Summary
Burada immün-modülatör biyoaktif bileflikler tanımlanmasını amaçlayan bir roman yüksek içeriği kimyasal yolla oluşan inflamasyon testi açıklar. Biz başarıyla inflamatuvar yanıt olarak daha fazla veri işleme, analiz, madencilik ve depolama otomatik ölçümü sağlayan özel geliştirilmiş yazılım komut ile otomatik mikroskopi birleştirdik.
Abstract
Zebrafish larvaları, küçük boyutu ve işleme ve gözlem göreceli olarak kolay ve aynı zamanda, bir verildiğinde sadece bileşiklerin banyo su ilave edilebilir ve kolaylıkla emilir olması nedeniyle küçük molekül ekranlarını 1,2 tüm hayvanlar için özellikle uygundurlar <% 1 DMSO çözüm. Zebra balığı larva ve lökositlerin floresan proteinleri transgenik hatlarının durumu optik netlik nedeniyle, zebrabalıkları in vivo akut inflamatuvar yanıt izleme benzersiz bir avantaj sunuyoruz. Sonuç olarak, yüksek verimlilik ile immün-modülatör bileşiklerin tanımlanması amaçlayan yüksek içeriği küçük molekül ekranlar için zebrabalıkları kullanan, inflamasyon indüksiyon senaryoları fin dokusunda lokalize nickler örneğin bir sarısı yüzeyine yönlendirilmiş lazer hasarı düşündüren, 3-6 öne sürülmüştür embriyoların 7 veya tailfin amputasyon 3,5,6. Bu yöntemlerin ana dezavantajı, ancak idimanuel larva manipülasyon gereksinimi dolayısıyla yüksek verimli tarama önlenmesi, yaralama ikna etmek. Kimyasal yolla oluşan inflamasyon (Chin) testi 8 tanıtılması bu engelleri ortadan kaldırdı. Yaralama verdirdiler olduğundan kimyasal aynı anda tedavi edilebilir embriyo sayısı neredeyse sınırsızdır. Bakır sülfat ile zebrabalıkları larva Geçici tedavi seçici yanal çizgi sistemi ve yaralı neuromasts hızlı granülosit işe sonuçları saç hücrelerinde hücre ölümüne neden olur. Inflamatuvar yanıt bileşik transgenik cldnB :: GFP / lysC :: neuromast hücrelerin yanı sıra kırmızı floresan proteini etiketleme granülositler bir yeşil floresan proteinini ifade DsRED2 6,9 zebrabalıkları larvaları kullanılarak gerçek zamanlı olarak takip edilebilir.
Hem yüksek-içeriği ve yüksek verimlilik analizleri izin verecek bir tarama stratejisi hazırlamak için biz robot sıvı taşıma ve kombine otomatik MICR tanıttıözel geliştirilen yazılım komut ile oscopy. Bu script yaralı yeşil floresan neuromasts çevreleyen ampirik tanımlanan alan içinde kırmızı floresan lökositler tarafından işgal yüzde alanı puanlama inflamatuvar yanıtın otomatik ölçümü sağlar. Ayrıca, otomatik veri işleme, taşıma, görselleştirme ve depolama tüm MATLAB ve Python geliştirilen özel dayanmaktadır.
Kısaca, bir granülositik inflamatuvar yanıt başlaması, ilerlemesi veya çözünürlüğü üzerindeki etkisi için kimyasal bileşiklerin test sağlayan otomatik bir HC / HT ekranı tanıtmak. Bu protokol, doğuştan gelen bağışıklık yanıtının orkestrasyon yer uyuşturucu mekanizmaları ve yolların daha derinlemesine analizler için iyi bir başlangıç noktası sunmaktadır. Gelecekte, ilaç keşfi önceki aşamalarında dayanılmaz toksik ya da off-hedef etkilerin belirlenmesi yardım ve böylece ilaç gelişimi için prosedürel riskleri ve maliyetleri azaltabilir.
Protocol
1. Hayvan Taşıma
Çene tahlil kullanımı 3 dpf'e larva homozigot çift transgenik cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 ve AB (yabani tip) balıklar arasında grup çiftleşmelerin doğan için. Doğal yumurtlama tarafından embriyosu toplamak ve 29 bunları yükseltmek ° Petri kaplarında E3 ortamda C (5 mM NaCl, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO 4 ve mavi% 0.1 metilen, pH 7.0 ile dengelenmiş). Bu plaka başına 50-70 geçmeyen embriyo yoğunluğunu korumak için gereklidir.
2. Larva Sıralama
Floresan muhabiri ifadesi, spontan inflamasyon ve uygun yaşa bağlı gelişim için bir floresan stereoskop altındaki tüm larva kontrol edin.
3. Eleme Orta Hazırlama (Daima taze hazırlamak)
DMSO (1% final) ve MS222 (0.05 g / l) ile desteklenmiş metilen mavi olmadan E3 orta hazırlayın.
4. CuSO4Hazırlama (Daima taze hazırlamak)
İlk CuSO 4 tarttın (M r = 159.6 g / mol) dH ve 20 mM stok solüsyon hazırlanır 2 O. E3/DMSO (% 1) / MS-222 120 uM CuSO 4 çalışma çözeltisi (20 mM stok çözeltisinden) hazırlayın. Işıktan CuSO 4 çözümü koruyun.
5.. 384-iyi Plaka Hazırlama (Greiner 384 Şey Mikroplaka)
Bir ters pipetle her oyuğa E3/DMSO (% 1) / MS-222 ile 20 ul ön-ekleyin. Artan bir pipet ucu delik herhangi bir yaralama maruz kalmadan dikkatli embriyoların işlemek için gerekli olduğunu, bu delik 2 mm uç kesim tarafından yapılır. Her iyi (tedavi edilmemiş kontrol için 84 ul) orta ve 74 ul tek larva aktarın. Gerekirse, ayrıca içinde bir yanal konuma yönlendirmeye larvalar, esnek bir Eppendorf Microloader pipet ucu (; 5242 956,003 Eppendorf) kullanılarak.
Bir robot sıvı ile bütün Aşağıdaki sıvı taşıma adımları gerçekleştirinlarvaların hepsi eşzamanlı tedavi sağlamak için iş istasyonu taşıma.
6. İlaç Tedavisi
Aşağı pipetleme tarafından ilaç stok plaka bileşiklerin 5 kez karıştırın. Her bir kuyuya 7.5x ilaç stokunun plakası 16 ul ekleyin ve 5 kez karıştırın. Larva yaralanmasını önlemek ve 10 ul / s orta dağıtmak için kuyu içinde ucu konumunu ayarlayın. De içinde ilacın homojen dağılımını sağlamak için kuyu orta 4 kez karıştırın.
7. Kuluçka
29 1 saat için tarama plakası inkübe ° C ışıktan yanı CuSO 4 gibi bileşiklerin korumak için alüminyum folyo ile kaplı.
8. Kimyasal Yaralama
Negatif kontrol, mix 4 kez hariç her kuyuya 120 mM CuSO 4 çalışma çözeltisi 10 ul ekleyin ve 29 1 saat boyunca tekrar inkübe ° C
9. Yıkama
Bana 80 ul çıkarın ve alışverişi her birinden fenoksimetilpenisilin de iki kez (20 ul adımlarla) bileşikleri kaldırmak ve CuSO ila 4 seviyesindedir.
10. Görüntü Alma
90 dakika sonra ilk bakır tedavisi: bir ters otomatik mikroskobu (Olympus tarama ^ R yani) görüntü alımı başlatabilirsiniz. Sağ ve sol posterior lateral hattı neuromasts görünür olması için ilk z seviyesini ayarlayın. Görüntü her yanı bir kez kanallar aydınlık saatte, 4 odak düzlemleri (50 mikron mesafe) Cy3 ve GFP 4x nesnel (NA = 0.13) kullanarak.
Görüntü ve veri işleme ile ilgili ek bilgiler talep üzerine mevcuttur.
11. Görüntü İşleme
1. Sıralama Veri
Ham görüntüleri bizim özel LabView yazılımı komut ile işlenir. Görüntü işleme hattında ilk operasyon kanalı, iyi ve zaman noktası bilgilerini tarafından mikroskop oluşturulan veri klasörü ham görüntülerin sıralama edilir.
ove_step "> 2. Genişletilmiş odakDaha sonra yazılım kanalların her biri için 4 odak düzlemleri uzanan odak görüntüler oluşturur.
3. RGB-bindirme
Son bir adım olarak 3 kanal arasından genişletilmiş odak görüntüleri son RGB-bindirme görüntüsüne yol için birleştirilir.
4. Otomatik algılama neuromast
Bir örüntü tanıma aracı (LabView Rapid IA prototip aracı) RGB bindirme görüntüleri içinde neuromasts tanımlayan ve neuromasts etrafında bir ilgi ampirik olarak tanımlanan alanı oluşturur.
5.. Niceleme
Yaralı neuromasts çevreyi ilgilendiren ampirik olarak tanımlanan alan içinde kırmızı floresan lökositlerin (kırmızı piksel olarak yansıyan) l eukocytes (Paol) tarafından ccupied p ercent bir rea o bir ilköğretim okuma sonuçlanan puanlanır. Ortalama 95,27 ±% 2.11 (FDA1) ve 95,12 ± AçıkKuyular (larva) ve% 1.56 (FDA2) doğru tespit edilmiş ve daha sonra daha fazla veri işleme tabi tutulmuştur. Ham veri çıkışı (her bir tespit için neuromast Paol) bir txt dosyası saklanır ve daha fazla ham verilerin işlenmesi MATLAB komut için veri girişi olarak hizmet vermektedir.
12. Veri İşleme
1. IMAPS
Bir renk kodu ham veri çıkışı Paol grafiksel görselleştirme bireysel deneyler başarı değerlendirilmesi sözde inflamasyon haritaları (IMAPS) (Şekil 2) ile gerçekleştirilebilir. Parlak yeşil, yüksek bir başlangıç inflamatuvar indeks yansıtır; siyah bir inflamasyon gösterir. Bu hızlı bakış sonra daha fazla veri analizleri dahil edilebilir başarısız deneyler, hızlı tespiti için izin verir.
2. Kontrollerin ortalama
Her deneysel plaka yansıtan 320 bileşikler içerirtek bir veri sırasıyla, bileşik ve zaman noktası yanı sıra 32 pozitif ve negatif kontrollerin başına gelin. 32 kontrol çoğaltır ortalama ve standart sapması hesaplanır vardır. Kontroller için 2 standart sapma içinde, sadece veri noktaları dahildir.
3. Normalleştirme
Normalizasyon tablo analiz yapılır. Negatif kontrol olmak DMSO ortalama değeri, 0 olarak ayarlanır ve bakır denetimi için en yüksek ortalama Paol pozitif ve negatif kontrol arasındaki maksimum fark 1 olarak ayarlanır, böylece 1 olarak ayarlanır. Her bir bileşiğin Paol doğrusal enterpolasyon veya deneysel plaka üzerinde ilgili denetimlere extrapolated.
4. Final okuma-out: İnflamatuar endeksi
Yeterli tekrarlanan deneyler (yani 15) yapılmıştır sonra, tekrarında deneyler normalize ham veri okuma-out son bir sonuçlanan ortalaması alınır - inflamatuarindex. Bakır kontrol ilk inflamatuvar indeks zaman sıfır noktası için% 100 ile başlar ve görüntü alımı başlangıç zamanı (90 dakika ilk bakır tedavi sonrası) ile doğrudan ilintilidir.
5.. Monoton üstel regresyon uydurma
Zamanla iltihap çözünürlüğü dolayı biz kullanarak ilk iltihabı doğru monoton üstel doğrusal olmayan regresyon uydurma gerçekleştirmek 
- Bir 0 t = 0 azından başlangıçtaki tepkisi için bir ölçüsü olan bir 1 saat boyunca büyüklükte eğimi ile ilgilidir.
6. 2-B özelliği alanı arsa (Şekil 4)
Özelliği alanı oluşturmak için bir non-lineer regresyon uygulanır ve küme analizi, böylece farklı immün-modülatör kategoriler ilginç adaylar otomatik tanımlama (anti-inflammat sağlayan karakteristik bölgeye özelliği alanı bölerORY, anti-çözünürlük, pro-inflamatuar, pro-çözünürlük). Tüm bileşikler parametreler bir 0 ve bir 1 göre 2-D plot gösterilir.
13. Veri İşleme ve Depolama
Bizim veri rutinleri adımları 'sonuçları yanı sıra kullanıcı 10 tarafından talep edilen detaylı bir görünüm işleme hızlı bir görüntünün genel ve veri sağlayarak, uyuşturucu ekranları görselleştirmek ve temsil etmek için web sayfası yaratmak taşıma. Diğer ilgili heterojen, biyolojik ve kimyasal veritabanlarına Yumuşak bağlantıları karşılaştırmalı ve roman çalışmaları 11 için değerli bir kaynak sağlamak için de entegre edilmiştir. Bu rutinleri tarafından, uygun veri standartları ve metainformation bu verilerin uzun süreli saklanması için ayarlanır.
14. Temsilcisi Sonuçlar
Bir pilot ekran biz 640 oluşan bir kütüphane analiz FDA granül başlaması, ilerlemesi veya çözünürlüğü üzerindeki etkileri bilinen biyoaktif bileşikler onaylıocytic inflamatuvar yanıt. Biz farklı etki mekanizmaları göstergesi olabilir immun düzenleyici fenotipleri 4 tip sınıflandırılır gözlenen etkileri dayanarak: anti-inflamatuar (1), anti-çözünürlük (2), pro-inflamatuar (3) ve pro-çözünürlük (4) , olduğu bir tekdüze olmayan regresyon uydurma (e ao + Alx -) kaynaklanan parametreler bir 0 ve 1 ile ifade edilebilir başlangıç enflamasyon doğru. Bir 1 eğrisinin eğimi karakterize ve böylece enflamasyon çözünürlüğü açıklar ise A 0 enflamatuvar yanıt büyüklüğünü temsil eder. 2-B özelliği alanı arsa (a 0 vs 1) tüm bileşikler gösteriliyor farklı immun düzenleyici kategorilerden vurdu adayları (Şekil 3) otomatik tanımlama sağlar.
640 bileşikler dışında 45% 50 veya daha az başlangıç inflamatuvar indeks azaltarak önemli bir anti-inflamatuar etki yapmıştır. Thi içindekategorisindeki biz 6 bileşikler bizim yaklaşımın geçerliliğini doğrulayan non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar (NSAID), farmakolojik sınıfına ait bulundu. Ancak, NSAİİ en güçlü anti-inflamatuar ilaçlar arasında değildir sırada yer aldı. Dışında NSAİİ ile biz örneğin Anjiyotensin reseptör blokerleri (ARB), antibiyotik ve proton pompa inhibitörleri gibi birçok ek farmakolojik ilaç sınıfları bulundu.
7 bileşiklerin potansiyel yanlısı çözünürlük ilaçlar için ampirik olarak tanımlanan eşiği kriterlerini karşıladı.
18 ilaç, pozitif kontroller ile karşılaştırıldığında yaralandı neuromasts abartılı lökosit göçünün neden bir pro-inflamatuar etki yapmıştır.
Sadece 2 bileşikleri inflamatuvar yanıt zamanında çözünürlük önledi.
Pilot ekran Coul birçok hit adayların anti-enflamatuar etkisi (yukarıda belirtilen farmakolojik ilaç sınıfları örnek adayları)d sonraki ikincil Chin testler (veriler gösterilmemiştir) doza bağımlı bir şekilde teyit edilmesi. Birincil ekran olarak uygulanan 4 potansiyel yanlısı çözünürlüklü ilaçların yeniden test eylem belirtilen kipi teyit etmedi. İlaçların 2 daha yüksek konsantrasyonlar (20 uM) hafif bir anti-inflamatuar bir potansiyele sahip olduğunu. 20 uM - üçüncü bir ilacın 5 arasında değişen konsantrasyonlarda ilaç marjinal bir non-doza bağımlı bir anti-enflamatuar etkisi sergilemiştir. Dördüncü ilaç test edilen konsantrasyonlarda inflamatuvar yanıt üzerine etkisi yoktur.
Şekil 1.. Chin testin Workflow. Bireysel bileşik transgenik cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larva (3 dpf) manuel 384-iyi microtiter plakalar dağıtılır. İlaçlar iyi bir Zephyr Kompakt Liquid Handling Workstation kullanarak her aynı anda eklenir. Tahlil plakaların 29 daha sonra 1 saat boyunca inkübe edilirler ° C. CuSO 4 ile muamele
Şekil 2. . Kanalları sırasıyla Cy3 (solda) ve GFP (sağda), 50 mikron mesafelerde - Genel ham görüntülerin resmi rakam 4 odak düzlemleri (3 Z = 0) ham görüntüleri gösterir. Oklar (Z = 1,2) neuromasts etrafında kümelenmiş lökosit örnek neuromasts, ok uçları (Z = 1,2) noktasına işaret etmektedir.
Şekil 3. İnflamasyon Haritalar (IMAPS) bireysel denemelerin başarısı bir renk kodu inflamatuvar yanıt (ham veri) yansıtan IMAPS biçimde tespit edilebilir. Parlak yeşil, yüksek bir başlangıç enflasyon yansıtır mmatory yanıt; siyah bir inflamasyon gösterir timepoint 0 (solda) ve zaman noktası 5 (sağ) IMAPS açıkça bir deney daha fazla veri işleme dahil edilmelidir olmadığını göstermektedir.. DMSO kontrolü kuyular (satır 1 ve 12), koyu yeşil veya siyah görünür, oysa Bakır kontrolleri (satır 13 ve 24), yeşil tonlarda değişen gösterilmez. Zaman noktası 5 anda, inflamasyon hemen şimdi yeşil veya siyah koyu tonlarda gösterildiği, bakır kontrolleri giderildi. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. FDA 320 bileşiklerin 2-D özelliği, uzay komplo kütüphane ve kendi kontrolleri onayladı. Tüm bileşik kuyular doğrusal olmayan bir ortaya çıkan parametreleri 0 ve 1, dayalı bir 2-D özelliği, uzay komplo görüntülenebilir regresyon uydurma (d/4203/4203eq1.jpg "alt =" ilk inflamasyon doğru / Denklem 1 ">). Bu özellik alanı arsa ilaçların göstergesi olabilir aşağıdaki 4 immün-modülatör kategorilerden birine ait ilginç adayların otomatik tanımlama sağlar eylem 'modu:. anti-inflamatuar (1), anti-çözünürlük (2), pro-inflamatuar (3) ve pro-çözünürlük (4) büyük rakamı görmek için buraya tıklayın .
Discussion
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethyl sulphoxide | Carl Roth GmbH Co KG | A994.2 | |
| Copper(II) sulphate anhydrous | Carl Roth GmbH Co KG | PO23.1 | |
| FDA approved drug library | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
| 384 microwell plate Non-binding, μClear | Greiner | 781906 | black |
| Olympus scan^R | Olympus | ||
| Zephyr Compact Liquid Handling Workstation | Caliper |
References
- Peterson, R. T., Fishman, M. C. Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish. Methods Cell Biol. 76, (2004).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).
- Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish. J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).
- Martin, J. S., Renshaw, S. A. Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease. Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
- Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
- D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish. BMC Biol. 8, 151 (2010).
- Haas, P., Gilmour, D. Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line. Dev Cell. 10, 673-680 (2006).
- Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge. Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).
- Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. Harvester': a fast meta search engine of human protein resources. Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).
