Summary
ويرد وصف أداة وكيمياء لعزل بالتسلسل الأحماض النووية تليها البروتينات من عينة من دون الحاجة للحصول على الكهرباء. أداة تتكون من المواد الماصة التي عقدت ضمن ماصة نقل في حين تستند على مبادئ كيمياء العزلة استخراج الصلبة المرحلة. يمكن تحليل الجزيئات المعزولة بواسطة المقايسات المناعية القاعدة والقائم على PCR.
Abstract
مسببات الأمراض التقليدية والناشئة، مثل كولاي Enterohemorrhagic (EHEC)، طاعون يرسينيا، أو الأمراض البريونية المستندة إلى مصدر قلق كبير بالنسبة للحكومات والصناعات والمهن الطبية في جميع أنحاء العالم. على سبيل المثال، EHECs، جنبا إلى جنب مع الشغيلة، هي المسؤولة عن وفاة ما يقرب من 325000 طفل كل عام، وتنتشر بشكل خاص في العالم النامي حيث المختبرات لتحديد الهوية، وشائع في الولايات المتحدة، غير متوفرة 1. تطوير وتوزيع منخفضة التكلفة، ويمكن على الصعيد الميداني، نقطة من الرعاية أدوات للمساعدة في التعرف السريع و / أو تشخيص مسببات الأمراض أو علامات المرض تغير بشكل كبير تطور المرض والتشخيص للمرضى. قمنا بتطوير أداة لعزل الأحماض النووية والبروتينات من عينة بواسطة الصلبة مرحلة الاستخراج (SPE) من دون كهرباء أو يرتبط بها من معدات المختبرات 2. يمكن استخدام الجزيئات معزولة عن diagnoالهيئة العامة للاستعلامات سواء في المختبر أو إلى الأمام باستخدام الميدانية نقطة من الرعاية المنصات. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب يوفر للمقارنة المباشر للحامض النووي وبيانات بروتين من عينة من الامم المتحدة والانقسام، وتقدم الثقة من خلال التثبت من التحليل الجيني والبروتين.
أداة لدينا العزلة يستخدم معيار الصناعة لالصلبة مرحلة العزلة الحمض النووي، والتكنولوجيا الازدهار، الذي يعزل الأحماض النووية من محلول ملحي chaotropic، وعادة ما جوانيداين الفصيلة، من خلال الربط إلى السيليكا المستندة إلى جزيئات أو 3 مرشحات. ويستخدم CUBRC في الملكية كيمياء استخراج الصلبة مرحلة لتنقية البروتين من الحلول ملح chaotropic، في هذه الحالة، من النفايات أو من خلال تدفق، بعد عزل الحمض النووي 4.
من قبل التعبئة والتغليف جيدا تتميز كيمياء في منصة صغيرة وغير مكلفة وبسيطة، لقد ولدت لدينا نظام محمول للحامض النووي واستخراج البروتين التي يمكن القيام بها في ظل فارiety من الشروط. الأحماض النووية المعزولة في حالة مستقرة ويمكن أن ينتقل إلى وضع يمكنها من حيث القوة هو متاح لتضخيم PCR بينما يمكن على الفور محتوى البروتين يمكن تحليلها بواسطة باليد أو غيرها من المقايسات المناعية مقرها. ويمكن التعرف السريع على علامات مرض في مجال تغير بشكل ملحوظ نتيجة للمريض من خلال توجيه مسار السليم للعلاج في مرحلة مبكرة من تطور المرض. الأداة والطريقة الموصوفة هي مناسبة للاستخدام مع وكيل أي عمليا المعدية وتوفر للمستخدم التكرار نوع من التحليلات المتعددة جزيء في الوقت ذاته من عبء لوجستية.
Protocol
1. عينة تحلل
- يجب أن تكون العينات في شكل سائل. إذا العينة الصلبة، على سبيل المثال الطعام أو البراز، ينبغي تعليق عينة في وسائل الإعلام السائلة مثل المياه أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- مزيج 500 ميكروليتر من العينة مع 500 ميكرولتر من ملح حامض الثيونيك جوانيداين 6M (درجة الحموضة 6.5) في أنبوب 1.5 مل.
- خفض لمبة لماصة الاستخراج، وطرد الهواء المحيط.
- سحب كامل عينة 1 مل في ماصة الاستخراج، وأكثر من المواد الماصة، من خلال السماح لمبة لتوسيع ببطء.
- عكس أداة استخراج مثل تلك المواد الماصة الخرز واستنزاف العينة إلى لمبة.
- طحن حبات المواد الماصة مع العينة في البصلة والحرص على عدم طرد عينة من ماصة الاستخراج.
2. النووي استخراج حمض (الشكل 1، لوحة أ)
- عكس ماصة استخراج (فتح الهابط) وطرد العينة في أنبوب الأصلي 1.5 مل. <لى> سحب كامل عينة 1 مل في ماصة الاستخراج، ويمر عبر المواد الماصة، بمعدل معتدل، والحرص للحفاظ على المواد الماصة في عنق ماصة الاستخراج.
- طرد العينة بأكملها في أنبوب 1.5 مل بالضغط على لمبة.
- كرر الخطوات من 2.2 و 2.3، ويمر العينة على مدى أربع مرات أكثر المواد الماصة للما مجموعه 5 تمريرات.
- بعد مرور 5 على المواد الماصة، وطرد كامل عينة 1 مل إلى 4mL من البروتين العازلة الاستخراج (في أنبوب 15 مليلتر مخروطي الشكل)، أغلق أنبوب، ويوضع جانبا لاستخدامها لاحقا.
- غسل الأحماض النووية المعزولة عن طريق تمرير 1 مل من الايثانول 95٪ على مدى ثلاث مرات المواد الماصة، وإعادة الايثانول إلى أنبوب الأصلي عند مرور نهائي.
- كرر الخطوة 2.6 باستخدام 2 1 مل، 95٪ غسيل الايثانول.
- ضغط والافراج عن لمبة لمدة 5 دقائق، ويمر الهواء المحيط في جميع أنحاء ماصة استخراج لتجفيف الأحماض النووية / سرير المواد الماصة. مسح الايثانول المتبقية من غيض من يو ماصة استخلاصغناء Kimwipe.
- استعادة الأحماض النووية عن طريق تمرير 250 ميكرولتر من تريس 10 ملم (6.8 درجة الحموضة) على مدى خمس مرات المواد الماصة. ويمكن الاستعاضة عن تريس العازلة من قبل أي حل آخر مائي مناسب مثل برنامج تلفزيوني. الحل الناتج يحتوي على الأحماض المستخرجة النووية.
3. استخراج البروتين (الشكل 1، لوحة ب)
- خلط العينة وأنبوب بروتين العازلة الاستخراج من الخطوة 2.5 بواسطة انقلاب وتمرير ما يقرب من 2-3 ملليلتر من هذه العينة 5 مل عبر المواد الماصة للماصة استخراج جديد.
- طرد العينة بأكملها في أنبوب مخروطي الشكل نفسه 15mL الحرص للحفاظ على المواد الماصة في عنق ماصة الاستخراج.
- كرر الخطوات من 3.1 و 3.2، ويمر على عينة على مدى 15 مرة سبخة.
- غسل المواد الماصة وبروتين محدد عن طريق تمرير 1 مل من الايثانول 95٪ فوق السرير المواد الماصة ثلاث مرات، وطرد من الايثانول إلى أنبوب انها الأصلي.
- كرر الخطوة 3.4 باستخدام 2 1 مل، 95٪ غسيل الايثانول.
- ضغط والافراج عن لمبة لمدة 5 دقائق، ويمر الهواء المحيط في جميع أنحاء ماصة استخراج لتجفيف بروتين / سرير المواد الماصة. مسح الايثانول المتبقية من غيض من ماصة استخراج باستخدام kimwipe.
- استعادة بروتين عن طريق تمرير 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على مدى خمس مرات المواد الماصة. ويمكن استبدال العازلة في برنامج تلفزيوني من قبل أي حل آخر مائي مناسب مثل تريس 10 ملم (6.8 درجة الحموضة). الحل الناتج يحتوي على البروتين من العينة.
الشكل 1.
الشكل 2.
الشكل 3.
الشكل 4.
الشكل 5.
Representative Results
حمض النووي العزلة: الأحماض النووية المعزولة هي PCR amplifiable وخالية من التلوث من البروتين.
مثال 1: الأحماض النووية المستردة هي مناسبة للاستخدام في التطبيقات المستندة إلى PCR. على سبيل المثال، ويبين الشكل 2 التضخيم من الجينات توكسين شيغا المرتبطة E. Enterohemorrhagic O157 كولاي: H7 سلالة مؤسسة كهرباء لبنان-933 (آي تي سي سي # 35150) من إجراء استخراج الحمض النووي / بروتين باستخدام ماصة الاستخراج. تم العثور على جينات توكسين شيغا STX 1 و 2 على STX عاثية امدا مثل المعتدلة وعاثية معيبة في E. Enterohemorrhagic هذه وغيرها من سلالات بكتيريا تحت سيطرة المروج R ف 5 6 7 8. تفعيل استجابة SOS في E. القولونية يؤدي إلى طليعة العاثية الاستقراء و / أو إنتاج السم 9. لقد استخدمت لدينا نسخة معدلة من فحص PCR المضاعفة بواسطة فنغ وآخرون. 1من 1 إلى التعرف على الجينات (1) وSTX STX 2 في كل من الثقافة وعينات من مياه الصرف الصحي ارتفعت. حارات A و B في الشكل 2 تظهر نتائج تضخيم PCR لعينة ثقافة غير المجهزة (حارة A) وعينة ثقافة المجهزة (الصف B). هذه النتائج هي معنى مطابقة تقريبا ليست هناك خسارة من الدقة في الأحماض النووية المجهزة أو معزولة. نحن تضخيم المقبل مياه الصرف الصحي الخام ارتفعت (حارة D) أو الأحماض النووية المعزولة من مياه الصرف الصحي ارتفعت (حارات E & F). هذه المعطيات تشير إلى أن الأحماض النووية معزولة أدت إلى مزيد من التضخيم مقابل الأحماض النووية غير المعزولة من عينات مياه الصرف الصحي ارتفعت. نستنتج إذن أن أزيلت إما مثبطات PCR بطبيعة الحال وجدت في مياه الصرف الصحي على العزلة أو التي كانت تتركز الأحماض النووية على العزلة. مزيج من هذه الفرضيات اثنين هو ممكن أيضا.
تم استخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية القادمة لإظهار أن الأحماض النووية المعزولة كانت حرة نسبيا سبروتين و تلوث. ويبين الشكل 3 أطياف الأشعة فوق البنفسجية من اثنين من E. القولونية O157: H7 حامض النووي الاستخراج، والعزلة وصفها بأنها وباء العزلة، بالمقارنة مع طيف تطبيع للثقافة البكتيرية، وصفت قبل العزلة. أطياف الأشعة فوق البنفسجية من الأحماض النووية المعزولة تمثل أطياف من الأحماض النووية محض، وجود نسبة محسوبة من الامتصاصية بين 260 نانومتر و 280 نانومتر تقترب من 1.8 10. هذه البيانات تظهر أن هناك القليل جدا من البروتين في تلويث جزء الحمض النووي استردادها باستخدام تقنية وصفها.
عزل بروتين: بروتين تعافى من التجربة النووية العزلة حامض / بروتين غير متفاعل مناعيا ومتطابقة electrophoretically على بروتين نقي.
مثال 2: تم تطبيق جزء من البروتين المعزولة إلى E. RapidChek القولونية O157 فحص تدفق الوحشي شرائط (SDIX، وشركة). ضوابط تظهر هوية إيجابية في جميع العينات التي تؤوي E. كولاي O157، مع أو من دون STX الاستقراء (الشكل 4، والممرات وباء وجيم، على التوالي). البيانات في الشكل (4) كما تظهر نتائج إيجابية لتلك العينات ايواء E. القولونية O157 التي تم تجهيزها لالأحماض النووية والبروتين ثم باستخدام ماصة الاستخراج. هذه المعطيات تشير إلى أن بروتين معزولة عن بعضها العينة متفاعل مناعيا وبالتالي التسبب ردا ايجابيا.
تم تنفيذ PCR التضخيم (كما هو موضح في مثال 1) في عينات من البروتين لإظهار أن جزء من البروتين المعزولة كان خاليا من تلويث الأحماض النووية. وكانت نتائج هذه التجارب جميعها سلبية من قبل الكهربائي للهلام. وبالتالي، فإننا نستنتج أن تم فصل محتوى البروتين من العينة من تلويث الأحماض النووية. هذه النتائج، التي اتخذت في كامل مع تلك التي وصفها لهذا المعرض الحمض النووي خطوة العزلة التي يتم عزل الأحماض النووية والبروتين في خطوات تجزئة منفصلة.
تي "> مثال 3:. البروتين المعزول هو مناسبة لالكهربائي 10 الشكل 5 يصور coomassie ملطخة 8٪ هلام الأكريلاميد محملة جيش صرب البوسنة (الشكل 5، والممرات C &) وجيش صرب البوسنة المعزولة من الفصيلة جوانيداين 6M باستخدام ماصة استخراج وما يرتبط بها من البروتوكول. والتنقل الكهربي للبروتين معزولة لانه مطابق للعينات مراقبة. نستنتج مما تقدم أن عملية الاستخراج لا يغير من هيكل التساهمية من البروتين المعزولة.
الشكل 1، لوحة ج: تصوير نموذجي حامض النووي إجراءات استخراج يتم خلط العينة مع ثيوسيانات جوانيداين 6M في أنبوب عينة ومرت أكثر من خمس مرات المواد الماصة. بعد مرور آخر، يضاف إلى عينة من البروتين العازلة الاستخراج. تغسل الأحماض والمواد الماصة متجهة النووي مرتين مع الايثانول. العينة ثم الهواء درييد ومزال من المواد الماصة.
الشكل 1، لوحة (ب): تصوير لإجراء استخراج بروتين نموذجي عينة مختلطة مع عازلة عزل بروتين من الخطوة 1، الشكل 1، لوحة يتم تمرير عبر المواد الماصة للماصة استخراج 2 15 مرة. ما تبقى من إجراءات لانه مطابق للبروتوكول استخراج حمض النووي.
الشكل 2: صورة سلبية لبروميد إيثيديوم هلام الاغاروز الملون أجري المضاعفة الجينات توكسين 1 و 2 شيغا تجربة التضخيم باستخدام عينات من ثقافة (الممرات A و B) أو عينات من مياه الصرف الصحي الخام ارتفعت مع إ. O157 كولاي: H7 (الممرات D، E و F). واما العينات وأضاف مباشرة إلى أنبوب رد فعل PCR (الممرات A و D)، أو عينات تم معالجتها باستخدام بروسس العزلةتم إضافة الصورة والأحماض النووية لاستخراج أنبوب رد فعل PCR (عينات B، E و F). بروتوكول PCR هو تعديل واحد التي وصفها فنغ وآخرون 11. تعديل لدينا استهدفت فقط تلك تضخيم من قبل STX 1 (الشريط السفلي) وSTX 2 (الشريط العلوي) أزواج التمهيدي، والتسرب جميع أزواج التمهيدي الأخرى. ممر C هو سلم 1KB من BioRad.
الشكل 3: نتائج التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية من E. O157 كولاي: H7 الأحماض النووية معزولة باستخدام ماصة استخراج ذكرت وصفت والأحماض النووية معزولة عزلة أ و ب العزلة. تم اختباره أيضا الطيف للأشعة فوق البنفسجية من العينة قبل استخراج الحمض النووي ويسمى ما قبل العزلة. وقد تم الحصول على الأطياف باستخدام U3010 هيتاشي الطيف وما يرتبط بها من حزمة البرامج.
الشكل 4: صور لون من شرائط الاختبار RapidChek تم عزل محتوى البروتين من العينات المستخدمة في الشكل 2 باستخدام ماصة استخراج واختبار التفاعلات المناعية بواسطة فحص تدفق الوحشي. حارات AC هي الضوابط غير المجهزة، وهذا هو، وأضيف ثقافة الخلية إلى شريط الاختبار دون استخلاص الحامض النووي أو البروتين. (أ) هو ممر E. كولاي BL21 DE3 pLysS كعنصر تحكم سلبي، والممرات وباء وجيم هاء المعرض O157 كولاي: H7 التي كانت غير المعالجة (B)، أو تعامل مع C mitomycin لمدة 4 ساعات (C). من خلال مد خطوط H تظهر نتائج مضيفا ان البروتين المستخرج من شرائط اختبار تدفق الوحشي. تم بحث الممرات D و E باستخدام بروتين مستخلص من E. كولاي BL21 DE3 pLysS إما دون (D) أو مع العلاج C mitomycin (E) كما الضوابط السلبية. حارات FH إظهار النتائج عند استخراج البروتين من E. O157 القولونية: تم استخدام H7. تم استخراج بروتين من دون علاج (F)، أو في الفترة من 2 ساعة (G) أو 4 ساعة (H) Mitomycin الثقافات C المعالجة.نتائج إيجابية إنتاج خط مزدوج أحمر.
تم عزل صورة لالملون Coomassie SDS-PAGE جيش صرب البوسنة من حل باستخدام ماصة استخراج والبروتوكولات وصف: الرقم 5. حارات A و C هي الممرات السيطرة على 250 ميكروغرام / مل و 500 ميكروغرام / مل على التوالي. حارات B و D تصور BSA تعافى من الحلول التي تحتوي على تركيزات نفس الضوابط الخاصة بكل منها.
Discussion
الأداة، كيمياء وبروتوكول المبينة في هذا التقرير تمثل أول مثال معروف من الكهرباء خالية، نظام استخراج متعددة جزيء التي يمكن استخدامها في مجال التطبيقات المستندة إلى نقطة من الرعاية، و. ويمكن تطبيق هذين النوعين جزيء إلى عدد من المتلقين للأجهزة التشخيص أو التحليلية. على سبيل المثال، الأحماض النووية المعزولة هي من نوعية PCR (الشكل 2 و 3) في حين أن البروتين مكون من العينة هو متفاعل مناعيا (الشكل 4). ويمكن الاستفادة من هذا النظام استخراج في مناطق محدودة التقشف أو مورد في العالم خفض كبير في عبء المرض على السكان الذين يعيشون هناك. ويمكن هذا النظام استخلاص تساعد أيضا في برامج مراقبة الأمراض في جميع أنحاء العالم من خلال توفير وسيلة قوية وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لتجهيز العينات في مواقع التقشف أو بعيد.
أحد الجوانب الهامة لطريقة استخراج المبينة أعلاه هو أنيمكن تعديله من قبل المستخدم. على سبيل المثال، في الحالات التي يكون فيها حجم العينة أكبر أو أقل من 500 μLs الأولية (الخطوة 1.2)، يمكن للمستخدم ضبط كميات من المواد الكاشفة وفقا لذلك. وهذا هو، على نسبة حجمية من الكواشف لحجم العينة يجب أن تبقى ثابتة بينما يمكن تغيير وحدات التخزين مطلقة. أيضا، ويمكن أيضا إدخال تعديلات على عدد من الممرات خلال ماصة يتم وفقا لتقدير المستخدم. وعلى سبيل المثال، إذا تم استخدام حجم أكبر عينة، ويمر على عينة أكثر من مرة في أكثر من المواد الماصة المذكورة (الخطوات 2،4 و 3.3) تزيد من احتمال نوع جزيء (الحامض النووي أو البروتين) الاتصال المواد الماصة. وينبغي أن الزيادة في الممرات زيادة كفاءة التقاط حتى يتم التوصل إلى تشبع المواد الماصة.
لقد وجدنا أن أداة استخراج وكيمياء يرتبط بها من بعض القيود، وأهمها هو أن كيمياء استخراج بروتين غير فعالة لاسترداد الغليكوزيلاتي جداالبروتينات. في حال التشخيص المصب يستهدف بروتين الغليكوزيلاتي، وهذا قد لا يكون مثاليا نظام لتحديد الهوية. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال في الحدود العليا والدنيا من الكفاءة سواء لاستخلاص الأحماض النووية أو البروتينات التي يجري تحديدها، والتحسين جار لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة الانتعاش. ومزيد من تطوير أداة تغلب على هذه الفجوات في المعرفة الحالية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقدمت التمويل اللازم لتطوير ماصة في استخراج جزء من قبل البحوث الداخلية ومنح التنمية التي منحت لDRP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine Thiocyanate | TEKnova, Inc. | G4000 | |
| ethanol | Pharmco-AAPER | 11ACS200 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A-4503 |
References
- Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005. Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).
- Pawlowski, D. R. Extraction Pipette. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).
- Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. Method and Device for Isolating a Protein Sample. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).
- Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).
- O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea. Science. 226, 694-696 (1984).
- Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain. Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).
- Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages. DNA Research. 6, 141-143 (1999).
- Ptashne, M. A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , Third Edition ed, Cold Spring Harbor Press. (2004).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
- Feng, P., Monday, S. R. Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes. Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).
