X HBSS + 900 ml H 2 0 + 1% Penicillin / Streptomycin (im Kühlschrank gelagert oder auf Eis gelagert).
- 20% BSA Lager wird in Wasser hergestellt und aliquotiert und bei -20 ° C.
- HBSS (BSA): 200 ml 1X HBSS (P / S) + 3 ml 20% BSA (BSA endgültige Konzentrationen von 0,3%)
- Islet-Medium: RPMI + 10% FBS + 1% Glutamin + 1% Penicillin / Streptomycin
- Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque 1077 + 200 ml Histopaque
- 4-0 Suture (McKesson): in 2 ¾ Zoll-Stücke geschnitten und in einer 10 cm Petrischale
- Instrumente: Beugen Sie die Zange von Fine Science Tools, um 90 °, und feilen Sie den gezackten Zähnen aller drei Paare der Zange. Das Ziel ist es langweilig die Zähne, nicht um sie zu entfernen.
- Kanüle zur Verabreichung von Kollagenase / Protease Mischung: 27G ½ in. Nadel, 30 ½ in.Nadel, PE50 Schlauch in 12 in. Stücke schneiden. Datei beider Nadeln auf eine glatte abgerundete Ende die keine scharfen Kanten aufweist. Legen des 27G Nadel in ein Ende eines 12 Zoll Stück PE50-Schlauch. Entfernen Sie die 30G Nadel aus dem Gehäuse durch die Zerschlagung der Gehäuse mit einer Zange, Drehen des Gehäuses ¼ Drehung jeder Zeit. Entfernen Sie die Nadel mit der Zange aus dem Gehäuse und legen Sie sie in das andere Ende des PE50 Rohre unter einem Dissektionsmikroskop. Achten Sie darauf, nicht knicken Sie den Schlauch, wie Sie die Nadel legen in den PE50 Rohre. Die 27G Nadel ist das Ende, dass Sie die Spritze von Kollagenase befestigen.
- Collagenase (CI zyme MA) und Neutral Protease (CI zyme BP). Lösen Sie das TDE den Anweisungen des Herstellers. Finden Sie auf der chargenspezifischen Zertifikat für Analyse, um die Enzymaktivität Konzentration zu berechnen. Übertragen insgesamt 350.000 Kollagen abbauenden Aktivität (CDA) Einheiten der rekonstituierten Kollagenase und 100.000 neutrale Protease Einheiten der reconstitausgeschüttet BP Protease in eine konische Röhre und verdünnter bis 15 ml Gesamtvolumen in HBSS (P / S)
B. Step-by-Step-Protokoll
Ein. Inflation der Bauchspeicheldrüse mit Collagenase / Protease Mischung
- Euthanize Maus durch zervikale Dislokation, sättigen die Maus Torso mit 70% EtOH, offene Bauchhöhle vollständig vom Anus bis Membran mit irgendwelchen Dissektion Schere und Pinzette.
- Platzieren Sie die Maus auf der Plattform eines Dissektionsmikroskop.
- Ziehen Sie das Caecum und Colon ascendens aus und setzen Sie sie außerhalb der Körperhöhle zu Ihrer Linken. Siehe Abbildung 1 für eine Zusammenfassung der folgenden Schritte aus.
- Positionieren der Lappen der Leber gegen das Diaphragma, sie sollten dort verbleiben, wenn die Körperhöhle offen ist weit genug. Finden Sie die Leberarterie, Pfortader und Gallengänge Bündel führt in der Leber durch Ergreifen des Duodenums mit gebogenen Pinzette. Mit einem anderen Paar von gekrümmten Pinzette unter der Arterie, Vene zu erreichen, und Kanal bundle und ziehen ein 2 ¾ in. Stück 4-0 Naht unter der Arterie, Vene, Gallengang und binden Sie es einmal und ziehen Sie es fest, wie die Leber wie möglich zu schließen.
- Mit zwei Paaren gekrümmter Pinzette vorsichtig greifen den Zwölffingerdarm und finden den Gallengang an den Zwölffingerdarm an der Papille. Verwenden Sie eine Zange der Zange durch die Bauchspeicheldrüse und Bindegewebe direkt unter dem Gallengang in der Nähe der Papille stecken. Stecken Sie Ihre Pinzette schnell durch das Organ, um ein Loch zu machen und dann legte beide Zangen Zangen durch und greifen noch 2 ¾-Zoll-Stück von 4-0 Faden durch und binden Sie es einmal und ziehen Sie es auf einen kleinen Kreis, aber NICHT festziehen.
- Wechseln Sie in den 90 °-Zange und den Superfine Vannas Schere. Mit den 90 ° Pinzette vorsichtig kneifen und ziehen Sie den Dünndarm bis zum Gallengang ist straff. Machen einer horizontalen Schnitt über die Papille mit der Schere von stechenden die offenen Schere in den Darm und dann das Schneiden mit einer Bewegung. Versuchen Sie, nur one geschnitten über die Papille ohne Lösen des Gallengang aus der Papille.
- Halten Sie den Darm mit den 90 °-Zange, die Kanüle in den Gallengang bis zur Hälfte der Länge der Gallengang, und dann ziehen Sie den Faden fest um die Kanüle.
- Füllen Sie ein 3-ml-Spritze mit 2,0 ml Collagenase / Proteasegemisch und injizieren in die Kanüle in einem langsamen, konstanten Tempo.
- Nach dem Aufblasen der Bauchspeicheldrüse abgeschlossen ist, entfernen Kanüle aus Gallengang und verwenden Sie die gebogenen Pinzette und gekrümmte Feder Schere, um die aufgeblasenen Bauchspeicheldrüse ab dem absteigenden Dickdarm und Schnippeln des Bindegewebes, wie Sie den Darm ziehen zu entfernen. Weiterhin die Bauchspeicheldrüse aus dem Darm zu entfernen, bis Sie den Gallengang zu erreichen, entfernen Sie dann die Bauchspeicheldrüse aus der Milz, dann den Magen und dann aus dem Eingeweide der Bauchhöhle. Fertig Entfernen von Schnippeln entfernt die Nähte. Fügen Sie die Bauchspeicheldrüse zu einer 50-ml-Tube mit 5 ml HBSS(P / S). Dieses Rohr sollte auf Eis sein.
- Wiederholen Sie den oben beschriebenen Vorgang für jedes Tier bis zu vier Tiere. Für optimale Ergebnisse distanzieren nur vier Pankreata auf einmal. Typischerweise, während die ersten vier in der 37 ° C warmen Wasserbad sind, blasen wir vier weitere Pankreata.
2. Pancreas Dissoziation
- Platzieren Sie die 50 ml Röhrchen mit dem Pankreas in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min.
- Schütteln Sie den Schlauch und überprüfen Gewebedissoziation, lesen Gewebe kommt leicht auseinander, dann wirbeln die Rohre 12 Mal, während Sie halten den Schlauch durch den Deckel.
- Fügen Sie nicht mehr als 30 ml HBSS (BSA) (dies kann eine geringere Menge, je nachdem, wie viel benötigt wird, um die Rohre für den Zentrifugationsschritt auszugleichen) und Zentrifuge bei 290 xg für eine min.
- Anzusaugen Überstand vorsichtig und lassen eine kleine Menge des Überstandes (2-3 ml) am Boden, um so nicht stören die Zellpellet.
- Mit einem 30-ml-Spritze attached bis 14G Nadel, fügen Sie nicht mehr als 10 ml HBSS (BSA) und saugen die Aussetzung nach oben und unten 2 mal.
- Filtern das Zellgemisch durch ein Kunststoffrohr Teesieb in ein 50 ml Röhrchen und spülen mit weiteren 10 ml HBSS (BSA).
- Zentrifuge bei 330 xg für 2 min.
- Dekantieren und invertieren Rohre auf einem saugfähigen Papiertuch für 1 min abtropfen lassen.
- Resuspendieren jedes Rohr in 10 ml kaltem 1100 HISTOPAQUE.
- Überlagern die HISTOPAQUE mit 10 ml HBSS (BSA) und zentrifugieren bei 900 xg für 18 min.
- Entfernen Sie die gesamten 20 ml Überstand mit einer großen Bohrung 25 ml Pipette und die überstehende durch eine invertierte 70 um-Filter.
- Spülen Sie die Inseln in eine 10 cm Petrischale durch Pipettieren 10 ml Insel media durch den Filter, während es rechts oben über der Schüssel.
- Kultur der Inseln in einem 37 ° C, 5% CO 2 Gewebekultur-Inkubator bis bereit für Experimente. Typischerweise werden Inselchen handverlesen und zählte vor experimentation.
3. Repräsentative Ergebnisse
Islet Erträge, Morphologie und Qualität sind die allgemeinen Parameter verwendet werden, um den Erfolg der Inselisolierung beurteilen. In unseren Händen sind islet Erträge aus dem durchschnittlichen C57BL / 6 Maus im Bereich von 150-250 Inselchen dieses Protokoll verwenden (siehe Tabelle 2), und sind vergleichbar mit erhaltenen Daten mit optimierten Sigma XI Kollagenase. Allerdings können Ausbeuten variieren in Abhängigkeit von dem Mausstamm verwendet und dem Alter der Maus. Die meisten der Tiere, die wir verwenden, sind in der 8-16 Wochen Altersgruppe Dieses Protokoll auf mehreren Mausstämmen wurde getestet, darunter C57BL / 6 (180-250 Inseln / Maus), CD1 (200-300 Inseln / Maus), 129 / B6 (200-300 Inseln / Maus), BLKS-db/db (120-200 Inseln / Maus), NOD (10 Wochen alt, 100-150 Inseln / Maus) und NOD-SCID (100-150 Inseln / Maus ). Typische islet Morphologie ist in Abbildung 2 dargestellt, bei der Inselchen eine runde Gestalt mit relativ einheitlicher Größe länglich haben (obgleich Größe unif.ormity kann von Stamm zu variieren) belasten. Abbildung 3 zeigt unsere typische Analyse von Glukose-stimulierte Insulinsekretion aus C57BL / 6 Maus Inseln isoliert unter Verwendung von gereinigten TDES vs Sigma XI Kollagenase. Typischerweise wird ein hoher Qualität islet Zubereitung führt zu einer Insulinstimulation bei 25 mM Glukose, 6-20 mal größer als die mit 2,5 mM Glucose beobachtet wird. Andere Anwendungen können auch verwendet werden, um die Qualität von isolierten Inseln zu testen, und diese schließen Verwendung perifusion Techniken, Ca 2 +-Imaging (mit Fura2) und Reverse-Transkriptase-PCR, unter anderem 11.
Abbildung 1. Eine Zusammenfassung der Kanülierung der Gallengang.
Abbildung 2. Typische Erscheinungsbild von C57BL / 6 Inselchen bei 24 Stunden nach der Isolierung. Bilder wurden auf einem in erworbenenumgewandelt Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung.
Abbildung 3. Glukose-stimulierte Insulinsekretion von C57BL / 6 Inselchen. Nach 24 h nach der Isolierung wurden 100 Inselchen in einer 12-Well-Platte für 1 h bei 37 ° C in Krebs-Ringer-HEPES-gepufferten Lösung, enthaltend 2,5 mM Glucose inkubiert. Inseln wurden dann mit Krebs-Ringer-HEPES bei 2,5 mM Glucose für eine zusätzliche Stunde, wonach der Überstand für Insulin-Messung gesammelt übertragen wurde unter Verwendung eines Two-Site immunspezifische enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA) (Kristall Chem). Dieselben Inseln wurden anschließend Krebs-Ringer-HEPES-gepufferten Lösung, die 25 mM Glucose überführt und Insulinfreisetzung in das Medium wurde durch ELISA nach 1 Stunde Inkubation gemessen.
Discussion
Bei diesem Protokoll, haben wir unserem Verfahren zur Kanülierung, Collagenase Perfusion und Dissoziation des murinen Pankreas beschrieben, mit dem Ziel der Isolierung der Langerhans-Inseln. Technisch unserer Methode einmal gemeistert, sollte für Pankreas Isolierung innerhalb von 4 min euthanizing das Tier ermöglichen, und durch 1 Stunde sollte bei der Isolierung von Inselzellen aus einem einzigen Tier führen. Die Schnelligkeit der Technik erlaubt es uns, kleine Inseln aus bis zu 12 Mäusen in einem typischen Dehnung zu isolieren, wodurch die Isolation bis zu 3.000 Inselchen.
Im Gegensatz zu anderen Protokollen, die rohen Zubereitungen von Kollagenase zu verwenden, bietet unser Protokoll die Verwendung von gereinigten Proteasen, CI Enzym Collagenase MA und CI Enzym Protease BP. Variationen in der Konsistenz von TDE Zubereitungen, die im Handel erhältlich sind, erfordert, dass jede Partie einzeln getestet und optimiert werden vor den allgemeinen Gebrauch. Diese Ware-zu-viel Variabilität führte uns zu nutzen puri betrachtenFied TDES von VitaCyte. Diese hochreinen TDES werden durch mehrere Verfahren, einschließlich der Verwendung von Fluoreszenz-markierten Substrat empfindlichen Assays charakterisiert. Die Fluoreszenz CDA Assay ist empfindlicher auf verschiedenen molekularen Formen von Kollagenase, die unterschiedliche Kinetik haben abbauenden nativen Kollagen. Historische Peptidsubstrat Assays bieten eine unvollständige Beurteilung der Kollagenase. Charakterisierung Kollagenase durch mehrere Methoden sorgt für mehr Enzymaktivität zwischen Lose.
Basierend auf unseren in-house-Tests mit einer Vielzahl von Kollagenase Präparate im Handel erhältlich, fanden wir, dass die gereinigten Enzymkombinationen reproduzierbare lot-to-lot Ergebnisse erzielt. Die wichtigsten Vorteile der Verwendung von hoch gereinigten und konsequent gekennzeichnet TDES in dieser Anwendung einmal die optimale Enzymzusammensetzung definiert ist, wird das Los zu Los Leistung Konsistenz gewährleistet. Diese Konsistenz entfällt die arbeitsintensive Prozess der Partie Qualifikation normalerweise erforderlichfür Rohöl oder angereicherter Kollagenase Produkte. Gereinigtes TDES ermöglichen auch zusätzliche Modifikationen der Zusammensetzung auf den Ertrag und die Qualität der Inseln aus verschiedenen Mausstämmen wieder zu verbessern. Berichterstattung optimale Enzymzusammensetzungen zur Isolierung von Inselzellen aus verschiedenen Stämmen von Mäusen kann besser kommuniziert werden. Dies wiederum führt zu einer besseren Nutzung der Ressourcen und eine verbesserte Flexibilität in der experimentellen Design.
Es gibt viele wichtige Schritte, die das Ergebnis von Insel Isolierungen mit unserem Protokoll beeinflussen können. Die erste ist die Notwendigkeit, einen wirksamen Aufblasens des Pankreas während der Perfusion der Enzymzubereitung erreicht. Es ist wichtig, um die Inflation mit sanfter Gewalt auf die Spritze zu starten, und erhöhen Sie die Kraft der Bauchspeicheldrüse aufbläst. Es ist hilfreich, um den Darm zu bewegen und heben die Bauchspeicheldrüse während der Inflation, so dass die Kollagenase durchblutet das gesamte Organ. Ein weiterer kritischer Schritt ist die Kraft, mit der ein schüttelt die Rohre after Inkubation bei 37 ° C (Schritt 2.2). Wir haben festgestellt, dass Schütteln der Bauchspeicheldrüse hart gegen die Kappe der Röhre zu einer Aufsplitterung des Inselchen, aber ohne jegliche Form von mechanischen Dissoziation bei diesem Schritt Insel Erträge drastisch sinken. Es ist auch wichtig, dass während der Dissoziationsschritt mit der Spritze (Schritt 2.5), einer mittleren Ebene Kraft während des Auf-und Abbewegung mit dem Kolben angelegt wird, das eine ausreichende Gewebedissoziation vor dem Filterschritt (2,6), bei denen sehr kleine Gewebe sollte auf dem Teesieb Filter zurückgehalten werden. Schließlich ist der letzte Schritt, um genau zu befolgen das Streben der gesamten 20 ml der HISTOPAQUE fraktionierten Inselchen. Obwohl Inselzellen sind typischerweise an der Grenzfläche des HISTOPAQUE und HBSS haben wir gefunden, dass wir, wenn wir Inselchen verlieren, nur die Schnittstelle zu entfernen versucht, sondern wir jetzt entfernen gesamten 20 ml unter Verwendung einer großen Bohrung 25 ml Pipette. Wir fügten die Filtration durch das invertierte Filter 70 um (Schritt 2.11), die Notwendigkeit zu beseitigen, centrifuge die Inseln wieder abzuwaschen dem HISTOPAQUE.
Disclosures
NDS, SAT, und RGM haben nichts zu offenbaren. Autor AGB wird durch VitaCyte beschäftigt. Autor RCM hat eine Beteiligung an VitaCyte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH Zuschüsse R01 DK060581, R01 DK083583 (beide RGM) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||
| 10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
| RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
| BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
| Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
| Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
| 4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
| 14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
| Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
| Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
| Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
| Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
| 27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
| 30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
| PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
| Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
| BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
| 3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
| 10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
| Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
| Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
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Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |
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References
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