Summary
Un approccio rapido per investigare le interazioni e gli effetti sui meccanismi molecolari legati alla presenza di anticorpi in un ambiente intracellulare viene descritto. Il metodo comporta la transfezione di anticorpi nelle cellule vive utilizzando un non-covalente formazione del complesso basato su una formulazione lipidica. La tecnica è adattabile a linee cellulari immortalizzate e cellule primarie.
Abstract
Anticorpi fornire la capacità di ottenere informazioni romanzo in vari eventi che si svolgono in sistemi viventi. La capacità di produrre anticorpi altamente specifici per le proteine bersaglio ha consentito di questioni biologiche molto precise da affrontare. Soprattutto, gli anticorpi sono stati implicati nella patogenesi di numerose malattie umane comprendenti lupus eritematoso sistemico (SLE), artrite reumatoide (RA), sindromi paraneoplastiche, sclerosi multipla (SM) e umane T linfotropico virus di tipo 1 (HTLV-1) mielopatia associata / paraparesi spastica tropicale (HAM / TSP) 1-9. Come anticorpi causano la malattia è una zona di un'indagine in corso, ed i dati suggeriscono che le interazioni tra gli anticorpi e molecole intracellulari vari risultati in infiammazione, alterazione cellulare di messaggistica, e l'apoptosi 10. E 'stato dimostrato che i pazienti con SM e HAM / TSP produrre autoanticorpi al intracellulare di RNA binding protein proteine eterogenee ribonuclear A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Dati recenti indicano che gli anticorpi per intra-neuronale e antigeni di superficie sono patogeni 3, 5-9, 11. Pertanto, un procedimento che consente lo studio di anticorpo intracellulare: proteina presterebbe grande intuizione patogenesi della malattia.
I geni sono comunemente trasfettati in cellule primarie e linee cellulari in coltura, tuttavia trasfezione in cellule di anticorpi è stato ostacolato dalla alterazione della struttura anticorpo o scarsa efficienza di transfezione 12. Altri metodi di trasfezione includono trasfezione anticorpo basato su liposomi cationici (costituito DOTAP / DOPE) e polyethylenimines (PEI), entrambi i quali ha determinato un decremento di dieci volte nella trasfezione anticorpo rispetto ai controlli 12. Il metodo eseguito nel nostro studio è simile a lipidi cationici-mediate metodi e utilizza una base lipidica meccanismo per formare non covalenti complessi con gli anticorpi attraverso elettrostatica e hydrinterazioni ophobic 13. Abbiamo utilizzato Ab-DeliverIN reattivo, che è una formulazione lipidica in grado di catturare anticorpi attraverso interazioni elettrostatiche e idrofobi non-covalenti e depositarli all'interno delle cellule. Così chimica e genetica accoppiamenti non sono necessari per la consegna di anticorpi funzionali nelle cellule viventi. Questo metodo ci ha permesso di eseguire l'analisi degli anticorpi vari esperimenti e localizzazione della proteina, così come le analisi delle conseguenze molecolari di anticorpi intracellulari: interazioni delle proteine 9.
In questo protocollo, si mostrerà come trasfettare anticorpi in neuroni rapida, riproducibile e con un elevato grado di efficienza di trasfezione. A titolo di esempio, useremo anticorpi anti-hnRNP A1 e anti-IgG. Per la quantificazione facile di efficienza di trasfezione abbiamo utilizzato anticorpi anti-A1 hnRNP etichettati con Atto-550-NHS e marcato con FITC IgG. Atto550 NHS è una nuova etichetta ad alto assorbimento molecolare e quantistica yiELD. Fonte di eccitazione e filtri fluorescenti per Atto550 sono simili a Cy3 (Es. 556 Em. 578). Inoltre, Atto550 ha fotostabilità alta. Marcato con FITC IgG sono stati utilizzati come controllo per dimostrare che questo metodo è versatile e non tingere dipendente. Questo approccio e i dati generati aiuterà nella comprensione del ruolo che gli anticorpi per antigeni bersaglio intracellulare potrebbe svolgere nella patogenesi delle malattie umane.
Protocol
1. Anticorpo Labeling (Figura 1)
- Fai 0.1 M NaHCO 3 buffer:
- 8,4 g NaHCO 3
- 29,2 g NaCl
- 1 litro H 2 O
- Portare il buffer fino ad un pH di 8,4 con questa soluzione (10,6 g di Na 2 CO 3, 29,2 g di NaCl, 1 litro H 2 0).
- Aggiungere 35 ul Atto550 NHS a 70 pl pl NaHCO anti-hnRNPA1 e 500 3 tampone e ruotarlo per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora di rotazione, iniettare il composto in un dializzatore e dializza in 2 litri di PBS durante la notte.
- Il giorno dopo, concentrare i dializzati Atto550 NHS anti-hnRNPA1 utilizzando una colonna di spin (Amicon Ultra 0.5).
- Dopo le Atto550 NHS marcato anti-hnRNPA1 anticorpo è stato concentrato, nano-drop campione per determinare la concentrazione.
2. Anticorpo trasfezione (Figura 2)
- Seed 10 5 cellule / pozzetto in 500 pl di Dulbecco di Eagle modificato Medio (DMEM/F12 10% FBS 1% antibiotico) in un pozzetto 8 slitta 24 ore prima della trasfezione. Confluenza cellulare deve essere almeno il 70%.
- Ventiquattro ore dopo la semina, aggiungere 2 ml di Ab-DeliverIN reagenti in una provetta Eppendorf.
- Successivamente, aggiungere 2 ug di Atto550 NHS etichettati hnRNPA1 anticorpo anti-(0,5 pg / pl) allo stesso tubo Eppendorf e incubare 10-15 min a RT.
- Durante l'incubazione, aspirare media e aggiungere 394 ml di DMEM fresco supporto alle cellule.
Nota: Aggiungere 500 microlitri DMEM ad una camera di cellule intatte per fungere da controllo.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 100 ml di DMEM alla miscela di anticorpi, mescolare pipettando su e giù, e aggiungere alle cellule in DMEM per un volume totale di 500 microlitri.
- Modificare i media dopo 48 ore di consegna anticorpi.
Nota: protocollo è stato ripetuto con FITC Rigg etichettato come controllo positivo.
3. Imaging Live e stabiliti per determinare l'efficienza
- Celle di immagine, vivono a 48 ore utilizzando i Cy3 filtro su un microscopio a fluorescenza per l'immagine del trasfettate Atto550 NHS anticorpi marcati.
- Dopo l'imaging dal vivo è stata completata, aspirare i media e le cellule fisse.
- Dopo mezzi aspiranti, il trattamento di cellule con 0,4% paraformaldeide per 15 min a temperatura ambiente. Lavare le cellule 4 x 5 min ciascuna con PBS. Poi, montare cellule con mezzi di montaggio contenenti reagenti DAPI e applicare il coprioggetto correzione. Misurare l'efficienza di trasfezione delle cellule fisse con AxioVision software. Se AxioVision software non è a portata di mano, basta contare gli eventi dall'immagine i risultati a mano e inserire nel calcolo in 3.7. In alternativa, il software ImageJ può essere utilizzato per questi calcoli.
- In primo luogo, utilizzare la misurazione "Eventi" per contare il numero totale di celle nella vostra immagine di scelta un ingrandimento 20x.
- Successivamente, utilizzare la misurazione "Eventi" per contare le cellule che non eranosuccesso trasfettate con anticorpi nella stessa 20x ingrandimenti.
- Per accedere ai misurati "Eventi" in un formato stile Excel, fare clic su "Proprietà", fare clic sulla scheda "Misura", e fare clic per visualizzare "come tabella."
- Infine, utilizzare il seguente calcolo per determinare l'efficienza di trasfezione confrontando i due eventi misurate in precedenza: ((Totale cellule - cellule non trasfettate) / cellule totali) x 100 = La trasfezione di efficienza.
4. Risultati rappresentativi
Le immagini live non trasfettate (Figura 3A) rispetto al trasfettate (Figura 3B) neuroni rivelano che l'etichettatura degli anticorpi (rosso o verde in ogni figura) è chiaramente osservata nelle cellule (Figura 3B, C, D). Seguendo aspirazione e lavaggio con mezzi per rimuovere gli anticorpi o tra aderenti alla superficie delle cellule, anticorpi marcati sono ancora presenti all'interno dei neuroni (Figura 3C, D). Per calcolare l'efficienza di trasfezione, utilizzare il software AxioVision per calcolare cellule totali rispetto alle cellule che non sono state transfettate con successo. Questi valori sono stati inseriti in una formula efficienza di trasfezione di acquisire l'efficienza di trasfezione come percentuale di cellule totali (Figura 4).
Figura 1. Diagramma di flusso delle procedure utilizzate per gli anticorpi etichette con la 550 Atto NHS estere seguita da passaggi necessari per concentrare gli anticorpi marcati. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Diagramma di flusso delle procedure utilizzate per trasfettare anticorpi marcati nelle cellule vive in coltura.arge.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 3. Immagini in diretta dei neuroni trasfettati trasfezione 48 ore di seguito.
Figura 4. Fisso e risciacquati immagini con eventi contati per determinare l'efficienza di trasfezione.
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Discussion
Al fine di verificare ipotesi circa molecole specifiche e la loro espressione, altri geni e vettori sono comunemente trasfettati in cellule. L'aspetto unico di questo procedimento è la possibilità di trasfettare facilmente anticorpi nelle cellule bersaglio. Abbiamo eseguito questo metodo in cinque esperimenti separati ciascuno in duplicati. Risultati di efficienza di trasfezione erano simili in tutti gli esperimenti. Soprattutto, il metodo permette l'inserimento di anticorpi nella cellula senza alterare la struttura anticorpo o funzione. Inoltre, con l'uso di microscopia a fluorescenza di neuroni vivi, siamo in grado di determinare l'efficienza di trasfezione, che supera generalmente 55%. Questo permette di verificare ipotesi legate direttamente l'interazione tra l'anticorpo di interesse e il suo bersaglio intracellulare. Sebbene non studiati qui, frammenti Fab possono anche essere utilizzati. In alternativa, gli esperimenti possono essere progettati in modo che esaminare se alterando le condizioni di coltura come l'aggiunta di citochine infiammatorie colpisce espressivoo sulla localizzazione dei bersagli intracellulari.
Come anticorpi potrebbe indirizzare antigeni intracellulari è un'area in corso di indagine. Teoria prevalente indica che dopo danno cellulare, antigeni intracellulari sono esposti alla risposta immunitaria, che permette la produzione di anticorpi per l'antigene bersaglio. La risposta anticorpale ai hnRNPs nei pazienti affetti da LES è un esempio di come questo probabilmente si verifica. SLE pazienti producono anticorpi per P2 e hnRNP upon apoptosi delle cellule bersaglio, P2 hnRNP viene trasportato alla superficie della cellula dove è disponibile per generare una risposta autoimmune 14. Questo è stato dimostrato anche in malattie neurologiche, in cui studi hanno suggerito che gli antigeni di superficie soltanto sui neuroni potrebbero essere bersagli per una risposta autoimmune patogeno 15, 16. Questa idea è in fase di discussione. È interessante notare, vi è ora dati che suggeriscono che gli anticorpi possono entrare neuroni in modo specifico epitopo. Per esempio, in retinopatia autoimmune, unanti-enolasi anticorpi penetrato neuroni e alterata la funzione di enolasi, un enzima glicolitico citoplasmatico 17. Inoltre, in un modello di stiff-person sindrome, anticorpi anti-anfifisina inserito neuroni in vivo, co-localizzato con pre-sinaptici marcatori e alterato rilascio GABA 18. Questo potrebbe essere legato alla struttura unica e funzione dei neuroni. Studi come quello qui presentato affrontare tali questioni importanti, come la patogenesi della malattia autoimmune continuano ad essere studiata e meglio compresa 9.
hnRNP A1 è un antigene intracellulare 5, 9. Pertanto, si richiede una tecnica che ci permetta di verificare se gli anticorpi anti-A1 hnRNP potrebbe contribuire alla disfunzione neuronale. Poiché gli anticorpi degli hnRNP A1 sono stati trovati in pazienti con SM e HAM / TSP 3, 5-7, 9, 11, abbiamo trasfettate anticorpi anti-hnRNP A1 e il controllo in neuroni. Abbiamo confermato che anticorpi inserito le cellule e seguendoanalisi di microarray (utilizzando sia IgG di controllo e di neuroni intatti i controlli) hanno dimostrato che i geni correlati alla funzione hnRNP A1 sono state modificate, confermando così che la trasfezione non ha alterato la funzione anti-hnRNP A1 9. È importante sottolineare che le analisi microarray ulteriori hanno mostrato un'associazione tra l'anti-hnRNP risposta anticorpale A1 con alterata espressione di spastin, un gene che, se mutato, imita il fenotipo clinico dei pazienti affetti da SM e HAM / TSP 9. Questo dimostra che la trasfezione anticorpo può essere utilizzato per verificare se anticorpi bersagli intracellulari possono alterare le funzioni cellulari. Questo ha utilità con un certo numero di altre malattie autoimmuni come il LES, RA, e le sindromi paraneoplastiche tumore.
In sintesi, la capacità di trasfettare affidabile anticorpi in cellule viventi offre l'opportunità di porre domande funzione di anticorpo, anticorpi:. Interazioni bersaglio e localizzazione dei bersagli all'interno delle cellule in condizioni normali e malattia </ P>
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dall'Ufficio di Ricerca e Sviluppo, Ricerca medica Service, Department of Veterans Affairs. Questo studio è stato finanziato da un premio VA recensione Merit (per MCL) e la University of Tennessee Health Science Fondo sclerosi multipla Research Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
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