Summary
相互作用や細胞内環境における抗体の存在に関連する分子メカニズムに及ぼす影響を調査するための迅速なアプローチが説明されています。この方法は、脂質製剤に基づく非共有結合複合体形成を利用した生細胞への抗体のトランスフェクションが含まれます。技術は不死化細胞株および初代培養細胞に適応可能です。
Abstract
抗体は、生体のシステムで行われている様々なイベントに新たな洞察を得るための機能を提供します。標的タンパク質に特異性の高い抗体を産生する能力が対処しなければ、非常に正確な生物学的な質問のために許可されています。重要なのは、抗体は全身性エリテマトーデス（SLE）、関節リウマチ（RA）、腫瘍随伴症候群、多発性硬化症（MS）とヒトTリンパ球向性ウイルス1型（HTLV-1）を含むヒトの多くの疾患の病因に関与している脊髄症/熱帯性痙性対麻痺（HAM / TSP）1-9関連付けられています。抗体は、病気が進行中の調査の領域であり、データは抗体および炎症の様々な細胞内分子の結果の間の相互作用は、携帯メッセージング、およびアポトーシス10を変更していることを示唆している原因になる方法。これは、MSとHAM / TSP患者は細胞内のRNA結合タンパク質異種リボ核タンパク質に対する自己抗体を産生することが示されている5月7日 1（のhnRNP A1）は3、9、11。最近のデータは、イントラ神経および表面抗原の両方に対する抗体が病原3、5月9日、11であることを示している。したがって、細胞内抗体の研究を可能にする手順：タンパク質相互作用は、疾患の病因に偉大な洞察力を貸すだろう。
遺伝子は一般的に初代培養細胞や培養細胞株にトランスフェクトされ、細胞内への抗体のトランスフェクションは、しかし抗体構造または貧弱トランスフェクション効率を12の改変によって妨げられている。トランスフェクションの他の方法としては、カチオン性リポソーム（DOTAP / DOPEから成る）とポリエチレンイミン（PEI）に基づく抗体のトランスフェクションを含む;コントロール12と比較して、抗体のトランスフェクションの10倍に減少したどちらも。私たちの研究で行った方法では、陽イオン脂質媒介方法に類似しており、静とhydrを通じて抗体と非共有結合複合体を形成するために、脂質ベースのメカニズムを使用しophobic相互作用13。我々は、非共有結合、静電性および疎水性相互作用を介して抗体を捕捉し、細胞内でそれらを提供することができる脂質製剤であるAB-DeliverIN試薬を利用した。したがって、化学的および遺伝的カップリングは生細胞に機能的な抗体の送達のためには必要ありません。この方法では、さまざまなトレース抗体やタンパク質の局在化実験と同様に、細胞内抗体の分子の結果の分析を行うことができるようになりました：タンパク質相互作用9。
このプロトコルでは、再現性とトランスフェクション効率の高い、急速に神経細胞に抗体をトランスフェクトする方法を示します。一例として、我々はアンチのhnRNP A1および抗IgG抗体を使用します。トランスフェクション効率を簡単に定量化のために、我々はアト-550-NHSとFITC標識IgGで標識した抗のhnRNP A1抗体を使用していました。 Atto550 NHSは高分子吸収と量子yiを持つ新しいラベルですELD。励起源とAtto550用蛍光フィルターはCy3（例：556エム。578）に似ています。また、Atto550は高い光安定性を持っています。 FITC標識IgGは、このメソッドは汎用性であることを示していると依存染めないようにコントロールとして用いた。生成されたこのアプローチは、データは細胞内標的抗原に対する抗体は、ヒト疾患の病因に果たしていることが役割の理解に役立ちます。
Protocol
1。抗体標識（図1）
- 、0.1M NaHCO 3緩衝液を加えます。
- 8.4グラムのNaHCO 3
- 29.2グラムのNaCl
- 1リットル、H 2 O
- この溶液を用いて8.4のpH（10.6グラムのNa 2 CO 3、29.2グラムのNaCl、1リットル、H 2 0）にバッファを立ち上げます。
- 70μlの抗hnRNPA1と500μlのNaHCO 3緩衝液に35μlのAtto550 NHSを加え、室温で1時間回転させます。時間の回転した後、透析に混合物を注入し、一晩のPBSで2リットルで透析する。
- 翌日、スピンカラム（アミコンウルトラ0.5）を用いた抗hnRNPA1透析しAtto550 NHSを集中する。
- Atto550 NHSは抗hnRNPA1抗体が濃縮された標識の後、ナノドロップサンプル濃度を決定する。
2。抗体のトランスフェクション（図2）
- シード10 5細胞/ウェルDulbecc500μlの中へトランスフェクションの8ウェルスライド24時間におけるoダルベッコ改変イーグル培地（DMEM/F12 +10％FBS +1％抗生物質）。コンフルエントの細胞の少なくとも70％であるべきである。
- 二十四時間播種後、エッペンドルフチューブにAB-DeliverIN試薬の2μlを添加する。
- 次に、同じエッペンドルフチューブに抗hnRNPA1抗体（0.5μg/μLの）標識Atto550 NHSの2μgを追加し、室温で10〜15分間インキュベートする。
- インキュベーションの間、培地を吸引し、細胞に新鮮なDMEM培地の394μlを添加する。
注：コントロールとして動作するように手つかずの細胞の1室に500μlのDMEMを追加します。
- インキュベーション後、上下にピペッティングして混合、抗体液に100μlのDMEMを追加し、500μlの合計ボリュームに対して、DMEM中のセルに追加します。
- 抗体配信の48時間後にメディアを変更してください。
注：プロトコルは、FITCはポジティブコントロールとしてRIGGラベル付きで繰り返した。
3。効率を決定するライブと固定撮像
- 画像の細胞は、トランスフェクト画像Atto550 NHSの標識抗体をに蛍光顕微鏡でCy3のフィルタを使用して48時間で生活しています。
- ライブイメージングが完了した後、メディアやフィックス細胞を吸引除去する。
- メディアを吸引した後、室温で15分間、0.4％パラホルムアルデヒドで細胞を治療。細胞をPBSで4×5分間ずつを洗ってください。その後、DAPI試薬およびフィックスカバースリップを含むマウントメディアを持つ細胞をマウントします。 AxioVisionのソフトウェアを使用して固定された細胞のトランスフェクション効率を測定します。 AxioVisionのソフトが手元にない場合は、単に3.7の計算に手やプラグ結果によってあなたのイメージからのイベントをカウントします。あるいは、ImageJのソフトウェアは、これらの計算に使用することができます。
- まず、20倍の倍率でお好みの画像内のセルの総数をカウントする "イベント"の測定を使用しています。
- 次に、なかった細胞をカウントする "イベント"の測定値を使用正常に同じ20倍倍率画像で抗体でトランスフェクションした。
- Excelのスタイル形式で測定された "イベント"にアクセスするには、 "プロパティ"をクリックして、 "計測"タブをクリックし、表示をクリックし、 "テーブルとして。"
- 最後に、2つの以前に測定されたイベントを比較することによって、あなたのトランスフェクション効率を決定するには、次の計算式を使用します（（総細胞 - 非トランスフェクト細胞）/総細胞数）×100 =トランスフェクション効率。
4。代表的な結果
トランスフェクトされた（ 図3B）ニューロンに比べてトランスフェクトしていないのライブ映像（ 図3A）は 、抗体の標識は（各図中の赤または緑）が明確に（ 図3B、C、D）を細胞内に観察されることが明らかになった。吸引後、細胞の表面に付着した間、または抗体を除去するために、メディアで洗浄し、標識された抗体は、まだ神経細胞（ 図3C、D）内に存在する。トランスフェクション効率を計算するには、正常に導入しなかった細胞と比較して、合計のセルを計算するAxioVisionのソフトウェアを使用しています。これらの値は、全細胞の割合（ 図4）のようにトランスフェクション効率を獲得するため、トランスフェクション効率の計算式に入力した。
図標識抗体を濃縮するために必要な手順が続くアト550 NHSエステルを有する抗体を標識するために使用される手順の1。フロー図は拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2培養中の生細胞に標識された抗体をトランスフェクトするために使用される手続きのフロー図。arge.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。
図3：トランスフェクトされたニューロンは48時間トランスフェクション後の画像をライブ。
図4は、トランスフェクション効率を決定するためにカウントされたイベントを使用して画像を修正してすすいだ。
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Discussion
特定の分子とその発現についての仮説をテストするためには、遺伝子および他のベクターは、一般的に細胞にトランスフェクトされる。このプロシージャのユニークな点は、容易に標的細胞に抗体をトランスフェクトする能力である。我々は、重複での5つの別々の実験ごとにこの方法を行った。トランスフェクション効率の結果は、すべての実験間で同様であった。重要なのは、方法は、抗体の構造や機能を変化させることなく、細胞内に抗体のエントリを可能にします。さらに、ライブニューロンの蛍光顕微鏡を用いて、我々は一般的に55％を超えたトランスフェクション効率を決定することができます。これは、1つは、関心対象の抗体およびその細胞内標的との相互作用に直接関係の仮説をテストすることができます。ここで勉強していませんが、Fabフラグメントを利用することもできる。あるいは、そのような実験は、炎症性サイトカインの追加などの培養条件を変えることexpressiに影響を与えるかどうか検討することを設計することができます上または細胞内ターゲットの局在。
抗体は細胞内の抗原を標的とする方法は、調査の継続的なエリアです。実勢理論は、細胞傷害後、細胞内抗原を標的抗原に対する抗体産生を可能にする適応免疫応答にさらされていることを示しています。 SLE患者におけるhnRNPsに対する抗体応答は、この可能性が発生した場合の例です。 SLE患者のhnRNPはP2に抗体を作る、それが自己免疫応答14を生成するために使用可能である場合、標的細胞のアポトーシス時に、のhnRNP P2は、細胞表面に輸送される。これはまた、神経疾患で示された、ここでの研究では、神経細胞でのみ表面抗原が病原性自己免疫応答15、16のターゲットになる可能性が示唆された。このアイデアは、今問われている。興味深いことに、抗体はエピトープ特異的にニューロンを入力できることを示唆するデータは、今がある。例えば、自己免疫性網膜症で、NTI-エノラーゼ抗体は、神経細胞に浸透し、エノラーゼの機能を変化させ、細胞質の解糖系酵素17。さらに、スティッフパーソン症候群のモデルでは、抗アンフィフィシン抗体は、前シナプスマーカーと変更されたGABAの放出18と共局在し、 生体内で神経細胞に入った。これは、ニューロンのユニークな構造と機能に関連している可能性があります。 1のような研究は、自己免疫疾患の発症機序が研究され続けて、より良い9をよく理解し 、これらの重要な問題に対処するここに提示した。
のhnRNP A1は、細胞内抗原5,9です。したがって、我々は我々は、抗のhnRNP A1抗体は神経機能障害に寄与するかもしれないかどうかをテストすることを可能にする技術が必要でした。のhnRNP A1に対する自己抗体は5月7日 MSとHAM / TSP患者3、9、11で発見されたので、我々は神経細胞に抗のhnRNP A1およびコントロール抗体をトランスフェクションした。我々は、抗体が細胞と次のように入力したことを確認したマイクロアレイ解析は、（コントロールIgGやコントロールなど手つかずのニューロンの両方を使用して）このようにしているトランスフェクションは、アンチのhnRNP A1の機能9を変化させなかった確認、のhnRNP A1の機能に関連している遺伝子が変化した示した。重要なのは、さらにマイクロアレイ解析は、spastin、変異遺伝子の発現の変化と抗のhnRNP A1抗体応答との間の関連を示したMSとHAM / TSP患者9の臨床表現型を模倣しています。これは、抗体のトランスフェクションは細胞内標的に対する抗体は、細胞機能を変えることができるかどうかをテストするために使用することができることを示しています。これは、SLE、RA、および癌に関連した腫瘍随伴症候群などの他の自己免疫疾患の数とユーティリティを備えています。
要約すれば、確実に生きている細胞に抗体をトランスフェクトする能力は、抗体機能、抗体の質問尋ねる機会を提供：正常および疾患条件下で細胞内のターゲットの相互作用やターゲットの局在を</ P>
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、研究開発、医学研究サービス、退役軍人省のOfficeでサポートされています。この研究は、VAメリットレビュー賞（MCL）とテネシー大学ヘルスサイエンスセンター多発性硬化症研究基金によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
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