Summary
ووصف النهج السريع للتحقيق في التفاعلات والآثار على الآليات الجزيئية ذات الصلة وجود الأجسام المضادة في بيئة داخل الخلايا. الأسلوب ينطوي ترنسفكأيشن من الأجسام المضادة في الخلايا الحية باستخدام تشكيل التساهمية غير معقدة تقوم على صياغة المادة الدهنية. هذه التقنية قابلة للتكيف مع خطوط الخلايا والخلايا الأولية خلد.
Protocol
1. وصفها الأجسام المضادة (الشكل 1)
- جعل 0.1 M 3 NaHCO العازلة:
- 8،4 ز NaHCO 3
- 29،2 ز كلوريد الصوديوم
- 1 لتر H 2 O
- جلب عازلة تصل إلى درجة الحموضة من 8.4 مع هذا الحل (10.6 ز نا 2 CO 3 و 29.2 جم كلوريد الصوديوم، 1 لتر H 2 0).
- إضافة 35 ميكرولتر Atto550 NHS إلى 70 المضادة للhnRNPA1 و 500 ميكرولتر العازلة ميكرولتر 3 NaHCO وتناوب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد الدوران لمدة ساعة، حقن الخليط في مديال وdialyze في 2 لتر من PBS بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، تركيز مدال Atto550 NHS مكافحة hnRNPA1 باستخدام عمود الدوران (Amicon الترا 0.5).
- بعد NHS Atto550 صفت وتركزت مكافحة hnRNPA1 الأجسام المضادة، نانو الإفلات عينة لتحديد التركيز.
2. ترنسفكأيشن الأجسام المضادة (الشكل 2)
- 10 5 خلايا البذور / بشكل جيد في 500 ميكرولتر من Dulbeccيا لمعدلة النسر متوسطة (+10٪ FBS DMEM/F12 +1٪ المضادات الحيوية) في 8 جيدا على مدار 24 ساعة الشريحة قبل ترنسفكأيشن. يجب أن تكون الخلية confluency لا يقل عن 70٪.
- أربع وعشرين ساعة بعد البذر، إضافة 2 ميكرولتر من كاشف AB-DeliverIN إلى أنبوب إيبندورف.
- المقبل، إضافة 2 ميكروغرام من Atto550 NHS المسمى مكافحة hnRNPA1 الأجسام المضادة (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى أنبوب إيبندورف نفس واحتضان 10-15 دقيقة في RT.
- خلال الحضانة، إضافة نضح وسائل الإعلام وسائل الإعلام 394 ميكرولتر من DMEM جديدة للخلايا.
ملاحظة: إضافة 500 ميكرولتر DMEM لغرفة واحدة من الخلايا يمسها ليكون بمثابة السيطرة.
- بعد الحضانة، إضافة 100 ميكرولتر من DMEM إلى خليط الأجسام المضادة، مزيج من pipetting صعودا وهبوطا، وإضافة إلى الخلايا في DMEM لإجمالي حجم 500 ميكرولتر.
- تغيير وسائل الإعلام بعد 48 ساعة من تسليم الأجسام المضادة.
ملاحظة: تم تكرار بروتوكول مع FITC المكتوب عليه ريج والسيطرة الإيجابية.
3. الحية والثابتة التصوير تحديد الكفاءة
- الصورة الحية الخلايا في 48 ساعة باستخدام فلتر Cy3 على المجهر الفلورسنت لصورة بالنقل Atto550 NHS الأجسام المضادة المسمى.
- بعد انتهائه التصوير الحية، نضح وسائل الإعلام وخلايا الإصلاح.
- بعد الشفط وسائل الإعلام، وعلاج الخلايا مع امتصاص العرق 0.4٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا 4 × 5 دقائق لكل منها PBS. ثم، تحميل الخلايا التي تحتوي على تصاعد مع وسائل الاعلام دابي كاشف وساترة الإصلاح. قياس الكفاءة ترنسفكأيشن من الخلايا الثابتة مع برنامج Axiovision. إذا Axiovision البرمجيات ليست في متناول اليد، عد ببساطة الأحداث من الصور الخاصة بك عن طريق اليد ونتائج الاندماج في الحساب في 3.7. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام البرنامج ليماغيج هذه الحسابات.
- أولا، استخدام "أحداث" القياس لحساب العدد الإجمالي للخلايا في الصورة التي تختارها في 20X التكبير.
- المقبل، واستخدام "الأحداث" القياس لحساب الخلايا التي لم تكنتقاس بنجاح مع الأجسام المضادة في نفس الصورة التكبير 20X.
- للوصول إلى قياس "أحداث" في شكل نمط إكسل، اضغط على "خصائص"، انقر فوق "قياس" علامة التبويب، وانقر فوق عرض "والجدول".
- وأخيرا، استخدام الحساب التالي لتحديد كفاءة ترنسفكأيشن الخاص من خلال مقارنة الحدثين قياس سابقا: ((خلايا المجموع - خلايا Untransfected) / خلايا الاجمالي) X = ترنسفكأيشن الكفاءة 100.
4. ممثل النتائج
الصور الحية من untransfected (الشكل 3A) مقارنة الخلايا العصبية (الشكل 3B) بالنقل تكشف عن أن لوحظ بشكل واضح بوضع العلامات على الأجسام المضادة (الأحمر أو الأخضر في كل الشكل) داخل الخلايا (الشكل 3B، C، D). بعد غسل وتطلع مع وسائل الإعلام لإزالة الأجسام المضادة أو بين تمسكا سطح الخلايا، والأجسام المضادة المسمى لا تزال موجودة داخل الخلايا العصبية (الشكل 3C، D). لحساب الكفاءة ترنسفكأيشن، استخدام البرنامج لحساب الخلايا Axiovision مجموع مقارنة مع الخلايا التي لم تكن تقاس بنجاح. تم إدخال هذه القيم إلى والكفاءة ترنسفكأيشن صيغة للحصول على كفاءة ترنسفكأيشن كنسبة مئوية من إجمالي الخلايا (الشكل 4).
الشكل 1. مخطط سير العمليات الإجراءات المستخدمة لتسمية الأجسام المضادة مع استر NHS أتو 550 تليها الخطوات المطلوبة لتركيز الأجسام المضادة المسمى. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 2. مخطط سير العمليات الإجراءات المستخدمة لبالنقل الأجسام المضادة المسماة في الخلايا الحية في الثقافة.arge.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.
الشكل 3. لايف الصور من الخلايا العصبية بالنقل ترنسفكأيشن 48 ساعة التالية.
الشكل 4. الثابتة وتشطف الصور مع الأحداث عد من أجل تحديد كفاءة ترنسفكأيشن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من أجل اختبار الفرضيات حول جزيئات معينة والتعبير عنها، وتقاس عادة الجينات وناقلات أخرى في الخلايا. الجانب الفريد من هذا الإجراء هو القدرة على الأجسام المضادة في بالنقل بسهولة الخلايا المستهدفة. أجرينا هذه الطريقة في خمس تجارب منفصلة في كل التكرارات. وكانت النتائج مماثلة الكفاءة ترنسفكأيشن بين جميع التجارب. الأهم من ذلك أن طريقة تمكن دخول الأجسام المضادة في الخلية دون تغيير هيكل أو وظيفة الأجسام المضادة. علاوة على ذلك، مع استخدام المجهر مضان من الخلايا العصبية حية، ونحن قادرون على تحديد كفاءة ترنسفكأيشن، وهو ما يتجاوز عادة 55٪. هذا يسمح احد لاختبار الفرضيات المتعلقة مباشرة إلى التفاعل بين الأجسام المضادة من الاهتمام وهدفه داخل الخلايا. وإن لم يكن درس هنا، ويمكن أيضا أن تستخدم شظايا فاب. وبدلا من ذلك، يمكن تصميم التجارب التي تدرس تغيير الأوضاع إذا الثقافة مثل إضافة السيتوكينات الالتهابية يؤثر expressiأو على توطين الأهداف داخل الخلايا.
كيف الأجسام المضادة قد يستهدف مستضدات الخلايا هي منطقة الجارية من التحقيق. النظرية السائدة تشير إلى أن الإصابة بعد الخلوية، ويتعرض مستضدات الخلايا للاستجابة المناعية التكيفية، والذي يسمح لإنتاج الأجسام المضادة للمستضد الهدف. واستجابة الأجسام المضادة في المرضى الذين لhnRNPs SLE هو مثال على كيف أن هذا يحدث على الأرجح. مرضى SLE انتاج اجسام مضادة لP2 hnRNP وعند موت الخلايا المبرمج للخلايا المستهدفة، ويتم نقل hnRNP P2 إلى سطح الخلية حيث تكون متوفرة لتوليد رد فعل المناعة الذاتية 14. وقد تبين ذلك أيضا في الأمراض العصبية، والتي اقترحت الدراسات أن المستضدات السطحية فقط على الخلايا العصبية يمكن أن تكون أهدافا لاستجابة المناعة الذاتية المسببة للأمراض 15 و 16. والآن هذه الفكرة تتعرض للتحدي. ومن المثير للاهتمام، وهناك الآن مما يشير إلى أن البيانات الأجسام المضادة يمكن أن تدخل الخلايا العصبية بأسلوب محدد حاتمة. على سبيل المثال، في اعتلال الشبكية المناعة الذاتية، وهواخترقت المعهد القومي للاتصالات، إينولاز الأجسام المضادة الخلايا العصبية وتغيير وظيفة إينولاز، وهو الانزيم حشوية حال السكر 17. علاوة على ذلك، في نموذج للشخص متلازمة شديدة، دخلت الأجسام المضادة لمكافحة amphiphysin الخلايا العصبية في الجسم الحي، وشارك في المترجمة مسبقا مع متشابك علامات وتغيير GABA إطلاق 18. وهذا قد يكون مرتبطا بنية فريدة من نوعها وظيفة الخلايا العصبية. الدراسات مثل واحد هنا قدم معالجة هذه القضايا الهامة، والتسبب في أمراض المناعة الذاتية الاستمرار في دراسة وفهم أفضل 9.
hnRNP A1 هو مستضد الخلايا 5 و 9. لذلك، المطلوب منا تقنية من شأنها أن تسمح لنا لاختبار ما إذا الأجسام المضادة لمكافحة hnRNP A1 قد تسهم في ضعف الخلايا العصبية. لأنها وجدت الأجسام المضادة لA1 hnRNP في مرضى التصلب المتعدد وHAM / TSP 3، 5-7، 9، 11، تقاس نحن المضادة للhnRNP A1 والتحكم في الأجسام المضادة الخلايا العصبية. وأكد لنا أن الأجسام المضادة الخلايا ودخلت بعدوأظهرت التحليلات ميكروأري (باستخدام كل من التحكم مفتش والخلايا العصبية كما تمس الضوابط) التي تم تغيير الجينات المتصلة ظيفة hnRNP A1، مؤكدة بذلك أن ترنسفكأيشن لم يغير وظيفة مضادة للhnRNP A1 9. الأهم من ذلك، أظهرت التحليلات ميكروأري مزيد من وجود ارتباط بين استجابة الأجسام المضادة ضد hnRNP A1 مع التعبير غيرت من spastin، الجين المتحور والتي عندما، يحاكي النمط الظاهري السريرية للمرضى MS وHAM / TSP 9. وهذا يدل على أنه يمكن استخدام الأجسام المضادة ترنسفكأيشن لاختبار ما إذا أجسام مضادة لأهداف داخل الخلايا يمكن أن يغير الوظائف الخلوية. هذا له فائدة مع عدد من أمراض المناعة الذاتية الأخرى مثل SLE، RA، ومتلازمات الأباعد الورمية السرطانية ذات الصلة.
وباختصار، فإن القدرة على بالنقل موثوق الأجسام المضادة في الخلايا الحية يتيح الفرصة لطرح الأسئلة وظيفة الأجسام المضادة، الأجسام المضادة: تفاعلات الهدف وتوطين أهداف داخل الخلايا في الظروف العادية والمرض </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل من قبل مكتب البحوث والتنمية، الخدمات الطبية البحوث وزارة شؤون المحاربين القدامى. وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل على جائزة الاستحقاق استعراض VA (لMCL) وجامعة ولاية تينيسي العلوم الصحية مركز التصلب المتعدد صندوق البحث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
- Burkhardt, H. Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).
- Chester, K. A. Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft. J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).
- Lee, S. M. HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease. Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).
- Reeves, W. H. Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones. Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).
- Levin, M. C. Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease. Nat. Med. 8, 509-513 (2002).
- Lee, S. M. Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease. Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).
- Kalume, F. Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing. J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).
- Levin, M. C. Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry. J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).
- Lee, S. A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease. J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).
- Smeenk, R. J. Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease. Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).
- Lee, S. Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease. J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).
- Reisinger, H. Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection. Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).
- Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells. Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).
- Radic, M. Z. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases. J. Immunol. 176, 68-74 (2006).
- Vincent, A. Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen. Brain. 133, 3164-3165 (2010).
- Vincent, A. Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic. Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).
- Magrys, A. The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy. J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).
- Geis, C. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
