Summary
Une réponse rapide pour étudier les interactions et les effets sur les mécanismes moléculaires liés à la présence d'anticorps dans un environnement intracellulaire est décrite. Le procédé comprend la transfection d'anticorps dans des cellules vivantes à l'aide d'une formation de complexe non covalent sur la base d'une formulation de lipide. La technique est adaptable à des lignées de cellules immortalisées et des cellules primaires.
Abstract
Anticorps offrir la possibilité d'acquérir un nouvel aperçu de divers événements qui se déroulent dans les systèmes vivants. La capacité à produire des anticorps hautement spécifiques à des protéines cibles a permis de très précis des questions biologiques à traiter. Surtout, les anticorps ont été impliqués dans la pathogenèse de plusieurs maladies humaines, notamment le lupus érythémateux systémique (LES), la polyarthrite rhumatoïde (PR), les syndromes paranéoplasiques, la sclérose en plaques (MS) et humaine de type virus T-lymphotrope 1 (HTLV-1) myélopathie associée / paraparésie spastique tropicale (TSP / HAM) 1-9. Comment anticorps provoquent la maladie est un domaine de recherche en cours et les données suggèrent que les interactions entre les anticorps et les différentes molécules intracellulaires résultats dans l'inflammation, modifié cellulaire de messagerie, et l'apoptose 10. Il a été montré que les patients atteints de SEP et TSP / HAM produire des anticorps contre la protéine intracellulaire d'ARN hétérogène protéine de liaison ribonuclear A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Des données récentes indiquent que les anticorps à la fois intra-neuronale et antigènes de surface sont pathogènes 3, 5-9, 11. Ainsi, une procédure qui permet l'étude des anticorps intracellulaire: les interactions entre protéines donnerait une grande perspicacité dans la pathogenèse des maladies.
Les gènes sont souvent transfecté dans des cellules primaires et les lignées cellulaires en culture, mais la transfection d'anticorps dans les cellules a été entravée par la modification de la structure d'anticorps ou de l'efficacité de transfection pauvres 12. D'autres méthodes de transfection comprennent la transfection d'anticorps à base de liposomes cationiques (composés de DOTAP / DOPE) et polyéthylèneimines (PEI), tous deux ce qui a entraîné une diminution de dix fois dans la transfection d'anticorps par rapport aux témoins 12. Le procédé mis en oeuvre dans notre étude est similaire à lipide cationique à médiation méthodes et utilise un mécanisme à base de lipides pour former des complexes non covalents avec des anticorps à travers électrostatique et hydrinteractions ophobic 13. On utilise Ac-DeliverIN réactif, qui est une formulation de lipide capable de capturer des anticorps par des interactions non covalentes électrostatiques et hydrophobes et les délivrer à l'intérieur des cellules. Ainsi, chimiques et génétiques raccords ne sont pas nécessaires pour la livraison des anticorps fonctionnels dans les cellules vivantes. Cette méthode nous a permis d'effectuer des anticorps différents traçage et expériences de localisation de protéines, ainsi que les analyses des conséquences moléculaires de l'anticorps intracellulaire: interactions protéiques 9.
Dans ce protocole, nous allons montrer comment pour transfecter des anticorps dans les neurones rapide, reproductible et avec un haut degré d'efficacité de la transfection. A titre d'exemple, nous allons utiliser des anticorps anti-hnRNP A1 et anti-IgG. Pour la quantification facile d'efficacité de la transfection, nous avons utilisé des anticorps anti-hnRNP A1 étiquetés avec Atto-550-NHS et marqué au FITC IgG. Atto550 NHS est un nouveau label avec absorption moléculaire élevé et quantique yield. Source d'excitation et des filtres à fluorescence pour Atto550 sont similaires à Cy3 (Ex. 556 Em. 578). En outre, Atto550 a photostabilité élevée. Marqué au FITC IgG ont été utilisés comme contrôle pour montrer que cette méthode est polyvalent et se teignait pas dépendant. Cette approche et les données qui sont générées aidera à comprendre le rôle que les anticorps à des antigènes cibles intracellulaires pourrait jouer dans la pathogenèse des maladies humaines.
Protocol
1. Marquage de l'anticorps (figure 1)
- Assurez 0,1 M de tampon NaHCO 3:
- 8,4 g de NaHCO 3
- 29,2 g de NaCl
- 1 litre H 2 O
- Amener le tampon à un pH de 8,4 avec cette solution (10,6 g Na 2 CO 3, 29,2 g de NaCl, 1 litre H 2 0).
- Ajouter 35 ul Atto550 NHS à 70 ul anti-hnRNPA1 et 500 pi de tampon NaHCO 3 et tourner pendant 1 heure à température ambiante. Après la rotation d'une heure, l'injection du mélange dans un appareil de dialyse et dialyse dans 2 litres de PBS pendant une nuit.
- Le lendemain, concentrer les Atto550 dialysés NHS anti-hnRNPA1 l'aide d'une colonne de centrifugation (Amicon Ultra 0,5).
- Après NHS Atto550 les anticorps anti-anticorps hnRNPA1 a été concentré, nano-goutte d'échantillon pour déterminer la concentration.
2. La transfection d'anticorps (figure 2)
- Seed 10 5 cellules / puits dans 500 ul de Dulbecco Eagle modifié Moyen (DMEM/F12 +10% SVF + 1% d'antibiotiques) dans un 8 diapositive 24 h et avant la transfection. Confluence cellulaire doit être d'au moins 70%.
- Vingt-quatre heures après l'ensemencement, ajouter 2 pi de Ab-DeliverIN réactif dans un tube Eppendorf.
- Ensuite, ajoutez 2 pg de Atto550 NHS des anticorps anti-anticorps hnRNPA1 (0,5 pg / pl) dans le même tube Eppendorf et incuber 10-15 min à température ambiante.
- Pendant l'incubation, aspirer les médias et ajouter 394 ul de DMEM frais de support pour les cellules.
Remarque: Ajouter 500 ul de DMEM à une chambre de cellules intactes pour agir à titre de témoin.
- Après incubation, ajouter 100 ul de DMEM le mélange d'anticorps, mélanger par pipetage de haut en bas, et d'ajouter aux cellules dans du DMEM pour un volume total de 500 ul.
- Changer les médias après 48 heures de la livraison d'anticorps.
Remarque: le protocole a été répété avec marqué au FITC Rigg comme témoin positif.
3. Imagerie en direct et fixes pour déterminer l'efficacité
- Cellules d'image en direct à 48 h à l'aide des Cy3 filtre sur un microscope à fluorescence à l'image des Atto550 transfectées NHS anticorps marqués.
- Après imagerie en temps réel a été achevée, aspirer les médias et les cellules fixes.
- Après médias aspiration, traiter les cellules avec du paraformaldéhyde 0,4% pendant 15 min à température ambiante. Laver les cellules 4 x 5 min à chaque fois avec du PBS. Ensuite, montez les cellules avec un milieu de montage contenant réactif DAPI et lamelle fixe. Mesurer l'efficacité de transfection des cellules fixes avec AxioVision logiciel. Si AxioVision logiciel n'est pas à portée de main, il suffit de compter les événements de votre image en main les résultats et le brancher sur le calcul en 3.7. Sinon, le logiciel ImageJ peut être utilisée pour ces calculs.
- Tout d'abord, utiliser le "Evénements" de mesure de compter le nombre total de cellules dans votre image de son choix à un grossissement de 20x.
- Ensuite, utilisez la "Evénements" de mesure de compter les cellules qui ne sont pastransfecté avec succès avec des anticorps dans le même 20x de grossissement d'image.
- Pour accéder aux mesurées "Evénements" dans un format de style Excel, cliquez sur "Propriétés", cliquez sur "Mesure" onglet, puis cliquez sur pour afficher «Comme le tableau."
- Enfin, faites le calcul suivant pour déterminer votre efficacité de la transfection en comparant les deux événements précédemment mesurés: ((cellules totales - Cellules non transfectées) / cellules totales) x 100 = efficacité de la transfection.
4. Les résultats représentatifs
Les images en direct de non transfectées (figure 3A) par rapport aux transfectées (figure 3B) neurones montrent que le marquage des anticorps (rouge ou vert dans chaque figure) est clairement observé dans les cellules (figure 3B, C, D). Suite à l'aspiration et de lavage avec support pour éliminer les anticorps ou entre adhérentes à la surface des cellules, des anticorps marqués sont encore présents dans les neurones (figure 3C, D). Pour calculer l'efficacité de la transfection, utilisez le logiciel AxioVision pour calculer nombre total de cellules par rapport aux cellules qui n'ont pas été transfectées avec succès. Ces valeurs ont été entrées dans une formule d'efficacité de transfection pour acquérir l'efficacité de transfection en pourcentage du nombre total de cellules (figure 4).
Figure 1. Schéma des procédures utilisées à des anticorps étiquette avec l'ester NHS 550 Atto suivie par des étapes nécessaires pour concentrer les anticorps marqués. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Schéma des procédures utilisées pour transfecter des anticorps marqués dans les cellules vivantes en culture.arge.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.
Figure 3. Les images en direct des neurones transfectés 48 heures après la transfection.
Figure 4. Correction d'images et rincés avec les événements en compte afin de déterminer l'efficacité de transfection.
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Discussion
Afin de tester des hypothèses sur des molécules spécifiques et de leur expression, des gènes et d'autres vecteurs sont couramment transfecté dans des cellules. L'aspect unique de cette procédure est la possibilité de facilement transfecter des anticorps dans les cellules cibles. Nous avons effectué cette méthode dans cinq expériences séparées, chacune en double. Résultats d'efficacité de transfection étaient similaires chez toutes les expériences. Surtout, le procédé permet l'entrée d'anticorps dans la cellule sans en modifier la structure ou la fonction d'anticorps. De plus, avec l'utilisation de la microscopie de fluorescence de neurones vivants, nous sommes en mesure de déterminer l'efficacité de transfection, qui dépasse souvent 55%. Cela permet de tester des hypothèses se rapportant directement à l'interaction entre l'anticorps d'intérêt et sa cible intracellulaire. Bien que non étudié ici, les fragments Fab peuvent également être utilisés. Alternativement, les expériences peuvent être conçus que d'examiner si la modification des conditions de culture comme l'ajout de cytokines inflammatoires affecte expressiou sur la localisation des cibles intracellulaires.
Comment anticorps peuvent cibler des antigènes intracellulaires est un domaine en cours d'investigation. Théorie dominante indique que suite à une lésion cellulaire, antigènes intracellulaires sont exposés à la réponse immunitaire adaptative, ce qui permet la production d'anticorps à l'antigène cible. La réponse en anticorps chez les patients lupiques hnRNP est un exemple de la façon dont ce risque se produit. Patients atteints de fabriquer des anticorps pour hnRNP P2 et sur l'apoptose des cellules cibles, P2 hnRNP est transporté à la surface de la cellule où il est disponible pour générer une réponse auto-immune 14. Cela a également été démontré dans la maladie neurologique, dont les études ont suggéré que les antigènes de surface seulement sur les neurones pourraient être des cibles pour une réponse auto-immune pathogène 15, 16. Cette idée est aujourd'hui remise en question. Fait intéressant, il ya maintenant des données suggérant que les anticorps peuvent entrer neurones d'une manière épitope spécifique. Par exemple, dans la rétinopathie auto-immune, unenti-énolase anticorps pénétré neurones et altéré la fonction de l'énolase, une enzyme cytoplasmique glycolytique 17. De plus, dans un modèle de raideur personne syndrome des anticorps anti-amphiphysine entré neurones in vivo, co-localisée avec des marqueurs pré-synaptiques et une altération de la libération de GABA 18. Cela pourrait être lié à la structure unique et la fonction des neurones. Des études comme celle présentée ici répondre à ces questions importantes, comme la pathogenèse de la maladie auto-immune continuent d'être étudiées et mieux comprises 9.
hnRNP A1 est un antigène intracellulaire 5, 9. Par conséquent, nous avons exigé une technique qui nous permettrait de vérifier si des anticorps anti-hnRNP A1 pourraient contribuer à un dysfonctionnement neuronal. Parce que des autoanticorps anti-hnRNP A1 ont été trouvés chez les patients SEP et TSP / HAM 3, 5-7, 9, 11, nous avons transfecté des anticorps anti-hnRNP A1 et de contrôle dans les neurones. Nous avons confirmé que les anticorps entré dans les cellules et à la suiteanalyses de microréseaux (utilisant à la fois le contrôle IgG et les neurones intacts que les contrôles) ont montré que les gènes liés à la hnRNP A1 fonction ont été modifiées, ce qui confirme que la transfection n'a pas modifié anti-hnRNP A1 fonction 9. Fait important, les analyses de microréseaux d'autres ont montré une association entre la réponse anticorps anti-hnRNP A1 avec altération de l'expression de spastin, un gène qui, lorsqu'il est muté, imite le phénotype clinique de patients atteints de SEP et TSP / HAM 9. Cela montre que la transfection d'anticorps peut être utilisé pour tester si des anticorps dirigés contre des cibles intracellulaires peuvent altérer les fonctions cellulaires. Cela a l'utilité d'un certain nombre d'autres maladies auto-immunes comme le lupus érythémateux disséminé, polyarthrite rhumatoïde, et les syndromes paranéoplasiques associés au cancer.
En résumé, la capacité à transfecter de manière fiable les anticorps dans des cellules vivantes offre la possibilité de poser des questions à la fonction anticorps, anticorps:. Interactions cibles et la localisation des cibles à l'intérieur des cellules dans des conditions normales et la maladie </ P>
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par le Bureau de la recherche et du développement, de la recherche médicale Service, Department of Veterans Affairs. Cette étude a été financée par une bourse de l'examen du mérite VA (à MCL) et à l'Université du Tennessee Health Science Center de la sclérose multiple Fonds de recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
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