Summary
Aquí se describe una novela de alto contenido de ensayo de la inflamación inducida químicamente con miras a la identificación de moduladores bioactivos inmune. Hemos combinado con éxito con la microscopía automatizada de scripts de software desarrollado que permite la cuantificación automática de la respuesta inflamatoria, así como el procesamiento de datos aún más, el análisis, la minería, y el almacenamiento.
Abstract
Larvas de pez cebra son particularmente susceptibles de animal entero pequeña molécula 1,2 pantallas debido a su pequeño tamaño y relativa facilidad de manipulación y observación, así como el hecho de que los compuestos simplemente se puede añadir al agua de baño y se absorben fácilmente cuando se administra en una <1% de DMSO solución. Debido a la claridad óptica de las larvas de pez cebra y la disponibilidad de las líneas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes en los leucocitos, el pez cebra ofrece la ventaja única de seguimiento de una respuesta inflamatoria aguda in vivo. En consecuencia, utilizando el pez cebra de alta contenido pantallas pequeñas moléculas destinadas a la identificación de compuestos inmuno-moduladores con un alto rendimiento se ha propuesto 3-6, lo que sugiere escenarios inflamación de inducción, por ejemplo, muescas localizadas en el tejido de la aleta, el daño láser dirigido a la superficie de la yema embriones de 7 o amputación tailfin 3,5,6. El principal inconveniente de estos métodos sin embargo fueel requisito de la manipulación manual de larvas para inducir la herida, evitando así la selección de alto rendimiento. Introducción de la inflamación inducida químicamente (Chin) ensayo de ocho eliminados estos obstáculos. Desde que se inflige heridas químicamente el número de embriones que pueden ser tratados al mismo tiempo es virtualmente ilimitada. El tratamiento temporal de larvas de pez cebra con sulfato de cobre induce selectivamente la muerte celular en las células ciliadas del sistema de línea lateral y los resultados en la contratación rápida de granulocitos a neuromastos heridos. La respuesta inflamatoria se puede seguir en tiempo real mediante el uso de compuestos transgénicos cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 6,9 larvas de pez cebra que expresan una proteína verde fluorescente en las células neuromast, así como una roja granulocitos fluorescentes etiquetado de proteínas.
Con el fin de diseñar una estrategia de cribado que permita a los dos análisis de alto contenido y de alto rendimiento se introdujo el manejo robótico de líquido y micr automatizado combinadooscopy con un guión de software a medida desarrollado. Este script permite la cuantificación automática de la respuesta inflamatoria al anotar el porcentaje de área ocupada por los leucocitos de color rojo fluorescente dentro de un área definida empíricamente que rodea heridos neuromastos fluorescentes verdes. Además, el procesamiento automatizado de datos, el manejo, visualización y almacenamiento de todos ellos basados en la costumbre desarrollada MATLAB y scripts de Python.
En resumen, presentamos un sistema automatizado de HC / HT pantalla que permite realizar pruebas de compuestos químicos por su efecto sobre la iniciación, progresión o resolución de una respuesta inflamatoria granulocítica. Este protocolo sirve un buen punto de partida para más análisis en profundidad de los mecanismos de drogas y rutas implicadas en la orquestación de la respuesta inmune innata. En el futuro, puede ayudar a identificar los intolerables efectos tóxicos o desviado-en las primeras fases de descubrimiento de fármacos y por lo tanto reducir los riesgos del procedimiento y los costes de desarrollo de fármacos.
Protocol
1. Manejo de animales
Para el ensayo de Chin uso 3 fdd larvas resultantes de los apareamientos de grupo entre homocigotos cldnB doble transgénico :: GFP / lysC :: DsRed2 AB y el pescado (de tipo salvaje). Recoger embriones por desove natural y criarlos a 29 ° C en medio de E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4 y 0,1% de azul de metileno, se equilibró a pH 7,0) en placas de Petri. Es esencial para mantener una densidad de embriones que no excedan de 50-70 por placa.
2. Larva Clasificación
Compruebe que todas las larvas en un estereoscopio de fluorescencia para la expresión del fluorescente, la inflamación espontánea y desarrollo relacionadas con la edad apropiada.
3. Preparación Examen Medio (Siempre prepare fresco)
Preparar medio E3 sin azul de metileno suplementado con DMSO (1% final) y MS222 (0,05 g / l).
4. CuSO4Preparación (Siempre prepare fresco)
En primer lugar, pesar CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) y preparar una solución madre 20 mM en dH 2 O. Preparar 120 mM CuSO 4 solución de trabajo (de 20 mM de solución de reserva) en E3/DMSO (1%) / 222-MS. Proteger CuSO 4 solución de la luz.
5. 384 y placa de preparación (Greiner 384 pocillos de microplacas)
Pre-añaden 20 l de E3/DMSO (1%) / MS 222-a cada pocillo con una pipeta inversa. Un aumento de punta de la pipeta diámetro es necesario para controlar los embriones con cuidado sin causar ningún herido, esto se hace cortando la punta de un orificio de 2 mm. Transferir sola larva en 74 l de medio a cada pocillo (84 l para el control sin tratar). Si es necesario, las larvas de orientarse en una posición lateral en el bien con un sistema flexible de puntas de pipeta Eppendorf Microloader (Eppendorf, 5242 956.003).
Llevar a cabo todos los pasos siguientes para manejo de líquidos con un líquido robotel manejo de estación de trabajo para asegurar el tratamiento simultáneo de todas las larvas.
6. Tratamiento de Drogas
Mezcle los compuestos de la placa de drogas de valores 5 veces pipeteando arriba y hacia abajo. Añadir 16 l de la placa de 7.5X existencias de medicamentos a cada pocillo y mezclar 5 veces. Ajuste la posición de la punta dentro de los pozos para evitar lesiones de las larvas y dispensar el medio a 10 l / s. Mezclar medio en pocillos 4 veces para asegurar una distribución homogénea del fármaco dentro del pozo.
7. Incubación
Incubar la placa de detección de 1 hora a 29 ° C cubierto con papel de aluminio para proteger los compuestos así como CuSO 4 de la luz.
8. Química hiriente
Añadir 10 l de 120 mM CuSO 4 solución de trabajo a cada pocillo, excepto con los controles negativos, mezcla de 4 veces y se incuba de nuevo durante 1 hora a 29 ° C.
9. Lavado
Retire y el intercambio de 80 l de mí mediano de cada pocillo dos veces (en 20 pasos l) para eliminar los compuestos y CuSO 4.
10. Adquisición de imágenes
Iniciar la adquisición de imágenes en un microscopio invertido automatizado (es decir: Olympus exploración ^ R) 90 minutos después del tratamiento inicial de cobre. Ajuste inicial z nivel de manera que neuromastos de derecha e izquierda de la línea lateral posterior son visibles. Imagen de cada pozo una vez por hora en el campo claro los canales, Cy3 y las buenas prácticas agrarias en 4 planos focales (50 m distancia) con un objetivo de 4x (NA = 0,13).
Información adicional sobre la imagen y procesamiento de datos están disponibles bajo petición.
11. Procesamiento de Imágenes
1. Los datos de clasificación
Las imágenes RAW se procesan con nuestro script personalizado el software LabVIEW. La primera operación en la canalización de procesamiento de imagen es la clasificación de imágenes en bruto del microscopio carpeta de datos generados por el canal, así y la información de punto de tiempo.
ove_step "> 2. foco extendidoPosteriormente, el software crea extendidos imágenes de enfoque de 4 planos focales para cada uno de los canales.
3. RGB de superposición
En un último paso de las imágenes enfoque ampliado de los 3 canales se combinan para dar lugar a un final de RGB-superposición de imágenes.
4. La detección automática neuromast
Una herramienta de reconocimiento de patrones (LabView rápida herramienta de prototipado IA) identifica neuromastos dentro de las superposiciones de imágenes RGB y crea un área de interés definida empíricamente en torno a los neuromastos.
5. Cuantificación
Dentro del área de interés definida empíricamente que rodea neuromastos heridos rojos leucocitos fluorescentes refleja en forma de píxeles de color rojo) se obtuvo como resultado de una lectura primaria de p orcentaje una razón o por ccupied eukocytes l (Paol). En promedio 95,27 ± 2,11% (FDA1) y 95,12 ±1,56% (FDA2) de pozos (larvas) se han detectado correctamente y posteriormente se han sometido a procesamiento de datos adicional. La salida de datos en bruto (Paol para cada neuromast detectado) se almacena en un archivo txt y sirve como la entrada de datos para las secuencias de comandos de MATLAB que procesan los datos en bruto más.
12. Procesamiento de Datos
1. Imaps
Evaluar el éxito de los experimentos individuales mediante la visualización gráfica de la Paol salida de datos en bruto en un código de color puede ser realizado con los mapas de la inflamación llamados (IMAPS) (Figura 2). Verde brillante refleja un alto índice inflamatoria inicial, el negro indica que no hay inflamación. Esta rápida visión general permite la rápida identificación de los experimentos fallidos, que luego pueden ser excluidos de los análisis de datos adicionales.
2. Un promedio de los controles
Cada placa contiene 320 compuestos experimentales que refleja unalos datos de un solo punto por compuesto y el tiempo de punto, así como 32 controles positivos y negativos, respectivamente. El control de 32 repeticiones son en promedio y desviación estándar se calcula. Para los controles sólo puntos de datos dentro de 2 desviaciones estándar están incluidos.
3. Normalización
La normalización se lleva a cabo mediante el análisis de hoja de cálculo. El valor promedio de DMSO, siendo el control negativo, se pone a 0 y la más alta Paol promediada para el control de cobre se pone a 1, de modo que la diferencia máxima entre el control positivo y negativo se pone a 1. Paol Cada compuesto se interpolados o extrapolados linealmente a los controles respectivos en la placa experimental.
4. Final de lectura: el índice inflamatorio
Después de suficientes experimentos replicados (es decir, 15) han llevado a cabo, normalizó los datos brutos de replicar los experimentos se hacen un promedio, lo que resulta en un final de lectura - la respuesta inflamatoriaíndice. El índice inicial inflamatoria del control de cobre comienza a 100% para el tiempo cero punto y se correlaciona a la hora de inicio de adquisición de imagen (90 minutos después del tratamiento inicial de cobre).
5. Ajuste monotónico regresión exponencial
Debido a la resolución de la inflamación a través del tiempo se realiza un ajuste monotónico exponencial de regresión no lineal hacia la inflamación inicial mediante el uso de 
- Un 0 es una medida de la respuesta inicial en t = 0, un 1 está relacionada con la pendiente de la magnitud en el tiempo.
6. 2-D función de espacio de parcela (Figura 4)
Para generar el espacio de características, una regresión no lineal se aplica y un grupo-análisis divide el espacio de características en regiones características, permitiendo así la identificación automática de candidatos interesantes de diferentes inmuno-moduladores categorías (anti-inflammatteoría, la lucha contra la resolución, pro-inflamatoria, a favor de la resolución). Todos los compuestos se muestran en la parcela 2-D basado en los parámetros de un 0 y un 1.
13. Manipulación y almacenamiento de datos
Nuestros datos rutinas de manejo de crear páginas web para visualizar y representar a las pantallas de este tipo de fármacos que proporcionan una visión rápida de la imagen y procesamiento de datos los resultados de los pasos, así como una vista detallada cuando sea solicitado por el usuario 10. Los enlaces blandos a otros relevantes bases de datos heterogéneas biológicas y químicas se integran también para proporcionar un recurso valioso para los estudios comparativos y la novela 11. Por estas rutinas, normas de datos adecuados y metainformación se establecen para el almacenamiento a largo plazo de estos datos.
14. Los resultados representativos
En una pantalla de piloto se analizó una biblioteca que consta de 640 aprobado por la FDA conocidos compuestos bioactivos de los efectos en la iniciación, progresión o resolución de una Granulomatosisrespuesta inflamatoria ocytic. Sobre la base de los efectos observados se clasifican 4 tipos de fenotipos moduladores inmunes que pueden ser indicativos de los diferentes modos de acción: anti-inflamatorios (1), anti-resolución (2), pro-inflamatorias (3) y pro-resolución (4) , que puede ser descrito con los parámetros de un 0 y un 1, que surgen de un ajuste de regresión no lineal monotónica (e ao + alx -) hacia la inflamación inicial. Un 0 representa la magnitud de la respuesta inflamatoria, mientras que un 1 caracteriza a la pendiente de la curva y, por tanto describe la resolución inflamación. Viendo todos los compuestos en una parcela de 2-D característica espacial (un 1 vs un 0) permite la identificación automática de los candidatos de golpe de las categorías moduladores inmunes diferentes (Figura 3).
45 de 640 compuestos ejercida significativo efecto anti-inflamatorio al reducir el índice inflamatorio inicial a 50% o menos. Dentro de this categoría encontramos 6 compuestos pertenecientes a la clase farmacológica de la no-esteroides anti-inflamatorios no esteroideos (AINE), lo que confirma la validez de nuestro enfoque. Sin embargo, los AINE no clasificado entre los más potentes fármacos antiinflamatorios. Aparte de los AINE se encuentran varias clases adicionales de drogas farmacológicas como, por ejemplo, los bloqueadores de los receptores de angiotensina (ARA II), antibióticos e inhibidores de la bomba de protones.
7 compuestos cumplieron con los criterios mínimos definidos empíricamente para los potenciales resolución a favor de las drogas.
18 drogas que ejerce un efecto proinflamatorio, lo que resulta en el reclutamiento de leucocitos exagerada a neuromastos lesionados en comparación con los controles positivos.
Sólo dos compuestos impedido la resolución oportuna de la respuesta inflamatoria.
El efecto antiinflamatorio de los candidatos afectados varios (candidatos ejemplares desde arriba mencionadas clases de medicamentos farmacológicos) de la pantalla del piloto de could ser confirmada de manera dosis-dependiente en los sucesivos ensayos de Chin secundarias (datos no mostrados). Una segunda prueba de 4 potenciales resolución a favor de las drogas no ha confirmado el modo indicado de acción como ejercida en la pantalla principal. 2 de los fármacos tenían un ligero potencial anti-inflamatorio en concentraciones más altas (20 mM). Un tercer fármaco mostraron una marginal no dependiente de la dosis efecto anti-inflamatorio en concentraciones de fármaco que van desde 5 hasta 20 mM. El cuarto fármaco no tuvo efecto sobre la respuesta inflamatoria a las concentraciones ensayadas.
Figura 1. Flujo de trabajo de la prueba de la barbilla. Individual compuesto de transgénicos cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 larvas (3 DPF) se distribuyen manualmente en placas de microtitulación de 384 pocillos. Las drogas se añadieron simultáneamente a cada pocillo utilizando una estación de trabajo compacta Zephyr manejo de líquidos. Las placas de ensayo se incuban a continuación durante 1 hora a 29 ° C. El tratamiento con CuSO 4
Figura 2. . Vista general del cuadro de imágenes en bruto La figura muestra las imágenes en bruto de 4 planos focales (Z = 0 - 3) a distancias de 50 m en los canales de Cy3 (izquierda) y las buenas prácticas agrarias (derecha), respectivamente. Las flechas (Z = 1,2) indican neuromastos ejemplares, puntas de flecha (Z = 1,2) apuntan a los leucocitos agrupados en torno a neuromastos.
Figura 3. Mapas de la inflamación (IMAPS) El éxito de los experimentos individuales pueden ser evaluadas en imaps que reflejan la respuesta inflamatoria (datos brutos) en un código de colores: verde brillante. Refleja una inflación inicial alta la respuesta involucrados en procesos inflamatorios, el negro indica que no hay inflamación en el punto de tiempo imaps 0 (izquierda) y el tiempo-el punto 5 (derecha) indican claramente si un experimento se debe incluir en la información adicional.. Controles de cobre (fila 13 y 24) se muestran en diferentes tonos de verde, mientras que el control de los pozos de DMSO (fila 1 y 12) aparecen en color verde oscuro o negro. A la hora del punto 5, la inflamación está casi resuelto en los controles de cobre, ahora se indica en tonos oscuros de verde o negro. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 4. 2-D característica gráfica de espacio de 320 compuestos de un FDA aprobó la biblioteca y sus respectivos controles. Todos los pozos compuestos se pueden mostrar en una gráfica característica de 2-D el espacio sobre la base de los parámetros de un 0 y un 1, que surgen de una relación no lineal regresión de ajuste (d/4203/4203eq1.jpg "alt =" Ecuación 1 "/>) hacia la inflamación inicial. Esta parcela espacio de características permite la identificación automática de los candidatos interesantes que pertenecen a uno de los siguientes 4 inmuno-moduladores categorías que pueden ser indicativos de las drogas 'modo de acción:. anti-inflamatorio (1), anti-resolución (2), pro-inflamatorias (3) y en favor de la resolución (4) Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Discussion
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethyl sulphoxide | Carl Roth GmbH Co KG | A994.2 | |
| Copper(II) sulphate anhydrous | Carl Roth GmbH Co KG | PO23.1 | |
| FDA approved drug library | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
| 384 microwell plate Non-binding, μClear | Greiner | 781906 | black |
| Olympus scan^R | Olympus | ||
| Zephyr Compact Liquid Handling Workstation | Caliper |
References
- Peterson, R. T., Fishman, M. C. Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish. Methods Cell Biol. 76, (2004).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).
- Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish. J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).
- Martin, J. S., Renshaw, S. A. Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease. Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
- Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
- D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish. BMC Biol. 8, 151 (2010).
- Haas, P., Gilmour, D. Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line. Dev Cell. 10, 673-680 (2006).
- Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge. Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).
- Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. Harvester': a fast meta search engine of human protein resources. Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).
