Summary
Инструмент и химии описаны последовательно изолировать нуклеиновых кислот затем белки из образцов без электричества. Этот инструмент состоит из сорбента проводится в рамках передачи пипетки, а изоляция химии основаны на твердой фазе принципы извлечения. Изолированной макромолекулы могут быть проанализированы на основе иммуно-и ПЦР-анализа.
Abstract
Традиционные и новые патогенов, таких как Энтерогеморрагическая кишечной палочки (EHEC), Yersinia чумы, или прион основе заболевания представляют значительный интерес для правительств, промышленности и медицинских работников по всему миру. Например, EHECs, в сочетании с Shigella, несут ответственность за гибель примерно 325 000 детей каждый год, и особенно широко распространены в развивающихся странах, где лаборатория на основе идентификации, распространена в США, отсутствует 1. Разработка и распространение недорогих на местах, точка-в-санитарной инструменты, чтобы помочь в быстрой идентификации и / или диагностики возбудителей болезней или маркеров может резко изменить прогрессирования заболевания и прогноз пациентов. Мы разработали инструмент для изоляции нуклеиновых кислот и белков из образца твердофазной экстракции (SPE) без электричества и связанных лабораторного оборудования 2. Изолированной макромолекулы могут быть использованы для диагнозасестра или в лаборатории вперед или с использованием на местах точка-в-санитарной платформ. Важно отметить, что этот метод предусматривает прямое сравнение нуклеиновых кислот и белков данным ООН раскола образца, предлагающий доверия путем подтверждения геномики и протеомики анализа.
Наша изоляция инструмент использует промышленный стандарт для твердой фазы изоляции нуклеиновых кислот, BOOM технология, которая изолирует нуклеиновых кислот из хаотропных солевого раствора, как правило, гуанидина изотиоцианат путем связывания на основе диоксида кремния частиц или фильтры 3. Собственности твердофазной экстракции CUBRC в химии используется для очищения белка из хаотропных растворов солей, в данном случае, из отходов или потока через следующие нуклеиновых кислот изоляции 4.
По упаковке хорошо характеризуется химии в небольшой, недорогой и простой платформе, мы создали портативные системы для нуклеиновых кислот и белков, что добыча может быть выполнена в соответствии с уагiety условиях. Изолированных нуклеиновых кислот являются стабильными и могут быть доставлены в место, где энергия доступна для ПЦР в то время как содержание белка может быть немедленно проанализирован ручной или другие иммунологические на основе анализов. Быстрое выявление маркеров заболевания в этой области может существенно изменить результат пациента, направляя надлежащее курс лечения на ранней стадии заболевания. Инструмент и метод, описанный пригодны для использования практически с любым инфекционным агентом и предлагают пользователю избыточности нескольких макромолекул анализ типа, одновременно уменьшая их материально-технической нагрузки.
Protocol
1. Пример Лизис
- Образцы должны быть в жидком виде. Если образец твердой, например для пищевой или стула, выборка должна быть приостановлена в жидких средах, таких как вода или фосфатным буферным раствором (PBS).
- Смешать 500 мкл образца 500 мкл 6М гуанидин тиоцианатов (рН 6,5) в 1,5 мл трубки.
- Нажмите на лампочку добычи пипетки, изгнав окружающего воздуха.
- Потяните за весь 1 мл образца в добыче пипетки над сорбентом материал, позволяя лампы постепенно расширяться.
- Переверните инструмент для извлечения, что сорбент бисером и образец утечки в луковице.
- Измельчить сорбента бисер с образцом в колбе быть осторожным, чтобы не исключать образца из добычи пипетки.
2. Нуклеиновых кислот (рис. 1, группа А)
- Инверсия добычи пипетки (открытие вниз) и выслать образец в исходное 1,5 мл трубки. <LI> Выньте все 1 мл образца в добыче пипетки, проходящего через сорбент, в умеренном темпе, стараясь не сорбента в шею добычи пипетки.
- Выгнать всей выборки в 1,5 мл трубки, нажав на лампочку.
- Повторите шаги 2.2 и 2.3, передавая образцы сорбентов по четыре раза в общей сложности 5 проходов.
- После пятого прохода через сорбент, изгнать все 1 мл образца в 4 мл буфера, экстракции белков (в 15 мл коническую трубку), закрыть трубу, и отложите в сторону для последующего использования.
- Вымойте изолированных нуклеиновых кислот, передав 1 мл 95% этанола в сорбента в три раза, возвращаясь этанола в исходное трубы на окончательное принятие.
- Повторите шаг 2.6 Использование второй 1 мл 95% этанола стирки.
- Нажмите и отпустите лампы в течение 5 минут, проходя окружающего воздуха всей добычи пипетку, чтобы высушить нуклеиновых кислот / сорбент постели. Протрите остаточного этанола от кончика пипетки добычи ипеть Kimwipe.
- Восстановление нуклеиновых кислот путем передачи 250 мкл 10 мМ трис (рН 6,8) по сравнению с сорбентом в пять раз. Буфера Трис можно заменить любым другим подходящим водным раствором, таких как PBS. Полученный раствор содержит извлеченный нуклеиновых кислот.
3. Добыча белки (рис. 1, группа В)
- Смешайте образец и белка буфером для экстракции в трубку шагом 2,5 обращением и передать около 2:58 миллилитров этого 5 мл образца на сорбент нового пипетки добычи.
- Выгнать всей выборке в той же 15 мл коническую трубку стараясь не сорбента в шею добычи пипетки.
- Повторите шаги 3.1 и 3.2, передавая образцы сорбентов по 15 раз.
- Промыть сорбент и связанного белка, передав 1 мл 95% этанола на сорбент кровати в три раза, выбрасывая этанола в его оригинальной трубки.
- Повторите шаг 3.4 Использование второй 1 мл 95% этанола стирки.
- Нажмите и отпустите лампы в течение 5 минут, проходя окружающего воздуха всей добычи пипетку, чтобы высушить белок / сорбент постели. Протрите остаточного этанола от кончика пипетки добычи использованием kimwipe.
- Восстановление белка путем передачи 250 мкл PBS в течение сорбента в пять раз. Буфера PBS можно заменить любым другим подходящим водным раствором, таких как 10 мМ Трис (рН 6.8). Полученный раствор содержит белка в образце.
Рисунок 1.
Рисунок 2.
Рисунок 3.
Рисунок 4.
Рисунок 5.
Representative Results
Выделение нуклеиновых кислот: Изолированные нуклеиновые кислоты ПЦР усиливаемых и без белка загрязнения.
Пример 1: восстановленные нуклеиновых кислот, которые пригодны для использования в ПЦР-приложений. Например, на рисунке 2 показано усиление Шига токсина генов, связанных с Энтерогеморрагическая E. палочки O157: H7 штамм EDL-933 (АТСС # 35150) от нуклеиновой кислоты / экстракции белков процедуры с помощью пипетки добычи. Токсин Шига генов STX 1 и STX 2 находятся на умеренном лямбда-бактериофага, как и дефектных бактериофагов в этом и других Энтерогеморрагическая E. штаммов кишечной под контролем промотора Р 5 6 7 8. Активация ответ SOS в E. палочки приводит к индукции профага и / или токсинов 9. Мы использовали модифицированную версию мультиплексный ПЦР Фэн и др. 1.1 выявить STX 1 и STX 2 гена в культуру и шипами образцы сточных вод. Дорожки и B на рисунке 2 представлены результаты ПЦР на необработанные образцы культуры (переулок), а также обработанные образцы культуры (полоса B). Эти результаты практически идентичны смысла нет потери качества в обработанном или изолированных нуклеиновых кислот. Далее усиливается шипами неочищенных сточных вод (полоса D) или изолированных нуклеиновых кислот с шипами сточных вод (полосы E и F). Эти данные свидетельствуют о том, что изолированные нуклеиновых кислот в результате большее усиление по сравнению с неизолированными нуклеиновых кислот с шипами образцы сточных вод. Поэтому мы делаем вывод, что либо ингибиторы ПЦР, естественно, в сточные воды были удалены по отдельности или, что нуклеиновые кислоты были сосредоточены на изоляцию. Сочетание этих двух гипотез также возможно.
Ультрафиолетовая спектроскопия следующий показано, что изолированные нуклеиновых кислот были относительно свободными ое загрязняющих белков. На рисунке 3 показана УФ-спектры двух E. палочки O157: H7, нуклеиновые кислоты экстракции, обозначенные изоляции и изоляции б, в сравнении с нормированным спектром бактериальных культур, обозначенные заранее изоляции. УФ-спектров выделенных нуклеиновых кислот напоминает спектры чистых нуклеиновых кислот, имеющих рассчитывается коэффициент абсорбции между 260 нм и 280 нм приближается 1,8 10. Эти данные показывают, что существует очень мало загрязняющих белка в нуклеиновой кислоте фракция восстановить, используя методику, описанную.
Белки изоляции: Восстановленные белка из нуклеиновой кислоты / белок изоляции эксперимент иммунореактивного и электрофореза идентичны чистого белка.
Пример 2: Изолированная часть белка была применена к RapidChek E. палочки O157 боковой поток анализа полосы (SDIX, Inc.) Управление показать позитивную идентификацию во всех образцах укрывательство E. палочки O157, с или без STX индукции (рис. 4, дорожки B и C, соответственно). Данные на рисунке 4 также показывают положительные результаты для этих образцов укрывательство E. палочки O157, которые были обработаны для нуклеиновых кислот и белков, то использование добыча пипетки. Эти данные показывают, что изолированные белки от каждого образца иммунореактивного спровоцировав тем самым положительный ответ.
ПЦР-амплификации (как описано в примере 1) был выполнен на белок образцы, чтобы показать, что изолированная часть белка была лишена загрязняющих нуклеиновых кислот. Результаты этих экспериментов были отрицательными помощью гель-электрофореза. Таким образом, можно заключить, что содержание белка в образце была отделена от загрязнения нуклеиновых кислот. Эти результаты, взятые в целом, с описанным в нуклеиновой кислоте изоляции шаг показывает, что нуклеиновые кислоты и белка изолированы в отдельных этапах фракционирования.
т "> Пример 3. Выделенный белок подходит для электрофореза 10 Рисунок 5 изображает Кумасси окрашивали 8% акриламида гель загружается с BSA (рис. 5, дорожки и C) и BSA изолированы от 6М гуанидин изотиоцианат помощью пипетки добычи и связанных с ним протокол. электрофоретической подвижности выделенных белков идентична контрольных образцов. Таким образом, заключить, что процесс извлечения не изменяет ковалентной структуры изолированного белка.
На рисунке 1, Группа A: изображение типичного нуклеиновые кислоты процедура извлечения образца смешивают с 6M гуанидина тиоцианата в пробирку и перешел сорбента в пять раз.. После последнего прохода, образец добавляется в буфер извлечения белка. Сорбента и связанных нуклеиновых кислот дважды промывают этанолом. Затем образец воздуха гРид и вымывают из сорбента.
На рисунке 1, Группа B: изображение типичная процедура извлечения белка образец смешивается с белком изоляции буфере с шагом 1, рисунок 1, панель передается через сорбент второй пипетки добычи в 15 раз.. Остальная процедура идентична нуклеиновых кислот протокол добычи.
Рисунок 2:. Отрицательные картину бромистого этидия окрашенных агарозном геле мультиплексированных Шига токсин 1 и 2 амплификации гена эксперимент проводили с использованием образцов культуры (полосы А и В) или сырые образцы сточных вод с шипами E. палочки O157: H7 (полосы D, E и F). Образцы были непосредственно добавлены трубы реакции ПЦР (полосы и D) или образцы обрабатываются с помощью изоляции процессорыс, а извлечь нуклеиновые кислоты были добавлены к трубе реакции ПЦР (образцы B, E и F). ПЦР протокол является модификацией описанного Фэн и др. 11. Наша модификация предназначена только те, усиливается STX 1 (нижняя полоса) и STX 2 (верхний диапазон) пары праймеров, сбросив все другие пары праймеров. Лейн С 1Кб лестница из BioRad.
Рисунок 3: Результаты УФ-спектроскопии Е. палочки O157: H7, нуклеиновые кислоты выделяли с помощью пипетки сообщил добычи изолированных нуклеиновых кислот помечены изоляции и изоляции б.. УФ-спектр образца и испытания до нуклеиновых кислот и обозначен заранее изоляции. Спектры были получены с использованием Hitachi U3010 спектрофотометр и связанных с ним программного обеспечения.
Рисунок 4. Цветное фото полос RapidChek тест Содержание белка в образцах на рисунке 2 выделяли с помощью пипетки добычи и протестированы для иммунной реактивности боковыми анализа потока. Переулки AC необработанные управления, то есть культуры клеток был добавлен в тест-полоску без нуклеиновой кислоты или белка добычи. Лейн является E. палочки BL21 DE3 pLysS в качестве отрицательного контроля, дорожки B и C шоу E. палочки O157: H7, которая была необработанной (B), или обработаны митомицином С в течение 4 часов (C). Дорожки через D H показать результаты добавления извлеченного белка боковой тест-полосок потока. Переулки D и Е были исследованы использование белкового экстракта из Е. палочки BL21 DE3 pLysS либо без (D) или митомицином С лечение (E) как отрицательный контроль. Переулки FH показать результаты после извлечения белка из Е. палочки O157: H7 был использован. Белка была извлечена из необработанной (F), или 2 часа (G) или 4 часа (H) обработанными митомицином С культур.Положительные результаты производить двойной красной линией.
Рисунок 5. Фотография окрашенных Кумасси SDS-PAGE BSA была изолирована от решения с помощью пипетки добычи и описаны протоколы. Дорожки и С являются контроль полосы 250 мкг / мл и 500 мкг / мл соответственно. Переулки B и D показывают восстановленные BSA из растворов, содержащих же концентрациях, что и соответствующие элементы управления.
Discussion
Инструмент, химии и протокол, описанный в этом отчете, представляют собой первый известный пример электричество бесплатно, мульти-макромолекулы вытяжной системы, которые могут быть использованы в на местах, пункт оказания медицинской помощи приложения. Оба типа макромолекулы могут быть применены к ряду ниже диагностических или аналитических приборов. Например, изолированных нуклеиновых кислот ПЦР качества (рис. 2 и 3), а белковый компонент образца иммунореактивного (рис. 4). Использование этой системы добычи в суровых условиях ограниченных ресурсов и районов мира может существенно сократить бремя болезни населения, проживающего там. Это извлечение система может также помочь в эпиднадзора программы по всему миру, обеспечивая надежное и быстрое и экономически эффективный способ обработки образцов в строгом или отдаленных районах.
Одним из важных аспектов для извлечения метода, описанного выше в том, чтоон может быть изменен пользователем. Например, в тех случаях, когда размер выборки больше или меньше, чем первые 500 μLs (шаг 1.2), пользователь может регулировать объемы реагентов соответственно. То есть, объемном соотношении реагентов для выборки должна оставаться неизменной в то время как абсолютные объемы могут быть изменены. Кроме того, поправки в ряд мест в сорбента могут быть сделаны по усмотрению пользователя. Например, если большой объем пробы используется, проходя через образец сорбента раза больше, чем перечисленные (шаги 2,4 и 3,3) увеличит вероятность того, что макромолекулы типа (нуклеиновой кислоты или белка) связавшись с сорбентом. Увеличение проходов должны увеличить эффективность захвата до сорбента насыщения.
Мы обнаружили, что средство извлечения и связанных с ним химических имеют некоторые ограничения, наиболее значительным из которых является то, что химия белка добычи является неэффективным для восстановления сильно гликозилированныйбелки. В случае, если ниже диагностических целей гликозилированного белка, эта система не может быть идеальным для идентификации. Кроме того, верхний и нижний пределы добычи эффективность как для нуклеиновых кислот и белков до сих пор определяется и оптимизация ведется максимально восстановления эффективности. Дальнейшее развитие этого средства преодоления этих существующих пробелов в знаниях.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Финансирование для развития добычи пипетка была предоставлена частично внутренних исследований и развития грант в DRP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine Thiocyanate | TEKnova, Inc. | G4000 | |
| ethanol | Pharmco-AAPER | 11ACS200 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A-4503 |
References
- Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005. Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).
- Pawlowski, D. R. Extraction Pipette. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).
- Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. Method and Device for Isolating a Protein Sample. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).
- Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).
- O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea. Science. 226, 694-696 (1984).
- Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain. Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).
- Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages. DNA Research. 6, 141-143 (1999).
- Ptashne, M. A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , Third Edition ed, Cold Spring Harbor Press. (2004).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
- Feng, P., Monday, S. R. Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes. Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).
