Summary
एक उपकरण और chemistries के क्रमिक रूप से अलग न्यूक्लिक एसिड बिजली के लिए की आवश्यकता के बिना एक नमूना से प्रोटीन द्वारा पीछा करने के लिए वर्णित हैं. एक हस्तांतरण विंदुक के भीतर आयोजित जबकि अलगाव chemistries और ठोस चरण निष्कर्षण सिद्धांतों पर आधारित हैं sorbent उपकरण होते हैं. अलग अणुओं इम्युनो आधारित और पीसीआर आधारित assays द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है.
Protocol
1. नमूना lysis
- नमूने तरल रूप में होना चाहिए. अगर नमूना ठोस है, उदाहरण के भोजन या मल के लिए नमूना पानी या फॉस्फेट के रूप में तरल मीडिया में निलंबित किया जाना चाहिए खारा (पीबीएस) के बफर.
- 6M एक 1.5 एमएल ट्यूब में Guanidine Thiocyanate (6.5 पीएच) के 500 μL के साथ नमूना के 500 μL मिलाएं.
- एक निष्कर्षण विंदुक के बल्ब दबाना, परिवेशी वायु को खदेड़ने.
- निष्कर्षण पिपेट में पूरे 1 एमएल नमूना खींचो, sorbent सामग्री से अधिक के बल्ब धीरे धीरे विस्तार करने के लिए अनुमति देकर,.
- निष्कर्षण उपकरण ऐसे पलटना कि sorbent मोती और बल्ब में नमूना नाली.
- सावधान किया जा रहा निष्कर्षण विंदुक का नमूना नहीं निष्कासित बल्ब में नमूना के साथ sorbent मोती पीस.
2. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण (चित्रा 1, पैनल)
- निष्कर्षण विंदुक नीचे खोलने पलटना और मूल 1.5 एमएल ट्यूब में नमूना निष्कासित. <ली> संपूर्ण 1 एमएल नमूना के निष्कर्षण पिपेट में खींचो, sorbent पर गुजर, एक उदारवादी दर पर, निष्कर्षण पिपेट की गर्दन में sorbent रखने के लिए सावधान किया जा रहा है.
- 1.5 एमएल ट्यूब में बल्ब निराशाजनक द्वारा पूरे नमूना निष्कासित.
- 2.2 और 2.3 चरणों को दोहराएँ, sorbent चार गुना अधिक से अधिक 5 पास के एक कुल के लिए नमूना गुजर.
- Sorbent पांचवें ओवर पास के बाद, 4mL प्रोटीन निष्कर्षण बफर (एक 15 एमएल चोटीदार ट्यूब में) के रूप में पूरे 1 एमएल नमूना के निष्कासित, ट्यूब बंद करने के लिए, और बाद में उपयोग के लिए अलग सेट.
- Sorbent तीन बार से अधिक 95% इथेनॉल के 1 एमएल गुजर, उसके मूल ट्यूब को अंतिम यात्रा पर इथेनॉल लौटने से अलग nucleic एसिड धो लें.
- 2.6 कदम एक दूसरे के 1 एमएल, 95% इथेनॉल धोने का उपयोग कर दोहराएँ.
- प्रेस और 5 मिनट के लिए बल्ब जारी, निष्कर्षण विंदुक भर में परिवेशी वायु पारित करने के लिए न्यूक्लिक एसिड / sorbent बिस्तर सूखी. निष्कर्षण विंदुक यू के टिप से अवशिष्ट इथेनॉल पोछोKimwipe गाना.
- Sorbent पांच बार से अधिक 10 मिमी Tris (6.8 पीएच) के 250 μL गुजर द्वारा nucleic एसिड पुनर्प्राप्त. Tris बफर पीबीएस के रूप में किसी भी अन्य उपयुक्त जलीय समाधान के द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है. परिणामस्वरूप समाधान निकाले न्यूक्लिक एसिड होता है.
3. प्रोटीन निष्कर्षण (चित्रा 1, पैनल बी)
- मिश्रण और उलट द्वारा 2.5 कदम से प्रोटीन निष्कर्षण बफर ट्यूब नमूना और एक नया निकासी विंदुक के sorbent पर लगभग दो से तीन इस 5 एमएल नमूना मिलीलीटर पास.
- वही 15ml चोटीदार ट्यूब के निष्कर्षण पिपेट की गर्दन में sorbent रखने सावधान किया जा रहा में पूरे नमूना निष्कासित.
- 3.1 और 3.2 चरणों को दोहराएँ, sorbent 15 बार से अधिक नमूना गुजर रहा है.
- Sorbent बिस्तर से अधिक 95% इथेनॉल के 1 एमएल तीन बार, यह मूल ट्यूब में बाहर खदेड़ना इथेनॉल से गुजर रहा sorbent और बाध्य प्रोटीन धो लें.
- 3.4 कदम एक दूसरे के 1 एमएल, 95% इथेनॉल धोने का उपयोग कर दोहराएँ.
- प्रेस और 5 मिनट के लिए बल्ब जारी, निष्कर्षण विंदुक भर में परिवेशी वायु पारित करने के लिए प्रोटीन / sorbent बिस्तर सूखा. अवशिष्ट इथेनॉल निष्कर्षण एक kimwipe का उपयोग पिपेट की टिप से साफ कर लें.
- पीबीएस की sorbent पांच बार से अधिक 250 μL गुजर द्वारा प्रोटीन पुनर्प्राप्त. पीबीएस बफर 10 मिमी Tris (6.8 पीएच) के रूप में किसी भी अन्य उपयुक्त जलीय समाधान के द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है. परिणामस्वरूप समाधान नमूने के प्रोटीन सामग्री है.
आकृति 1.
चित्रा 2.
चित्रा 3.
चित्रा 4.
चित्रा 5.
Representative Results
न्यूक्लिक एसिड अलगाव: पृथक न्यूक्लिक एसिड से पीसीआर amplifiable और प्रोटीन संदूषण से मुक्त हैं.
उदाहरण 1: बरामद nucleic एसिड पीसीआर आधारित अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए उपयुक्त हैं. उदाहरण के लिए, चित्रा 2 शिगा विष Enterohemorrhagic ई. के साथ जुड़े जीन प्रवर्धन से पता चलता है कोलाई O157: H7 edl का एक nucleic एसिड प्रोटीन निष्कर्षण / प्रक्रिया का उपयोग निष्कर्षण विंदुक से तनाव (933 ATCC 35,150). Shiga विष 1 STX और 2 STX जीन शीतोष्ण जीवाणुभोजी लैम्ब्डा की तरह और दोषपूर्ण जीवाणुभोजी पर इस और अन्य Enterohemorrhagic ई. में पाया जाता है पी आर 5 7 8 6 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत कोलाई उपभेदों. ई. में मुसीबत का इशारा प्रतिक्रिया का सक्रियण कोली शामिल है और / या विष prophage 9 उत्पादन होता है. हम फेंग एट अल द्वारा मल्टिप्लेक्स पीसीआर परख का एक संशोधित संस्करण का उपयोग किया है 1.1 1 STX और दोनों संस्कृति और बालीदार मल के नमूने में STX 2 जीन की पहचान. लेन एक और चित्रा 2 में बी एक unprocessed संस्कृति के नमूने (लेन ए) की एक पीसीआर प्रवर्धन और एक संसाधित संस्कृति के नमूने (लेन बी) के परिणाम दिखाने के. ये परिणाम लगभग समान अर्थ हैं संसाधित या अलग न्यूक्लिक एसिड में निष्ठा का कोई नुकसान नहीं है. हम अगले बालीदार कच्चे (लेन डी) मल या बालीदार मल से अलग न्यूक्लिक एसिड (गलियों ई एफ एंड) प्रवर्धित. इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि अलग nucleic एसिड बालीदार मल के नमूने से गैर पृथक न्यूक्लिक एसिड की तुलना में अधिक से अधिक प्रवर्धन के परिणामस्वरूप. इसलिए हम निष्कर्ष है कि या तो पीसीआर स्वाभाविक रूप से मल में पाया inhibitors के अलगाव पर हटा दिया गया है या कि nucleic एसिड अलगाव पर ध्यान केंद्रित किया गया है. इन दो परिकल्पना का एक संयोजन भी संभव है.
पराबैंगनी स्पेक्ट्रोस्कोपी अगले दिखाने के लिए कि अलग nucleic एसिड अपेक्षाकृत मुक्त थे इस्तेमाल किया गया था ओच contaminating के प्रोटीन चित्रा 3 दो ई की यूवी स्पेक्ट्रा से पता चलता है कोलाई O157: H7 न्यूक्लिक एसिड एक्सट्रेक्शन, लेबल अलगाव और अलगाव ख, बैक्टीरिया संस्कृति की सामान्यीकृत स्पेक्ट्रम, पूर्व अलगाव लेबल की तुलना में. पृथक nucleic एसिड की यूवी स्पेक्ट्रा शुद्ध nucleic एसिड की स्पेक्ट्रा जैसा दिखता है, 260 एनएम और 280 10 1.8 आ एनएम के बीच एक absorbance के अनुपात की गणना. ये आंकड़े बताते हैं कि वहाँ बहुत कम न्यूक्लिक एसिड अंश में वर्णित तकनीक का उपयोग कर ठीक contaminating के प्रोटीन है.
प्रोटीन अलगाव: न्यूक्लिक एसिड प्रोटीन अलगाव / प्रयोग से बरामद प्रोटीन immunoreactive है और electrophoretically शुद्ध प्रोटीन के समान है.
उदाहरण 2: अलग प्रोटीन अंश RapidChek ई. के लिए आवेदन किया था कोलाई O157 पार्श्व प्रवाह परख स्ट्रिप्स (SDIX, Inc). नियंत्रण सभी ई. शरण नमूनों में एक सकारात्मक पहचान कोलाई O157, के साथ या STX प्रेरण (चित्रा 4, बी और सी गलियों, क्रमशः) के बिना. चित्रा 4 में डेटा भी उन ई. शरण नमूने के लिए सकारात्मक परिणाम दिखाने O157 कोलाई कि न्यूक्लिक एसिड और फिर प्रोटीन निष्कर्षण पिपेट का उपयोग के लिए प्रोसेस किया गया. ये आंकड़े बताते हैं कि प्रत्येक नमूने से अलग प्रोटीन immunoreactive इस तरह एक सकारात्मक प्रतिक्रिया ट्रिगर.
पीसीआर प्रवर्धन (के रूप में उदाहरण 1 में वर्णित) प्रोटीन के नमूने पर प्रदर्शन किया गया था दिखाने के लिए कि अलग प्रोटीन अंश nucleic एसिड contaminating के से रहित था. इन प्रयोगों के परिणाम जेल वैद्युतकणसंचलन से सभी नकारात्मक रहे थे. इस प्रकार, हम निष्कर्ष है कि नमूने के प्रोटीन सामग्री nucleic एसिड contaminating से अलग हो गया था. इन परिणामों, पूरे nucleic एसिड अलगाव कदम बताते हैं कि न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन सामग्री को अलग विभाजन के चरणों में अलग कर रहे हैं के लिए वर्णित उन लोगों के साथ में ले लिया.
चित्रा 5 टी "उदाहरण 3: पृथक प्रोटीन 10 वैद्युतकणसंचलन के लिए उपयुक्त है दर्शाया गया है एक coomassie acrylamide 8% (5 चित्रा, ए सी और गलियों) BSA और बीएसए के साथ भरी हुई जेल 6M guanidine आइसोथियोसाइनेट निष्कर्षण विंदुक और जुड़े का उपयोग कर से अलग दाग प्रोटोकॉल अलग प्रोटीन की electrophoretic गतिशीलता नियंत्रण नमूने के समान है, हम इस प्रकार निष्कर्ष है कि निष्कर्षण प्रक्रिया सहसंयोजक अलग प्रोटीन की संरचना में परिवर्तन नहीं करता है.
चित्रा 1, पैनल: एक विशिष्ट nucleic एसिड निष्कर्षण प्रक्रिया के चित्रण नमूना 6M नमूना ट्यूब में guanidine thiocyanate के साथ मिलाया जाता है और sorbent पांच बार से अधिक पारित कर दिया. पिछले पारित होने के बाद, नमूना प्रोटीन निष्कर्षण बफर के लिए जोड़ा जाता है. sorbent और बाध्य nucleic एसिड इथेनॉल के साथ दो बार धोया जाता है. नमूना तो हवा घRied और sorbent से eluted.
चित्रा 1, पैनल बी: एक विशिष्ट प्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रिया का चित्रण प्रोटीन चरण 1, चित्रा 1, एक दूसरे निष्कर्षण विंदुक 15 बार के sorbent पर पारित किया है पैनल से अलगाव बफर के साथ मिश्रित नमूना. प्रक्रिया के शेष न्यूक्लिक एसिड निकासी प्रोटोकॉल की है कि के समान है.
चित्रा 2: ethidium ब्रोमाइड दाग agarose जेल की नकारात्मक तस्वीर मल्टिप्लेक्स शिगा विष 1 और 2 जीन प्रवर्धन प्रयोग संस्कृति (एक गलियों और बी) नमूने या कच्चे मलजल नमूने ई. के साथ बालीदार का उपयोग किया गया था कोलाई O157: H7 (गलियों डी, ई और एफ). नमूने या तो सीधे एक पीसीआर प्रतिक्रिया (एक गलियों और डी) ट्यूब या नमूने शामिल अलगाव की प्रक्रिया का उपयोग संसाधित किया गयाहै और निकाले nucleic एसिड पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब (नमूने बी, ई और एफ) के लिए जोड़ा गया था. पीसीआर प्रोटोकॉल फेंग एट अल 11 द्वारा वर्णित का एक संशोधन है. हमारी संशोधन केवल लक्षित 1 STX (कम बैंड) और 2 STX (ऊपरी बैंड) प्राइमर जोड़े द्वारा परिलक्षित उन सभी अन्य प्राइमर जोड़े को छोड़ने के. लेन सी BioRad से 1kb सीढ़ी है.
चित्रा 3: ई. यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी परिणाम कोलाई O157: H7 nucleic एसिड रिपोर्ट निष्कर्षण पिपेट का उपयोग कर अलग अलग न्यूक्लिक एसिड एक और अलगाव ख अलगाव में चिह्नित कर रहे हैं. नमूने की यूवी स्पेक्ट्रम भी पूर्व न्यूक्लिक एसिड निकासी के लिए परीक्षण किया गया था और पूर्व अलगाव लेबल. स्पेक्ट्रा Hitachi U3010 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और संबंधित सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर प्राप्त किया गया.
चित्रा 4: रंग फोटो का RapidChek परीक्षण स्ट्रिप्स चित्रा 2 में इस्तेमाल किया नमूने के प्रोटीन सामग्री निष्कर्षण पिपेट का उपयोग कर अलग किया गया था और पार्श्व प्रवाह परख द्वारा इम्युनो - जेट के लिए परीक्षण किया गया. लेन एसी unprocessed के नियंत्रण, कि, सेल संस्कृति न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन निष्कर्षण के बिना किया गया है परीक्षण पट्टी करने के लिए जोड़ रहे हैं. लेन एक ई. है कोली BL21 नकारात्मक नियंत्रण के रूप DE3 pLysS के के, लेन बी और सी शो ई. कोलाई O157: H7 कि अनुपचारित (बी), या 4 घंटे के लिए mitomycin सी (सी) के साथ इलाज किया था. डी एच के माध्यम से लेन पार्श्व प्रवाह परीक्षण स्ट्रिप्स के लिए निकाले प्रोटीन जोड़ने के परिणाम बताते हैं. लेन डी और ई ई. से प्रोटीन निकालने का उपयोग कर जांच गया (डी) के बिना या नकारात्मक नियंत्रण के रूप में mitomycin सी उपचार (ई) के साथ में BL21 DE3 pLysS कोलाई. लेन एफएच परिणाम दिखाने के लिए जब ई. से प्रोटीन निकाली कोलाई O157: H7 इस्तेमाल किया गया था. (एफ) अनुपचारित, या 2 (G) घंटे या 4 (एच) घंटे mitomycin सी इलाज संस्कृतियों से प्रोटीन से निकाला गया था.सकारात्मक परिणाम एक डबल लाल रेखा का उत्पादन.
चित्रा 5: एक Coomassie दाग की तस्वीर एसडीएस पृष्ठ बीएसए समाधान निष्कर्षण विंदुक और वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग से पृथक किया गया. लेन ए और सी μg / 250 एमएल और 500 μg / एमएल क्रमशः के नियंत्रण गलियों हैं. लेन बी और डी उनके संबंधित नियंत्रण के रूप में एक ही सांद्रता युक्त समाधान से बरामद बीएसए को दर्शाती है.
Discussion
उपकरण chemistries, और इस रिपोर्ट में वर्णित प्रोटोकॉल बिजली मुक्त, बहु - macromolecule निकासी प्रणाली है कि क्षेत्र आधारित, बिंदु का देखभाल अनुप्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है की पहली ज्ञात उदाहरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. दोनों macromolecule प्रकार के नीचे की ओर निदान या विश्लेषणात्मक उपकरणों की एक संख्या के लिए लागू किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, अलग nucleic एसिड पीसीआर (चित्रा 2 और 3) गुणवत्ता के हैं जबकि नमूना प्रोटीन घटक immunoreactive है (चित्रा 4). दुनिया की तपस्या या संसाधन सीमित क्षेत्रों में इस निकासी व्यवस्था का उपयोग तेजी से वहां रहने वाले आबादी पर रोग के बोझ को कम कर सकता है. यह निकासी व्यवस्था भी तपस्या या दूरदराज के स्थानों में नमूना प्रसंस्करण के लिए एक मजबूत अभी तक तेजी से और लागत प्रभावी तरीका उपलब्ध कराने के द्वारा दुनिया भर में रोग निगरानी कार्यक्रमों में सहायता कर सकते हैं.
निष्कर्षण विधि के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू के ऊपर उल्लिखित है कियह उपयोगकर्ता के द्वारा संशोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, मामलों में जहां नमूना आकार अधिक से अधिक है या प्रारंभिक 500 μLs के (1.2 कदम) से भी कम है, उपयोगकर्ता तदनुसार अभिकर्मकों की मात्रा को समायोजित कर सकते हैं. यही कारण है, अभिकर्मकों का बड़ा नमूना आकार के अनुपात स्थिर रहते हुए पूर्ण संस्करणों बदला जा सकता है. इसके अलावा, sorbent अधिक मार्ग की संख्या में समायोजन को भी उपयोगकर्ता के विवेक पर किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, अगर एक बड़ा नमूना मात्रा में प्रयोग किया जाता है, sorbent अधिक बार की तुलना में सूचीबद्ध (चरणों 2.4 और 3.3) से अधिक नमूना गुजर macromolecule प्रकार (न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन) sorbent से संपर्क करने की संभावना में वृद्धि होगी. मार्ग में वृद्धि की दक्षता बढ़ाने पर कब्जा sorbent संतृप्ति तक पहुँच जाता है.
हमने पाया है कि निष्कर्षण उपकरण और संबद्ध chemistries के कुछ सीमाएँ हैं, जिनमें से सबसे महत्वपूर्ण है कि प्रोटीन निष्कर्षण रसायन विज्ञान के अत्यधिक ग्लाइकोसिलेटेड की वसूली के लिए अक्षम हैप्रोटीन. घटना में है कि नीचे की ओर नैदानिक लक्ष्य एक ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन से, इस प्रणाली की पहचान के लिए आदर्श नहीं हो सकता है. इसके अतिरिक्त, या तो nucleic एसिड या प्रोटीन के लिए निकासी क्षमता के ऊपरी और निचली सीमाओं को अभी भी निर्धारित किया जा रहा है, और अनुकूलन वसूली क्षमता को अधिकतम करने के लिए चल रहा है. उपकरण के आगे विकास के इन मौजूदा ज्ञान अंतराल को दूर करेंगे.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
निष्कर्षण विंदुक के विकास के लिए अनुदान के हिस्से में एक आंतरिक अनुसंधान और विकास अनुदान DRP के लिए सम्मानित किया गया द्वारा प्रदान की गई थी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine Thiocyanate | TEKnova, Inc. | G4000 | |
| ethanol | Pharmco-AAPER | 11ACS200 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A-4503 |
References
- Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005. Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).
- Pawlowski, D. R. Extraction Pipette. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).
- Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. Method and Device for Isolating a Protein Sample. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).
- Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).
- O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea. Science. 226, 694-696 (1984).
- Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain. Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).
- Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages. DNA Research. 6, 141-143 (1999).
- Ptashne, M. A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , Third Edition ed, Cold Spring Harbor Press. (2004).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
- Feng, P., Monday, S. R. Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes. Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).
