Summary
도구 및 화학 순차적으로 전기없이 샘플의 단백질이어서 핵산을 분리 설명되어 있습니다. 도구는 격리 화학은 고체 상 추출 원리에 기초하는 동안 전송 피펫 내에서 개최 sorbent 구성되어 있습니다. 격리된 macromolecules는 immuno 기반 및 PCR 기반 assays에 의해 분석할 수 있습니다.
Abstract
이러한 Enterohemorrhagic 대장균 (EHEC), Yersinia pestis의, 또는 prion 기반의 질병 등 전통과 신흥 병원균은 정부, 산업 및 전세계 의료 전문가들을위한 상당한 우려입니다. 예를 들어, 시겔라 결합 EHECs은, 약 325,000 어린이 매년 죽음에 책임이 있으며, 미국에서 일반적인 실험실 기반의 신분은 1 사용할 수없는 개발 도상국 특히 만연한 있습니다. 저렴한 비용의 개발 및 배포는 병원균이나 질병 마커의 신속한 식별 및 / 혹은 진단을 도울 현장 기반, 포인트의 케어 도구가 극적으로 질병의 진행과 환자의 예후를 변경할 수 있습니다. 우리는 전기 또는 관련 실험실 장비이없이 고체 상 추출 (SPE)에 의해 시료로부터 핵산과 단백질을 분리하기위한 도구를 개발했습니다. 격리된 macromolecules는 diagno 사용할 수 있습니다앞으로 실험실 또는 현장 기반 포인트의 케어 플랫폼을 사용하여 두 동생. 중요한 것은,이 방법은 게놈 및 proteomic 분석 확증을 통해 자신감을 제공하고, 핵산 및 해제 분할 시료로부터 단백질 데이터의 직접적인 비교를 제공합니다.
우리 절연 도구는 실리카 기반의 입자 또는 필터를 3으로 바인딩을 통해 chaotropic 소금 용액, 보통 구아니딘의 isothiocyanate에서 핵산을 분리 고체 상 핵산 분리를위한 업계 표준, 붐 기술을 활용합니다. CUBRC의 독점 고체 상 추출 화학은 핵산 분리 네에 따라 폐기물이나 흐름 죽에서,이 경우에는 chaotropic 소금 솔루션에서 단백질을 정화하는 데 사용됩니다.
포장함으로써, 소형 저렴하고 간단한 플랫폼에 화학을 잘 특징, 우리는 VAR하에 수행할 수 핵산 및 단백질 추출을위한 휴대용 시스템을 생성했습니다조건 iety. 분리된 핵산들은 안정이되었고, 단백질 함량은 즉시 개최 손 또는 기타 면역 기반 assays에 의해 분석할 수있는 동안 전원 PCR 증폭에 사용할 수있는 위치로 운반하실 수 있습니다. 분야의 질병 마커의 급속한 신분은 크게 질병 진행의 초기 단계에서 치료의 적절한 과정을 지시하여 환자의 결과를 변경할 수 있습니다. 설명된 도구와 방법은 거의 모든 전염성 요원과 함께 사용하기에 적합하며 동시에 자신의 물류 부담을 줄이면서 사용자에게 멀티 macromolecule 유형 분석의 중복을 제공합니다.
Protocol
1. 샘플 용해
- 샘플은 액체 형태로되어 있어야합니다. 예제 단단한 경우 예를 들어 음식이나 대변을 위해, 샘플은 식염수 (PBS)를 버퍼와 같은 물이나 인산 등의 액체 매체 중단되어야합니다.
- 1.5 ML 관에서 6M 구아니딘의 Thiocyanate (산도 6.5) 500 μL로 시료 500 μL를 섞습니다.
- 주위 공기를 추방, 추출 피펫의 전구를 낮춰.
- 전구가 천천히 확장을 허용하여, sorbent 자료를 통해, 추출 피펫으로 전체 1 ML 샘플을 당기세요.
- 추출 도구는 그러한 반전 그 sorbent 구슬과 전구로 샘플 유출.
- 추출 피펫 중에 샘플을 추방하지 않도록 조심하는 전구의 예제와 sorbent 구슬을 갈다.
2. 핵산 추출 (그림 1, 패널)
- 추출 피펫을 (하향 열기) 반전하고 원래 1.5 ML 관에 샘플을 추방. <리> 추출 피펫의 목에 sorbent를 유지하는 데 신중하다고, 적당한 속도로, sorbent를 통해 전달 추출 피펫으로 전체 1 ML 샘플을 당기세요.
- 전구 우울증에 의해 1.5 ML 관에 전체 샘플을 추방.
- 오 패스 총 sorbent 네 개가 배 위에 시료를 통과, 단계 2.2 2.3 반복합니다.
- sorbent 이상의 다섯 번째 패스 후, 단백질 추출 완충액 (15 ML 원뿔 튜브)의 4mL로 전체 1 ML 샘플을 추방, 튜브를 닫습니다, 그리고 나중에 사용하기 위해 별도로 설정합니다.
- 최종 통과시 원래 튜브로 에탄올을 반환, sorbent 세 번 이상의 95 % 에탄올 1 ML를 전달하여 분리된 핵산을 씻으십시오.
- 두 번째 한 ML, 95 % 에탄올 세척을 사용하여 2.6 단계를 반복합니다.
- 눌러 핵산 / sorbent 침대를 건조 추출 피펫 내내 주변 공기를 통과, 15 분 전구를 놓습니다. 추출 피펫 U의 일각에서 잔류 에탄올 닦아Kimwipe 노래를.
- sorbent 다섯 번 이상 10 밀리미터 트리스 (산도 6.8) 250 μL를 전달하여 핵산을 복구합니다. 트리스 버퍼 같은 PBS와 같은 다른 적절한 수용액으로 대체하실 수 있습니다. 결과 솔루션은 압축을 푼 핵산이 포함되어 있습니다.
3. 단백질 추출 (그림 1, 패널 B)
- 전도에 의한 단계 2.5에서 샘플 및 단백질 추출 버퍼 튜브를 섞어서 새로운 추출 피펫의 sorbent 이상이 5 ML 샘플의 약 2-3 밀리리터를 전달합니다.
- 추출 피펫의 목에 sorbent를 유지하는 데 신중 같은 15mL 원뿔 튜브로 전체 샘플을 추방.
- sorbent 15 배 이상의 샘플을 전달 단계 3.1 및 3.2 반복합니다.
- sorbent 침대 위에 세 번, 그것의 원래 관으로 꺼내기 에탄올을 95 % 에탄올 1 ML를 전달하여 sorbent 및 바운드 단백질을 씻으십시오.
- 두 번째 한 ML, 95 % 에탄올 세척을 사용하여 3.4 단계를 반복합니다.
- 눌러 단백질 / sorbent 침대를 건조 추출 피펫 내내 주변 공기를 통과, 15 분 전구를 놓습니다. kimwipe를 사용하여 추출 피펫의 일각에서 잔류 에탄올을 닦아주십시오.
- sorbent 다섯 번 이상의 PBS 250 μL를 전달하여 단백질을 복구할 수 있습니다. PBS 버퍼와 같은 10 밀리미터 트리스 (산도 6.8)와 같은 다른 적절한 수용액으로 대체하실 수 있습니다. 결과 솔루션은 샘플의 단백질 함량을 포함하고 있습니다.
1 그림.
그림 2.
그림 3.
4 그림.
그림 5.
Representative Results
핵산 분리 : 절연 핵산은 PCR amplifiable 및 단백질 오염 무료입니다.
예제 1 : 복구 핵산은 PCR 기반 응용 프로그램에 사용하기 적합합니다. 예를 들어, 그림 2 Enterohemorrhagic E.와 관련된 시가 독소 유전자의 증폭을 보여줍니다 대장균 O157 : 추출 피펫을 사용하여 핵산 / 단백질 추출 과정에서 H7 변형 편집 판단리스트-933 (ATCC # 35150). 시가 독소의 유전자 STX 1 STX 2가 해당 제품 및 기타 Enterohemorrhagic E.에 온화한 람다 같은 박테리오 파지 및 결함 박테리오 파지에서 찾을 수있는 P R업자 5 6 7 8의 통제하에 대장균의 변종. E.의 SOS 반응의 활성화 대장균은 유도 및 / 또는 독소 생산 9 prophage로 안내합니다. 우리는 펭 외 의해 멀티 플렉스 PCR 분석의 수정된 버전을 활용했습니다. 11 문화와 아군 하수 시료 모두에서 STX 1 STX 2 유전자를 식별합니다. 레인은 그림 2에서 A와 B는 처리되지 않은 문화 샘플 (레인)의 PCR 증폭 및 처리 문화 샘플 (레인 B)의 결과를 보여줍니다. 이러한 결과는 거의 동일 의미가 처리되지 않거나 고립된 핵산의 충실도에 대한 손실이 없습니다. 우리는 다음 아군 원시 하수 (차선 D) 또는 아군 하수의 고립 핵산 (차선 E & F)를 증폭. 이러한 데이터는 분리된 핵산은 아군 하수 시료에서 비 절연 핵산 대 더욱 증폭으로 이어진 것으로 나타났습니다. 따라서 자연스럽게 하수도에서 발견 PCR 억제제 중 하나는 고립에 따라 제거되었다는이나 핵산이 분리시 집중되어 있다고 결론. 이 두 가설의 조합도 가능합니다.
자외선 분광법은 다음 고립된 핵산이 비교적 자유로운 것을 표시하기 위해 사용되었다 OF 오염 단백질. 그림 3은 두 가지 중에 자외선 스펙트럼을 보여줍니다 대장균 O157 : H7 핵산 extractions, 라벨 절연 및 절연 B, 미리 격리라는 세균성 문화의 정규화된 스펙트럼에 비교 인치 분리된 핵산의 자외선 스펙트럼은 260 nm의 및 1.8 10 다가오고 280 nm의 흡광도 사이의 계산된 비율을 가진, 순수한 핵산의 스펙트럼 유사합니다. 이러한 데이터를 설명하는 기법을 사용하여 복구 핵산 분획이 매우 작은 오염 단백질이있다는 것을 보여줍니다.
단백질 분리 : 핵산 / 단백질 분리 실험에서 발견한 단백질은 immunoreactive 순수 단백질에 electrophoretically 동일합니다.
예제 2 : 분리된 단백질 분획은 RapidChek E.에 적용되었다 대장균 O157 측방 유동 분석 스트립 (SDIX 주식 회사). 컨트롤 E.을 품고 모든 샘플에서 긍정적인 인식을 보여 대장균 하거나 STX 유도 (그림 4, 각각 차선 B와 C)없이 O157. 그림 4의 데이터는 또한 E.을 품고 그 샘플에 대한 긍정적인 결과를 보여 추출 피펫을 사용하여 핵산 그리고 단백질에 대한 처리 된 대장균 O157. 이러한 데이터는 각 시료에서 분리된 단백질은 따라서 긍정적인 반응을 촉발 immunoreactive는 것을 보여줍니다.
PCR 증폭은 (같은 예제 1에서 설명) 절연 단백질 분획은 핵산을 오염은없는 걸 보여주 단백질 샘플에서 수행되었다. 이러한 실험 결과는 겔 전기 영동에 의해 모두 부정했다. 따라서, 우리는 샘플의 단백질 함량은 핵산을 오염으로부터 분리되었다고 결론 지. 이러한 결과는, 핵산 및 단백질 함량이 별도 분획화 단계에서 격리되는 핵산 분리 단계 쇼 설명한 기능과 전체에서 촬영된.
T "> 예 3 :. 분리된 단백질은 전기 영동 10 적합 그림 5는 coomassie가 추출 피펫 및 관련 사용하여 6M 구아니딘의 isothiocyanate 격리 BSA (그림 5, 레인 & C)와 BSA와 함께 로드된 8 % 아크릴 아미드 겔을 묻다 모습 프로토콜. 고립된 단백질의 전기 영 동적 이동성은 컨트롤 샘플의 그것과 동일합니다. 우리 때문에 추출 과정이 고립된 단백질의 공유 결합 구조를 변경하지 않는다는 결론.
그림 1, 패널 : 전형적인 핵산 추출 과정의 묘사 샘플은 샘플 튜브에서 6M 구아니딘의 thiocyanate와 함께 섞어 sorbent 다섯 번 이상 전달됩니다.. 마지막 통과 후, 샘플은 단백질 추출 버퍼에 추가됩니다. sorbent 및 바운드 핵산은 에탄올로 두 번 씻어있다. 예제 다음 메니저입니다려다와 sorbent에서 eluted.
그림 1, 패널 B : 전형적인 단백질 추출 절차의 묘사 단계 1, 그림 1은 두 번째 추출 피펫 15 배의 sorbent를 통해 전달되는 패널에서 단백질 분리 버퍼와 혼합 샘플.. 절차의 나머지 핵산 추출 프로토콜의 그것과 동일합니다.
그림 2 :. ethidium 브로마이드 스테인드 아가로 오스 겔의 음수 그림은 멀티 플렉스 시가 독소 1과 2 유전자 증폭 실험은 엑스타시를 타서 문화 샘플 (차선 A와 B) 또는 원시 하수 샘플을 사용하여 수행되었다 대장균 O157 : H7 (차선 D, E 및 F). 샘플을 직접 PCR 반응 튜브 (차선 및 D) 또는 샘플에 추가된 것은 절연 proces를 사용하여 처리되었습니다s와 추출 핵산은 PCR 반응 튜브 (샘플 B, E 및 F)에 추가되었습니다. PCR 프로토콜 펭 외 11 시까지 설명한 하나의 수정입니다. 우리의 수정은 다른 모든 프라이머 쌍을 이탈, 오직 STX 1 (낮은 대역)과 STX 2 (상위 대역) 프라이머 쌍에 의해 증폭들을 대상으로. 레인 C는 BioRad에서 1Kb 사다리입니다.
그림 3 : 중에 자외선 분광 결과 대장균 O157 : H7 핵산이 보고된 추출 피펫을 사용하여 격리 격리된 핵산은 절연 및 절연 B로 표시됩니다.. 샘플의 자외선 스펙트럼은 또한 사전 핵산 추출로 테스트되었고 사전 고립 표시됩니다. 스펙트럼은 히타치 U3010 분광 및 관련 소프트웨어 패키지를 사용하여 획득했다.
그림 4 :. RapidChek 테스트 스트립의 컬러 사진은 그림 2에 사용되는 샘플의 단백질 함량은 추출 피펫을 사용하여 격리 및 측면 흐름 분석에 의한 immuno-반응성 위해 테스트되었습니다. 차선 교류, 세포 배양은 핵산이나 단백질 추출하지 않고 테스트 스트립에 추가되었습니다되어 처리되지 않은 컨트롤입니다. 차선는 엑스타입니다 부정적인 컨트롤과 같은 대장균 BL21 DE3 pLysS, 레인 B와 C 쇼 E. 대장균 O157 : (B) 또는 4 시간 동안 mitomycin C (C)로 치료 경과했습니다 H7. H를 통해 레인 D는 측면 흐름 테스트 스트립으로 추출한 단백질을 추가하는 결과를 보여줍니다. 레인 D와 E는 E.로부터 단백질 추출물을 사용하여 탐지되었다 중 (D)없이 또는 부정적인 컨트롤로 mitomycin C 처리 (E)와 대장균 BL21 DE3 pLysS합니다. E.로부터 단백질을 추출했을 때 FH는 결과를 보여 차선 대장균 O157은 : H7가 사용되었습니다. 단백질은 (F) 치료, 또는 2 시간 (G) 또는 4 시간 (H) Mitomycin C 처리 문화에서 추출되었다.긍정적인 결과는 이중 빨간색 라인을 생산하고 있습니다.
그림 5 :. Coomassie의 스테인드의 사진 SDS-PAGE BSA는 추출 피펫과 기술된 프로토콜을 사용하여 용액으로부터 격리되었다. 울타리와 C는 각각 250 μg / ML 500 μg / ML의 제어 차선입니다. 레인 B와 D는 각각의 컨트롤과 같은 농도를 포함하는 솔루션에서 발견한 BSA를 묘사.
Discussion
이 보고서에 설명된 도구, 화학 및 프로토콜 필드 기반, 포인트의 케어 애플 리케이션에서 활용할 수있는 전기없는, 멀티 macromolecule 추출 시스템의 첫 번째 알려진 예제를 나타냅니다. 두 macromolecule 종류 하류 진단이나 분석 장치의 숫자에 적용할 수 있습니다. 샘플의 단백질 구성 요소 (그림 4) immunoreactive 반면 예를 들어, 분리된 핵산은 PCR 품질 (그림 2 및 3)입니다. 세계의 금욕이나 리소스가 제한된 지역에서 본 추출 시스템의 활용도가 크게 거기 사는 인구에 대한 질병의 부담을 줄일 수 있습니다. 이 추출 시스템은 또한 금욕 또는 원격 위치에서 시료 처리를위한 견고한 아직 신속하고 비용 효과적인 방법을 제공하여 전세계 질병 감시 프로그램을 도울 수 있습니다.
위에 명시된 추출 방법에 대한 하나의 중요한 요소는 그그것은 사용자가 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 샘플 크기는 초기 500 μLs (단계 1.2)보다 크거나 적은 경우에, 사용자는 이에 따라 시약의 볼륨을 조정할 수 있습니다. 그것은 절대적인 볼륨을 변경할 수 있습니다 반면 샘플 크기 시약의 용적 비율이 일정하게 유지하여야합니다. 또한, sorbent여 구절의 수가 조정은 또한 사용자의 재량으로 만들 수 있습니다. 큰 샘플 볼륨이 사용되는 예를 들어, 나열된 것보다 sorbent 번 이상 (단계 2.4 & 3.3) 이상의 시료를 통과하는 것은 sorbent 연락 macromolecule 유형 (핵산 또는 단백질)의 가능성을 높일 것입니다. sorbent 채도에 도달할 때까지 단락의 증가는 증가 효율성을 캡처해야합니다.
우리는 추출 도구 및 관련 화학은 단백질 추출 화학이 높은 glycosylated의 회복을 비효율적이라는 것입니다 가장 중요한 그 중 몇 가지 제한 사항을 가진 것으로 나타났습니다단백질. 하류 진단이 glycosylated 단백질을 대상으로하는 경우에이 시스템 식별에 적합하지 않을 수 있습니다. 또한 핵산이나 단백질 중 하나에 대한 추출 효율의 위턱과 아래턱에 제한은 아직 결정 및 최적화가 복구 효율성을 최대화하기 위해 진행하고있다. 도구의 발전이 현재의 지식 격차를 극복합니다.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
추출 피펫의 발전을위한 기금은 DRP에게 수여 내부 연구 및 개발 보조금에 의해 일부로 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine Thiocyanate | TEKnova, Inc. | G4000 | |
| ethanol | Pharmco-AAPER | 11ACS200 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A-4503 |
References
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