Summary
يتم عزل نواة القلب عن طريق الترسيب وكثافة immunolabeled مع الأجسام المضادة ضد مادة محيط بالمريكز 1 (PCM-1) لتحديد وفرز النوى cardiomyocyte بواسطة التدفق الخلوي.
Abstract
وقد تم تحديد نوى cardiomyocyte تحديا في المقاطع النسيجية حيث أن معظم استراتيجيات الاعتماد فقط على البروتينات علامة حشوية 1. أحداث نادرة في myocytes القلب مثل انتشار وموت الخلايا المبرمج يحتاج الى تحديد دقيق للنواة خلية عضلية قلبية على تحليل تجديد الخلوية في التوازن وفي الحالات المرضية 2. هنا، ونحن نقدم وسيلة لعزل نواة cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة بواسطة الترسيب كثافة والوسم المناعي مع أجسام مضادة ضد مادة محيط بالمريكز 1 (PCM-1) واللاحقة الفرز التدفق الخلوي. هذه الاستراتيجية تسمح للتحليل إنتاجية عالية والعزلة مع الاستفادة من العمل بشكل جيد على قدم المساواة في الأنسجة الطازجة والمجمدة المواد الأرشيفية. هذا يجعل من الممكن لدراسة المواد التي تم جمعها بالفعل في biobanks. هذه التقنية قابلة للتطبيق واختبارها في مجموعة واسعة من الأنواع ومناسبة للتطبيقات المصب متعددة مثل الكربون 14 التي يرجع تاريخها 3، خلية-CYCLE تحليل 4، تصور من نظائرها ثيميدين (على سبيل المثال BrdU وإيدو) 4، وتحليل transcriptome وجينية.
Protocol
1. العزلة من نوى القلب
- أنابيب منبذة فائقة معطف (أنابيب الطرد المركزي بيكمان # 363664) مع 10 مل من 1٪ حل طلاء جيش صرب البوسنة / برنامج تلفزيوني. تتويج الأنابيب والسماح لهم بالتناوب لمدة 30 دقيقة في محور دوار أنبوب. إزالة حل طلاء، والسماح مطلوب من أجهزة الطرد المركزي أنابيب الهواء الجاف (أنبوب واحد في قلب فأر لتحليل قلوب ماوس واحدة، قلوب بالتناوب الماوس تصل إلى 5 أو 1 غرام من أنسجة القلب من مختلف الأنواع ويمكن (على سبيل المثال الإنسان) يمكن معالجتها في أنبوب واحد).
- يجب أن يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية على الجليد. تشريح البطين الأيسر من القلب الماوس طازجة أو مجمدة مبكرة مع مشرط. علما، هو الأمثل لهذا البروتوكول قلب فأر ولكن يمكن أيضا أن تتكيف مع الفئران أو قلب الإنسان. بدلا من ذلك، استخدام ما يصل الى 1 غرام من أنسجة القلب من مختلف الأنواع.
- تقليم عينة في مقصورات صغيرة مع مشرط.
- نقل القطع الأنسجة في أنبوب 50 مل مليئة الصقر 15 مل من عازلة تحلل.
- تجانسأنسجة القلب مع T-25 الخالط مسبار الترا Turrax (IKA) في 24000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية.
- تمييع جناسة مع حجم مساو من عازلة تحلل إلى 30 مل.
- استخدام douncer زجاج (40 مل) إلى مزيد من التجانس والأنسجة وخالية من النواة. أداء 8 السكتات الدماغية مع مدقة تخليص كبير.
- تمرير نواة عزل الخام من خلال 100 ميكرون و 70 ميكرومتر شبكة النايلون مصفاة خلية دينار بحريني (العلوم البيولوجية)، على التوالي.
- تدور باستمرار على عزل نواة الخام في جهاز للطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية) في 700 x ج لمدة 10 دقيقة.
- إزالة طاف بعناية بواسطة أنابيب للقلب ومسح داخل أنبوب مع منشفة ورقية. يجب الحرص على عدم تعكير صفو كريات النوى.
- حل نوى الخام عزل في 5ml من عازلة السكروز بواسطة pipetting الحل عدة مرات صعودا ونزولا. إضافة مزيد من 25 مل من عازلة السكروز إلى بيليه المنحل.
- إضافة 10 مل من عازلة السكروز الطازجة إلى أنبوب منبذة فائقة المغلفة (انظر الخطوة 1.1). </ لى>
- تراكب بعناية المضافة 10 مل من عازلة السكروز مع بيليه نوى معلق في حل العازلة السكروز من الخطوة 1.9.
- تحقيق التوازن في أنابيب الطرد المركزي قبل وضعها في الدوار مجانا JS13.1 يتأرجح ووضع الدوار في جهاز الطرد المركزي عالية السرعة (بيكمان أفانتي S-25).
- تدور عينة النوى في 13000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- عندما تدور انتهت، وإزالة الأنابيب بعناية من الدوار وتجاهل طاف بواسطة أنابيب للقلب والقضاء على ما تبقى من الحطام داخل الأنابيب مع منشفة ورقية.
- حل كريات النوى في 1ml من المخزن تخزين النوى (NSB زائد عازلة). ملاحظة: NSB زائد يحتوي على 1.5 ملي السبيرمين باعتبارها عامل استقرار الحمض النووي.
- المضي قدما في الخطوة 2.1، المناعية من نوى cardiomyocyte.
2. المناعية عن التدفق الخلوي
- إعداد سيطرة سلبية على المناعية. يأخذ قسامة من خارج ميكرولتر 20 من عينة نوى وDD 980 ميكرولتر من جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى العازلة.
- إضافة مادة مضادة للمحيط بالمريكز 1 الأضداد (أرنب المضادة للPCM-1، الأجسام المضادة أطلس) لعينة النوى في التخفيف من 1:500 إلى نوى immunolabel cardiomyocyte. إضافة الجسم المضاد isotype في تخفيف نفس الأجسام المضادة لمكافحة PCM-1 لسيطرة السلبية، التي أعدت في الخطوة 2.1.
- احتضان سيطرة السلبية وأنبوب عينة عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
- غسل سيطرة السلبية وعينة على الأقل مرة واحدة مع جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت (تدور أسفل الأنابيب في جهاز الطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية) في 700 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف وحل كريات النوى في 1 مل من جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت).
- إضافة المضادة للأرنب الأجسام المضادة الثانوية فلوري (FITC أو APC) إلى سيطرة السلبية وأنبوب عينة في التخفيف من 1:1000.
- احتضان سيطرة السلبية وأنبوب العينة في درجة مئوية 4 ل 1 ح.
- غسل سيطرة السلبية وعينة على الأقل مرة واحدة مع جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت (تدور أسفل الأنابيب في جهاز الطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية) في 700 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف وحل كريات النوى في 1 مل من جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت).
- المضي قدما في تحليل تدفق cytometric والفرز.
3. تدفق الخلوي
- أنابيب معطف جمع النوى (فالكون 15 مل) مع حل جيش صرب البوسنة / PBS 1٪ قبل البدء في التدفق الخلوي الفرز كما هو موضح في الخطوة 1.1.
- تصفية العينة ومراقبة سلبية من خلال مصفاة ميكرومتر الخلية 30 و تحميل لأول مرة سيطرة السلبية على تدفق عداد الكريات دينار بحريني (تدفق). تعريف البوابة الأولى والثانية لتحديد نوى و singlets (نواة واحدة)، استنادا إلى الأمام مبعثر (FSC)، إلى الأمام عرض نبض مبعثر (FS نبض العرض) والتشرذم الجانب (SSC) (الشكل 2a و ب). ويمكن إضافة الحمض النووي وصمة عار (DRAQ5 (1:500)) إلى نموذج يساعد على التعرف على سكان نوى في البداية.
- تحميل عينة immunolabeled وتحديد بوابة ثالثة لعزل نواة cardiomyocyte (PCM-1-positve) من غير cardiomyocyte نوى (PCM-1-سلبية). بدء الفرز(الشكل 2C ود).
اختياري: من أجل تحليل محتوى الحمض النووي (الصيغة الصبغية) وإجراء تحليل دورة الخلية إضافة الحمض النووي المناسب وصمة عار على النوى (على سبيل المثال هويشت 33342 أو DRAQ5) (الشكل 2E).
- بعد الفرز التدفق الخلوي، ووضع نواة على الجليد وإعادة تحليل لتحديد نقاء فرز (الشكل 3A و ب).
- تدور باستمرار نوى فرزها في أنابيب جمع في 1500 XG في جهاز للطرد المركزي المبردة لمدة 15 دقيقة.
- حل كريات النوى في منطقة عازلة متوافقة مع تطبيق المصب.
4. ممثل النتائج
ويمكن تقييم التشكل نوى وسلامتها من قبل بقع الحمض النووي وتصور بواسطة المجهر (الشكل 1). ويمكن تقييم نجاح PCM-1 وضع العلامات بواسطة المجهر epifluorescence والتدفق الخلوي (الشكل 1 والشكل 2C ود). PCM-1-positiهاء، وينبغي أن يفصل تماما من السكان سلبية عن بعضها البعض (الشكل 2C ود). في البطين الأيسر الفئران يجب أن حوالي 30٪ من جميع نوى أن تكون نواة cardiomyocyte (الشكل 2D). ويمكن فرز نقاء يتم تقييمها من خلال إعادة تحليل نوى فرزها (الشكل 3A و ب). وينبغي على حد سواء السكان نواة لديها نقاء فرز تتجاوز 95٪.
الشكل 1. PCM-1 يحدد الأنوية cardiomyocyte. ملطخة نوى القلب (أ) مع الأجسام المضادة للPCM-1 (ب) وNkx2.5 (ج) في قلب فأر بالغ. (د) وتحيط PCM-1-وصفت من قبل نواة السيتوبلازم cardiomyocyte (ميوسين الثقيلة سلسلة (MHC))، وأعرب عن عامل النسخ Nkx2.5، وتوثيق وتحديد دقيق للنوى cardiomyocyte بواسطة تلطيخ-1 PCM (الحانات نطاق 20 ميكرون و 10 ميكرومتر (د، أقحم)). (ه) العزلات نوى القلب تصور مع الحمض النووي وصمة DRAQ5. (و و ز) Cardiomyocوصفت نوى yte مع الأجسام المضادة ضد PCM-1 (مقياس شريط 10 ميكرون). علما، ونمط تلطيخ epinuclear من PCM-1 في نواة خلية عضلية في قسم الأنسجة ومعزولة في نوى (سهام).
الشكل 2. فرز تدفق cytometric من نوى cardiomyocyte. (أ) يتم تحديد نوى القلب بواسطة المبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC). (ب) من بوابة ثانية يحدد نواة واحدة من قبل FSC ونبض FS عرض 5. (ج، د) النابضة نيون يسمح للفصل من نوى cardiomyocyte (PCM-1-إيجابي)، وغير cardiomyocyte-(PCM-1-سلبية) نواة من أنسجة القلب. (ه) cardiomyocyte الفأر هي في معظمها (> 80٪) مضاعفا (2N)، فقط مجموعة فرعية صغيرة من رباعي الصيغة الصبغية (4N) 6. علما، العضلية الإنسان تحتوي على تردد أعلى من نوى تعدد الصيغ الصبغية (> 2N) 7،8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحديد دقيق للنوى cardiomyocyte هو أمر حاسم لتحليل عمليات التجدد في عضلة القلب 2،3. تقوم أساسا التقنيات التقليدية لعزل العضلية من الأنسجة جديدة على الهضم الأنزيمي من البروتينات المصفوفة خارج الخلية، وتنقية لاحق من الخلايا الخلالي عن طريق الطرد المركزي بسرعة منخفضة. لا يمكن أن يؤديها تنقية مزيد من العضلية الحية من الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) بواسطة الوسم المناعي مع علامات سطح مثل سيربا 9 أو الأصباغ الميتوكوندريا 10، يمكن تحديد العضلية الثابتة علامات السيتوبلازمية مثل سلسلة ميوسين الثقيلة (MHC) أو البروتينات النووية مثل GATA4 أو Nkx2.5. ومع ذلك، لا يقتصر على التعبير عن Nkx2.5 وGATA4 إلى العضلية الناضجة، ولكن يمكن اكتشافها أيضا في الخلايا الاصلية خلال التنمية، وبعد احتشاء عضلة القلب 11،12. الاستراتيجيات الجينية لتحديد العضلية تظهر أعلى التحديد، ولكن جتطبق annot في النماذج الحيوانية الكبيرة أو البشر 1. وقد أدت القيود المفروضة على الاستراتيجيات القائمة على الاستنتاجات المثيرة للجدل التي تعتمد على القياس الكمي للأحداث نادرة مثل موت الخلايا المبرمج، والانتشار والخيمرية 1،13. وبالتالي، هناك حاجة إلى وضع استراتيجية دقيقة لتحديد وتنقية ناضجة نوى cardiomyocyte متباينة.
هنا، نحن تصف تقنية تنقية استنادا إلى المواد محيط بالمريكز 1 (PCM-1). سابقا، عززنا صلاحية عزل نواة لدينا من خلال اظهار ان ثلاثة علامات نووية مستقلة، PCM-1، القلب تروبونين تي وأنا، وتحديد عدد السكان نفسه cardiomyocyte. 2،3 السكان المنقى وأظهرت لتخصيب عالية من cardiomyocyte منتجات جينية معينة مثل كما troponins القلب، والميوسين بروتين سلسلة ثقيلة وعامل النسخ Nkx2.5 و 2،3 GATA4.
وقد البروتوكول الحالي، بناء على PCM-1، طبقت بنجاح وأو تحليل دوران cardiomyocyte الإنسان والفأر 2،4 فضلا عن تحليل للوضع النسخي cardiomyocyte 2. ونحن نتوقع أن يمكن أيضا أن الاستراتيجية المقدمة تكييفها لعزل الخلايا العضلية من الأنواع الأخرى. PCM-1، وهو بروتين الجسيم المركزي، وإعادة يموضع إلى الغشاء النووي حيث يتراكم ويشكل مصفوفة غير قابلة للحل إلا في myocytes متباينة 2،14 (الشكل 1). التدفق الخلوي يسمح للتحليل سريع غير منحاز من عدد كبير من الخلايا، وهو مطلوب لتحديد أحداث نادرة في العضلية مثل موت الخلايا المبرمج ودورة الخلية اعادة الدخول 15. وعلاوة على ذلك، يمكن أن نظائرها النوكليوتيدات (على سبيل المثال BrdU) أن المقايسات الانتشار القائمة على تطبيقها بسهولة باستخدام تقنية لدينا قدم 4. أسلوبنا له ميزة أنه يمكن تحليل محتوى الحمض النووي لنواة cardiomyocyte واحد (الصيغة الصبغية النووية) في العضلية 16،17 متعدد النوى، والذي يوفر معلومات هامةعلى التمييز بين الازدواجية وcardiomyocyte polyploidisation 6-8. ومع ذلك، نظرا لطبيعة استراتيجيتنا، وهو توصيف multinucleation cardiomyocyte غير ممكن.
مزيد من الطلبات من طريقة عرض من الدراسات التي تركز على تغييرات جينية من لونين، البروتينيات النووية، التفاعلات protein-DNA/RNA وعلى transcriptome النووية 18،19.
بسبب استقرار النوى في تجميد إذابة الأنسجة، ويمكن أيضا عزل نواة قدم استراتيجية يمكن تطبيقها على الأنسجة المجمدة، مما يجعل من الممكن للاستفادة من المواد المؤرشفة من biobanks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نعترف مارسيلو تورو للمساعدة مع التدفق الخلوي. وأيد هذه الدراسة السويدية القلب والرئة مؤسسة، مفوضية الاتحاد الأوروبي "CardioCell" FP7، السويدية مجلس البحوث والتأمينات AFA ومؤسسة آنا ليند. وأيد OB بواسطة جمعية الألمانية للبحوث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Lysis Buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.32 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 2.0 mM EDTA | |||
| 0.5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2. Sucrose buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 2.1 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 1 mM DTT | |||
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.44 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) | |||
| 70 mM KCl | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM spermine | |||
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam | ||
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies | ||
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies | ||
| DRAQ5 | Biostatus | ||
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences | ||
| Glass douncer (40 ml) and pestle "L" | VWR (Wheaton Industries Inc.) | ||
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany | ||
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany | ||
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR | ||
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter | ||
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter | ||
| Influx cytometer | Beckman Coulter | ||
| Tube Rotator | VWR |
References
- Ang, K. L. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).
- Bergmann, O. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).
- Bergmann, O. Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans. Science. 324, 98-102 (1126).
- Walsh, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation. Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).
- Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts. Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).
- Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).
- Adler, C. P., Friedburg, H. Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age. Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).
- Dubois, N. C. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature. 29, 1011-1018 (2011).
- Hattori, F. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7, 61-66 (2010).
- Fransioli, J. Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium. Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).
- Elliott, D. A. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).
- Laflamme, M. A. Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts. Circulation Research. 90, 634-640 (2002).
- Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation. BMC cell biology. 10, 28 (2009).
- Spoelgen, R. A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain. Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).
- Olivetti, G. Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart. J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).
- Okada, S. Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue. Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue. J. Vis. Exp. (20), e914 (2008).
