Summary
Un outil et chimiques sont décrits pour séquentiellement isoler des acides nucléiques suivie par les protéines d'un échantillon sans la nécessité de l'électricité. L'outil se compose d'un sorbant lieu au sein d'une pipette de transfert, tandis que les chimies d'isolement sont basées sur des principes d'extraction en phase solide. Les macromolécules isolées peuvent être analysées par des tests immuno-base et basée sur la PCR.
Abstract
Pathogènes traditionnels et émergents, tels que Escherichia coli entérohémorragique (EHEC), Yersinia pestis, ou prion à base de maladies sont une préoccupation importante pour les gouvernements, les industries et professionnels de la santé à travers le monde. Par exemple, EHECs, combinées avec Shigella, sont responsables de la mort d'environ 325 000 enfants chaque année et sont particulièrement répandues dans le monde en développement où le laboratoire basée sur l'identification, commune aux États-Unis, n'est pas disponible 1. Le développement et la distribution de faible coût, sur le terrain, les points de soins des outils pour aider à l'identification rapide et / ou le diagnostic d'agents pathogènes ou des marqueurs de maladies pourrait modifier radicalement progression de la maladie et le pronostic du patient. Nous avons développé un outil pour isoler des acides nucléiques et des protéines à partir d'un échantillon par extraction en phase solide (SPE), sans électricité ni matériel de laboratoire associé 2. Les macromolécules isolées peuvent être utilisés pour diagnosticsis soit dans un laboratoire de l'avant ou à l'aide sur le terrain au point de plates-formes de soins. Surtout, cette méthode fournit pour la comparaison directe d'acides nucléiques et de protéines de données à partir d'un échantillon non-scission, offrant un niveau de confiance par le biais de corroboration de l'analyse génomique et protéomique.
Nos outil isolement utilise la norme industrielle en phase solide pour l'isolement d'acide nucléique, la technologie BOOM, qui isole les acides nucléiques à partir d'une solution de sel chaotropique, généralement isothiocyanate de guanidine, en se liant à base de silice ou des filtres particules 3. CUBRC de chimie exclusive d'extraction en phase solide est utilisé pour purifier la protéine à partir de solutions salines chaotropes, dans ce cas, les déchets ou les flux de-thru suite à l'isolement d'acide nucléique 4.
En emballage bien caractérisé chimies dans une petite plate-forme, simple et peu coûteuse, nous avons généré un système portable pour l'extraction des acides nucléiques et des protéines qui peut être effectuée en vertu d'une variety de conditions. Les acides nucléiques isolés sont stables et peuvent être transportés à un poste où le pouvoir est disponible pour l'amplification PCR alors que la teneur en protéines peuvent être immédiatement analysé par main levée ou d'autres tests basés sur immunologique. L'identification rapide des marqueurs de maladies dans le domaine pourrait modifier sensiblement les résultats du patient en dirigeant le bon déroulement du traitement à un stade précoce de la progression de la maladie. L'outil et la méthode décrite conviennent pour une utilisation avec n'importe quel agent infectieux et offrir à l'utilisateur la redondance des analyses de type multi-macromolécule tout en réduisant leur fardeau logistique.
Protocol
1. Lysis échantillon
- Les échantillons doivent être sous forme liquide. Si l'échantillon est solide, par exemple l'alimentation ou dans les selles, l'échantillon doit être mis en suspension dans un milieu liquide comme l'eau ou du tampon phosphate salin (PBS).
- Mélanger 500 ml de l'échantillon avec 500 uL de thiocyanate de guanidine 6M (pH 6,5) dans un tube de 1,5 ml.
- Enfoncer l'ampoule d'une pipette d'extraction, expulsant l'air ambiant.
- Tirez l'ensemble de 1 ml d'échantillon dans la pipette d'extraction, sur le matériau absorbant, en permettant l'ampoule à s'élargir lentement.
- Inverser l'outil d'extraction tels que les perles absorbantes et de vidange d'échantillon dans l'ampoule.
- Broyer les perles absorbantes avec l'échantillon dans le bulbe en faisant attention de ne pas expulser l'échantillon de la pipette d'extraction.
2. Extraction des acides nucléiques (figure 1, partie A)
- Inverser la pipette d'extraction (l'ouverture à la baisse) et d'expulser l'échantillon dans le tube de 1,5 ml d'origine. <li> Tirez l'ensemble de 1 ml d'échantillon dans la pipette d'extraction, passant au-dessus du sorbant, à un rythme modéré, en veillant à garder le sorbant dans le cou de la pipette d'extraction.
- Expulser l'ensemble de l'échantillon dans le tube de 1,5 ml en appuyant sur l'ampoule.
- Répétez les étapes 2.2 et 2.3, en passant de l'échantillon au cours des quatre fois plus absorbants pour un total de 5 passes.
- Après le cinquième passage sur le sorbant, expulser l'ensemble 1 ml d'échantillon dans 4 ml de tampon d'extraction de protéines (dans un tube conique de 15 mL), fermer le tube, et mettre de côté pour une utilisation ultérieure.
- Laver les acides nucléiques isolés en faisant passer 1 ml d'éthanol à 95% au cours des trois absorbants fois, en revenant de l'éthanol à son tube d'origine lors du passage final.
- Répétez l'étape 2.6 en utilisant un second 1 mL, lavage à l'éthanol 95%.
- Appuyez sur et relâchez la poire pendant 5 minutes, en passant de l'air ambiant à travers la pipette d'extraction pour sécher les acides nucléiques ou lit de sorbant. Essuyer éthanol résiduelle de la pointe de l'u d'extraction de pipettechanter une Kimwipe.
- Récupérer les acides nucléiques en passant 250 uL de Tris 10 mM (pH 6,8) au cours des cinq absorbants fois. Le tampon Tris peut être remplacé par n'importe quel autre solution aqueuse appropriée telle que du PBS. La solution qui en résulte contient des acides nucléiques extraits.
3. Extraction des protéines (figure 1, partie B)
- Mélanger l'échantillon et le tube de tampon d'extraction des protéines de l'étape 2.5 par l'inversion et de passer environ deux à trois millilitres de cet échantillon 5 ml sur le sorbant d'une pipette nouvelle extraction.
- Expulser l'ensemble de l'échantillon dans le même tube conique de 15 ml en veillant à garder le sorbant dans le cou de la pipette d'extraction.
- Répétez les étapes 3.1 et 3.2, en passant de l'échantillon au cours des 15 absorbants fois.
- Laver le sorbant et la protéine liée par passage 1 ml d'éthanol à 95% sur le lit de sorbant trois fois, l'éjection d'éthanol dans son tube d'origine.
- Répétez l'étape 3.4 en utilisant un second 1 mL, lavage à l'éthanol 95%.
- Appuyez sur et relâchez la poire pendant 5 minutes, en passant de l'air ambiant à travers la pipette d'extraction pour sécher la protéine / lit de sorbant. Essuyer éthanol résiduelle de la pointe de la pipette d'extraction en utilisant un Kimwipe.
- Récupérer la protéine en passant 250 l de PBS au cours des cinq absorbants fois. Le tampon peut être remplacé par n'importe quel autre solution aqueuse appropriée telle que 10 mM de Tris (pH 6,8). La solution résultante contient de la teneur en protéines de l'échantillon.
Figure 1.
Figure 2.
Figure 3.
Figure 4.
Figure 5.
Representative Results
Isolement d'acide nucléique: des acides nucléiques isolés sont PCR amplifiable et libre de toute contamination de protéines.
Exemple 1: Les acides nucléiques sont récupérés peut être utilisé dans des applications basées sur la PCR. Par exemple, la figure 2 montre l'amplification de gènes de la toxine shiga associés à entérohémorragique E. coli O157: H7 EDL-933 (ATCC # 35150) à partir d'une procédure d'extraction d'acide / protéine nucléique à l'aide de la pipette d'extraction. Les gènes de la toxine shiga stx 1 et stx 2 sont disponibles sur tempérée lambda-comme les bactériophages et défectueux dans ce bactériophage et autres entérohémorragique E. souches de E. sous le contrôle du promoteur P R 5 6 7 8. L'activation de la réponse SOS dans E. coli conduit à prophage induction et / ou de la toxine de production 9. Nous avons utilisé une version modifiée de l'essai multiplex PCR par Feng et al. 11 pour déterminer le stx 1 et stx 2 gènes à la fois dans la culture et des échantillons d'eaux usées à pointes. Colonnes A et B dans la figure 2 montrent les résultats d'une amplification par PCR d'un échantillon de culture non transformées (voie A) et un échantillon de culture traitée (voie B). Ces résultats sont pratiquement identiques sens il n'ya pas de perte de fidélité dans les acides nucléiques isolée ou transformés. Nous avons ensuite amplifié à pointes eaux d'égout brutes (colonne D) ou des acides nucléiques isolés à partir des eaux usées à pointes (voies E & F). Ces données indiquent que les acides nucléiques isolés abouti à une plus grande amplification par rapport aux acides nucléiques isolés non à partir d'échantillons d'eaux usées à pointes. Nous concluons donc que soit inhibiteurs de la PCR naturellement présents dans les eaux usées ont été enlevés lors de l'isolement ou que les acides nucléiques ont été concentrées sur l'isolement. Une combinaison de ces deux hypothèses est également possible.
Spectroscopie dans l'ultraviolet a ensuite été utilisé pour montrer que les acides nucléiques isolés étaient relativement libres oprotéines f contamination. La figure 3 montre les spectres UV de deux E. coli O157: H7 nucléique extractions acide, l'isolement marqué a et b isolement, par rapport au spectre normalisé de la culture bactérienne, marqué pré-isolement. Le spectre UV des acides nucléiques isolés ressemble les spectres de purs des acides nucléiques, ayant un rapport calculé de l'absorbance entre 260 nm et 280 nm qui approchent 1,8 10. Ces données montrent qu'il ya très peu de protéine contaminante dans la fraction d'acide nucléique récupéré en utilisant la technique décrite.
L'isolement des protéines: les protéines récupérées de l'expérience d'isolement d'acide / protéine nucléique est immunoréactif et électrophorèse identique à la protéine pure.
Exemple 2: La fraction de protéine isolée a été appliqué à l'E. RapidChek coli O157 latérales des bandes d'essai d'écoulement (SDIX, Inc.) Contrôles montrent une identification positive dans tous les échantillons hébergeant E. coli O157, avec ou sans induction STX (Figure 4, les voies B et C, respectivement). Les données de la figure 4 montrent aussi des résultats positifs pour les échantillons hébergeant E. coli O157 qui ont été traitées pour les acides nucléiques et de protéines, puis à l'aide de la pipette d'extraction. Ces données montrent que la protéine isolée à partir de chaque échantillon est immunoréactif déclenchant ainsi une réponse positive.
Amplification par PCR (tel que décrit dans l'exemple 1) a été effectuée sur les échantillons de protéines pour montrer que la fraction protéique isolée était dépourvue d'acides nucléiques contaminants. Les résultats de ces expériences étaient tous négatifs par électrophorèse sur gel. Ainsi, nous concluons que la teneur en protéines de l'échantillon a été séparé de contaminer les acides nucléiques. Ces résultats, pris dans son ensemble à celles décrites pour le spectacle étape d'acide nucléique isolée que les acides nucléiques et en protéines sont isolés dans différentes étapes de fractionnement.
t "> Exemple 3:. La protéine isolée est adapté pour l'électrophorèse 10 Figure 5 représente une coomassie colorée gel d'acrylamide 8% chargé avec de la BSA (Figure 5, les voies A et C) et de la BSA isolé de 6M isothiocyanate de guanidine en utilisant l'extraction et la pipette associé protocole. La mobilité électrophorétique de la protéine isolée est identique à celle des échantillons de contrôle. Nous concluons donc que le processus d'extraction ne modifie pas la structure covalente de la protéine isolée.
Figure 1, Groupe A: Représentation d'une procédure de type extraction d'acide nucléique L'échantillon est mélangé avec 6M de thiocyanate de guanidine dans le tube d'échantillon et passé au cours des cinq absorbants fois.. Après le dernier passage, l'échantillon est ajouté à la mémoire tampon d'extraction de protéines. Les acides nucléiques sorbant et lié sont lavées deux fois avec de l'éthanol. L'échantillon est alors l'air dRied et éluée à partir du sorbant.
Figure 1, Groupe B: Représentation d'une procédure d'extraction des protéines typiques L'échantillon mélangé avec du tampon de l'isolement des protéines à partir de l'étape 1, Figure 1, partie A est passé sur le sorbant d'une pipette seconde extraction 15 fois.. Le reste de la procédure est identique à celle du protocole d'extraction d'acide nucléique.
Figure 2:. Image négative d'un bromure d'éthidium gel d'agarose coloré multiplexé toxine de Shiga 1 et 2 l'expérience d'amplification génique a été réalisée en utilisant des échantillons de culture (voies A et B) ou des échantillons d'eaux usées brutes dopés avec E. coli O157: H7 (voies D, E et F). Les échantillons ont été soit directement ajoutés à un tube de réaction PCR (voies A et D) ou les échantillons ont été traités à l'aide des procès d'isolements et les acides nucléiques extraits ont été ajoutés au tube de réaction PCR (échantillons B, E et F). Le protocole de PCR est une modification de celle qui est décrite par Feng et al 11. Notre modification ciblée seulement ceux amplifié par le stx 1 (bande inférieure) et stx 2 (bande supérieure) paires d'amorces, l'abandon de toutes les paires d'amorces d'autres. Lane C est l'échelle 1Ko de BioRad.
Figure 3: résultats de spectroscopie UV de E. coli O157: H7 acides nucléiques isolés à l'aide de la pipette d'extraction ont rapporté les acides nucléiques isolés sont marqués d'isolement b isolement a et.. Le spectre UV de l'échantillon a également été testée avant l'extraction des acides nucléiques et est étiqueté pré-isolement. Les spectres ont été obtenus en utilisant un spectrophotomètre Hitachi U3010 et un logiciel associé.
Figure 4:. Photo couleur de bandelettes de test RapidChek La teneur en protéines des échantillons utilisés dans la figure 2 a été isolé à l'aide de la pipette d'extraction et testés pour l'immuno-réactivité par un test d'écoulement latéral. Lanes AC sont des contrôles non traités, qui est, de culture cellulaire a été ajouté à la bandelette de test sans acide nucléique ou l'extraction des protéines. Lane A est E. coli BL21 pLysS de3 comme un contrôle négatif, Lanes B et C montrent E. coli O157: H7 qui a été traitée (B), ou traitées à la mitomycine C pendant 4 heures (C). Lanes D à H montrent les résultats de l'ajout de la protéine extraite des bandes latérales des essais de débit. Lanes D et E ont été sondés à l'aide extrait de protéine de E. coli BL21 DE3 pLysS soit sans (D) ou à la mitomycine C traitement (E) comme témoins négatifs. Lanes FH montrent les résultats lors de l'extraction des protéines de E. coli O157: H7 a été utilisé. Protéine a été extrait de non traitée (F), ou de 2 heures (G) ou 4 heures (H) mitomycine C cultures traitées.Les résultats positifs de produire une double ligne rouge.
Figure 5:. Photographie d'un teint de Coomassie SDS-PAGE BSA a été isolé de la solution en utilisant la pipette d'extraction et de protocoles décrits. Colonnes A et C sont des files de contrôle de 250 pg / mL et 500 pg / mL, respectivement. Colonnes B et D représentent BSA récupéré à partir de solutions contenant les mêmes concentrations que leurs témoins respectifs.
Discussion
Les outils, chimies et le protocole décrit dans ce rapport représentent le premier exemple connu d'une électricité gratuite, système d'extraction multi-macromolécule qui peut être utilisé dans le terrain, les points de soins applications. Les deux types de macromolécules peut être appliqué à un certain nombre de dispositifs de diagnostic en aval ou analytique. Par exemple, les acides nucléiques isolés sont de qualité PCR (figures 2 et 3) tandis que le composant protéine de l'échantillon est immunoréactif (figure 4). L'utilisation de ce système d'extraction ou d'une ressource dans austères des zones limitées du monde pourrait réduire considérablement le fardeau de la maladie sur les populations qui y vivent. Ce système d'extraction pourrait aussi aider dans les programmes de surveillance des maladies à travers le monde en fournissant une méthode robuste et rapide et rentable pour le traitement des échantillons dans des endroits austères ou à distance.
Un aspect important de la méthode d'extraction décrite ci-dessus, c'est queelle peut être modifiée par l'utilisateur. Par exemple, dans les cas où la taille de l'échantillon est plus ou moins que les 500 premiers μLs (étape 1.2), l'utilisateur peut ajuster les volumes des réactifs en conséquence. Autrement dit, le rapport volumétrique des réactifs à la taille de l'échantillon doit rester constante, tandis que les volumes en chiffres absolus peuvent être modifiés. En outre, les ajustements du nombre de passages sur le sorbant peut également être faite à la discrétion de l'utilisateur. Par exemple, si un plus grand volume d'échantillon est utilisé, en passant de l'échantillon au cours des temps plus absorbants que celles énumérées (étapes 2.4 et 3.3) va augmenter la probabilité du type macromolécule (acide nucléique ou protéine) en contact avec le sorbant. L'augmentation des passages devrait augmenter l'efficacité de captage jusqu'à saturation sorbant est atteint.
Nous avons constaté que l'outil d'extraction et de la chimie associés ont quelques limitations, dont la plus importante de ce qui est que la chimie d'extraction des protéines est inefficace pour la récupération de fortement glycosyléeprotéines. Dans le cas où le diagnostic aval cible une protéine glycosylée, ce système peut ne pas être idéal pour l'identification. En outre, les limites supérieures et inférieures de l'efficacité d'extraction soit pour les acides nucléiques ou des protéines sont encore à déterminer, et d'optimisation est en cours afin de maximiser l'efficacité de récupération. Poursuite de l'élaboration de l'outil permettra de surmonter ces lacunes dans les connaissances actuelles.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Financement pour le développement de la pipette d'extraction a été fourni en partie par une recherche interne et de subvention de développement accordé à DRP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine Thiocyanate | TEKnova, Inc. | G4000 | |
| ethanol | Pharmco-AAPER | 11ACS200 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A-4503 |
References
- Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005. Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).
- Pawlowski, D. R. Extraction Pipette. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).
- Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. Method and Device for Isolating a Protein Sample. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).
- Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).
- O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea. Science. 226, 694-696 (1984).
- Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain. Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).
- Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages. DNA Research. 6, 141-143 (1999).
- Ptashne, M. A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , Third Edition ed, Cold Spring Harbor Press. (2004).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
- Feng, P., Monday, S. R. Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes. Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).
