Summary
Cardiale kernen worden geïsoleerd via dichtheid sedimentatie en immunolabeled met antilichamen tegen pericentriolar materiaal 1 (PCM-1) te identificeren en cardiomyocyten kernen sorteren op flowcytometrie.
Abstract
Identificatie van cardiomyocyten kernen is een uitdaging in het weefsel secties als de meeste strategieën vertrouwen op cytoplasmatische marker-eiwitten 1. Zeldzame gebeurtenissen in hartspiercellen zoals de proliferatie en apoptose vereisen een nauwkeurige identificatie van de cardiale myocyten kernen om celvernieuwing in de homeostase en in pathologische voorwaarden 2 te analyseren. Hier bieden we een methode om cardiomyocyt kernen te isoleren van post mortem weefsel door de dichtheid sedimentatie en immunokleuring met antilichamen tegen pericentriolar materiaal 1 (PCM-1) en de daarop volgende flowcytometrie sorteren. Deze strategie zorgt voor een hoge doorvoer analyse en isolatie met het voordeel van het werken even goed op verse en bevroren weefsel archiefmateriaal. Dit maakt het mogelijk te onderzoeken materiaal reeds verzamelde biobanken. Deze techniek is en getest in een groot aantal soorten en geschikt voor diverse toepassingen later zoals koolstof-14 datering 3 cel-cykel analyse 4, visualisatie van thymidine-analogen (bv. BrdU en IDU) 4, transcriptoom en epigenetische analyse.
Protocol
1. Isolatie van de Cardiac Kernen
- Coat ultracentrifuge buizen (Beckman centrifugebuizen # 363664) met 10 ml van 1% BSA / PBS coating oplossing. Cap de buizen en laten roteren gedurende 30 min in een buis rotator. Verwijder de coatingoplossing en laat de centrifugebuis drogen (een buis per muizenhart is voor de analyse van de muis hart, afwisselend tot 5 muizen hart of 1 g hartweefsel van een andere soort (bijv. humane) kunnen worden verwerkt in een buis).
- Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd op het ijs. Ontleden van de linker ventrikel van verse of snap-bevroren muis hart met een scalpel. Merk dit protocol geoptimaliseerd voor muizenhart, maar kan ook worden aangepast om rat of menselijk hart. Als alternatief gebruik tot 1 g van het hartweefsel van een andere soort.
- Knip het monster in kleine hokjes met een scalpel.
- Breng de weefselstukken in een 50 ml Falcon buis gevuld met 15 ml lysisbuffer.
- Homogeniseer dehartweefsel met T-25 Ultra-Turrax probe homogenisator (IKA) bij 24.000 rpm gedurende 10 sec.
- Verdun het homogenaat met een gelijk volume lysis buffer 30 ml.
- Gebruik een glazen douncer (40 ml) verder gehomogeniseerd het weefsel en de kernen vrij. Voer acht slagen met een grote ruimte stamper.
- Passeer de ruwe kernen te isoleren door middel van een 100 micrometer en 70 micrometer nylon mesh cel zeef (BD Biosciences), achter elkaar.
- Draai beneden de ruwe kernen isoleren in een gekoelde centrifuge (4 ° C) 700 g gedurende 10 minuten.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof door het omkeren van de buizen en veeg de binnenkant van de buis met een papieren handdoek. Zorg ervoor dat u de kernen pellet te verstoren.
- Los de ruwe kernen in 5 ml sucrose buffer isoleren door pipetteren de oplossing een paar keer op en neer. Toevoegen nog 25 ml buffer sucrose op de opgeloste pellet.
- Voeg 10 ml vers bereide sucrose buffer om de gecoate ultracentrifuge buis (zie stap 1.1). </ Li>
- Voorzichtig bedekken de toegevoegde 10 ml sucrose buffer met de geresuspendeerde kernen pellet opgelost in sucrose buffer vanaf stap 1.9.
- De balans van de centrifugebuizen voordat u ze in een JS13.1 gratis swingende rotor en plaats de rotor op een high-speed centrifuge (Beekman Avanti S-25).
- Draai de kernen monster bij 13.000 xg bij 4 ° C gedurende 60 minuten.
- Wanneer de rotatie is voltooid voorzichtig de buizen van de rotor en het supernatans door omkeren van de buizen en afvegen van het resterende vuil van de binnenzijde van de buizen met een papieren handdoek.
- Los de kernen pellet in 1 ml van de kernen opslagbuffer (NSB plus buffer). Let op: NSB plus bevat 1,5 mM spermine als een DNA-stabilisator.
- Ga verder met stap 2.1, immunokleuring van cardiomyocyt kernen.
2. Immunokleuring voor flowcytometrie
- Bereid de negatieve controle voor immunokleuring. Neem een hoeveelheid van 20 ul uit de kernen monster en eendd 980 pi NSB plus buffer.
- Voeg anti-pericentriolar materiaal 1 antilichaam (konijn anti-PCM-1, Atlas Antilichamen) om de kernen monster in een verdunning van 1:500 tot immunolabel cardiomyocyt kernen. Voeg de isotype antilichaam in dezelfde verdunning de anti-PCM-1 antilichaam met de negatieve controle, bereid in stap 2.1.
- Incubeer negatieve controle en monsterbuis bij 4 ° C gedurende de nacht.
- Was de negatieve controle en monster ten minste een keer met NSB plus buffer (spin down buizen in een gekoelde centrifuge (4 ° C) bij 700 xg gedurende 10 minuten. Gooi supernatant en de kernen pellet in 1 ml van de NSB plus buffer op te lossen).
- Voeg anti-konijn fluorescerende secundair antilichaam (FITC of APC) om negatieve controle en proef de buis in een verdunning van 1:1000.
- Incubeer negatieve controle en monsterbuis bij 4 ° C gedurende 1 uur.
- Was negatieve controle en monster ten minste eenmaal met NSB plus buffer (spin neer buizen in een gekoelde centrifuge (4 ° C) 700 g gedurende 10 min. Gooi bovenstaande vloeistof en los de kernen pellet in 1 ml van de NSB plus buffer).
- Ga verder met de flowcytometrische analyse en sortering.
3. Flowcytometrie
- Coat kernen collectie buizen (Falcon 15 ml) met 1% BSA / PBS-oplossing voor u flowcytometrie sorteren, zoals beschreven in stap 1.1 te starten.
- Filter het monster en de negatieve controle door middel van een 30 micrometer cel zeef en plaats eerst de negatieve controle op de flowcytometer (BD instroom). Definieer de eerste en de tweede poort naar de kernen en singlets (enkele kernen) te definiëren, op basis van voorwaartse verstrooiing (FSC), voorwaartse verstrooiing pulsbreedte (FS pulsbreedte) en zijwaartse verstrooiing (SSC) (afb. 2a en b). Het toevoegen van een DNA-kleuring (DRAQ5 (1:500)) om het monster kan helpen om de kernen de bevolking in eerste instantie te identificeren.
- Plaats de immunolabeled monster en definiëren van de derde poort aan cardiomyocyt kernen (PCM-1-positve) isoleren van niet-cardiomyocyt kernen (PCM-1-negatief). Start het sorteren(Fig. 2c en d).
Optioneel: Met het oog op de nucleaire DNA-inhoud (ploïdie) te analyseren en om de celcyclus analyse uit te voeren voeg toe een passende DNA-vlek op de kernen (bijv. Hoechst 33342 of DRAQ5) (fig. 2e).
- Na flowcytometrie sorteren, plaats de kernen op het ijs en opnieuw te analyseren naar de sorteerruimte zuiverheid (afb. 3a en b) te bepalen.
- Draai beneden de gesorteerde kernen in de verzameling buizen 1500 xg in een gekoelde centrifuge 15 minuten.
- Los het kernen pellet in een buffer verenigbaar met de stroomafwaartse toepassing.
4. Representatieve resultaten
Kernen morfologie en integriteit kan worden beoordeeld door DNA-vlekken en gevisualiseerd door microscopie (afb. 1). Succesvolle PCM-1 labeling kan worden geëvalueerd door epifluorescente microscopie en door flow cytometrie (Fig. 1 en Fig. 2c en d). PCM-1-positive en negatieve populaties moet goed van elkaar gescheiden (fig. 2c en d). In muizen linkerventrikel ongeveer 30% van kernen moeten cardiomyocyten kernen zijn (Fig. 2d). Sorteren zuiverheid kan worden beoordeeld door opnieuw het analyseren van de gesorteerde kernen (fig. 3a en b). Beide kernen de bevolking moet een sorteer-zuiverheidsgraad van meer dan 95%.
Figuur 1. PCM-1 zijn cardiomyocyt kernen. Cardiac kernen (a) gekleurd met antilichamen tegen PCM-1 (b) en Nkx2.5 (c) in een volwassen muizenhart. (D) PCM-1-label kernen worden omgeven door cardiomyocyte cytoplasma (myosine heavy chain (MHC)) en drukken de transcriptiefactor Nkx2.5, documenteren de juiste identificatie van cardiomyocyten kernen door PCM-1 kleuring (schaalbalken 20 pm en 10 um (d, inzet)). (E) Cardiac kernen isolaten gevisualiseerd met de DNA-vlek DRAQ5. (F en g) Cardiomyocyte kernen worden aangeduid met antilichamen tegen PCM-1 (schaal bar 10 urn). Let op, de epinuclear kleuringspatroon van PCM-1 in myocyte kernen in weefsel sectie en in afgelegen kernen (pijlen).
Figuur 2. Flowcytometrische sorteren van cardiomyocyt kernen. (A) Cardiac kernen worden geïdentificeerd door voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC). (B) Een tweede poort identificeert enkele kernen van FSC en FS pulsbreedte 5. (C, d) TL gating kan de scheiding van cardiomyocyten kernen (PCM-1-positieve) en niet-cardiomyocyten (PCM-1-negatieve) kernen van hartweefsel. (E) Muis cardiomyocyt veelal (> 80%) diploïde (2n), slechts een klein deel is tetraploïde (4n) 6. Let op, de menselijke cardiomyocyten bevatten een hogere frequentie van polyploïdie kernen (> 2n) 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nauwkeurige identificatie van cardiomyocyt kernen is van cruciaal belang voor de analyse van regeneratieve processen in het myocard 2,3. Conventionele technieken voor cardiomyocyten van sel isoleren zijn hoofdzakelijk gebaseerd op enzymatische afbraak van de extracellulaire matrix en de daaropvolgende zuivering van interstitiële cellen door centrifugeren lage snelheid. Verdere zuivering van levende cardiomyocyten van embryonale stamcellen (SER) kan worden uitgevoerd door immunokleuring met markers zoals Sirpa 9 of mitochondrial kleurstoffen 10 kan vast cardiomyocyten worden geïdentificeerd door cytoplasmatische markers zoals myosine heavy chain (MHC) en nucleaire eiwitten zoals GATA4 of Nkx2.5. Echter, de expressie van Nkx2.5 en GATA4 niet beperkt tot volwassen cardiomyocyten, maar kan ook worden gedetecteerd in progenitorcellen tijdens de ontwikkeling en na hartinfarct 11,12. Genetische strategieën om hartspiercellen te identificeren tonen de hoogste specificiteit, maar CAnnot worden toegepast in grote diermodellen of mensen 1. De beperkingen van de bestaande strategieën hebben geleid tot controversiële conclusies te vertrouwen op de kwantificering van zeldzame gebeurtenissen zoals proliferatie, apoptose en chimerisme 1,13. Er is dus behoefte aan een nauwkeurige strategie te identificeren en te zuiveren volwassen cardiomyocyten gedifferentieerde kernen vast te stellen.
Hier wordt beschrijven zuiveringstechniek op pericentriolar materiaal 1 (PCM-1). Eerder hebben we versterkt de geldigheid van onze kernen isolement door te laten zien dat drie onafhankelijke nucleaire markers, PCM-1, troponine T en ik, dezelfde cardiomyocyt bevolking te identificeren. 2,3 Het gezuiverde bevolking toonde een hoge verrijking van cardiomyocyt specifiek gen producten zoals als cardiale troponines, myosine zware keten eiwit en de transcriptiefactor Nkx2.5 en GATA4 2,3.
Het huidige protocol, gebaseerd op PCM-1, is met succes toegepast fof analyse van mens en de muis cardiomyocyten omzet 2,4 en voor de analyse van de cardiomyocyt transcriptionele profiel 2. Wij verwachten dat de gepresenteerde strategie kan ook worden aangepast aan de isolatie van cardiomyocyten van andere soorten. PCM-1, een centrosoom eiwit opnieuw lokaliseert de kernmembraan waar het verzamelt en vormt een onoplosbaar matrix alleen gedifferentieerde myocyten 2,14 (Fig. 1). Flowcytometrie kan de snelle onpartijdige analyse van een groot aantal cellen, die nodig is om zeldzame gebeurtenissen in cardiomyocyten als apoptose en celcyclus re-entry 15 te kwantificeren. Bovendien, nucleotide-analogen (bijv. BrdU) op basis van proliferatie assays gemakkelijk kan worden toegepast met behulp van onze gepresenteerd techniek 4. De techniek heeft het voordeel dat de DNA-inhoud van een cardiomyocyt kernen (nucleaire ploidie) worden geanalyseerd multinucleaire cardiomyocyten 16,17 die belangrijke informatie voorzietonderscheid te maken tussen cardiomyocyten duplicatie en polyploidisation 6-8. Vanwege de aard van de strategie, een typering van cardiomyocyten multinucleation niet mogelijk.
Andere toepassingen van de voorgestelde methode onderzoek gericht op epigenetische veranderingen van chromatine kerneiwitten, protein-DNA/RNA interacties en de nucleaire transcriptoom 18,19.
Door de stabiliteit van kernen in bevroren en ontdooid weefsel, kan de kern aangeboden isolatie strategie ook worden toegepast bevroren weefsels maakt het mogelijk archiefmateriaal gebruik van biobanken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag Marcelo Toro erkennen voor de hulp bij flowcytometrie. Deze studie werd ondersteund door de Zweedse Hart-en Long Foundation, EU-Commissie KP7 "CardioCell", Zweedse Raad voor Onderzoek, AFA verzekeringen en ALF. OB werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Lysis Buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.32 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 2.0 mM EDTA | |||
| 0.5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2. Sucrose buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 2.1 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 1 mM DTT | |||
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.44 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) | |||
| 70 mM KCl | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM spermine | |||
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam | ||
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies | ||
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies | ||
| DRAQ5 | Biostatus | ||
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences | ||
| Glass douncer (40 ml) and pestle "L" | VWR (Wheaton Industries Inc.) | ||
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany | ||
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany | ||
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR | ||
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter | ||
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter | ||
| Influx cytometer | Beckman Coulter | ||
| Tube Rotator | VWR |
References
- Ang, K. L. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).
- Bergmann, O. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).
- Bergmann, O. Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans. Science. 324, 98-102 (1126).
- Walsh, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation. Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).
- Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts. Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).
- Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).
- Adler, C. P., Friedburg, H. Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age. Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).
- Dubois, N. C. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature. 29, 1011-1018 (2011).
- Hattori, F. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7, 61-66 (2010).
- Fransioli, J. Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium. Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).
- Elliott, D. A. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).
- Laflamme, M. A. Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts. Circulation Research. 90, 634-640 (2002).
- Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation. BMC cell biology. 10, 28 (2009).
- Spoelgen, R. A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain. Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).
- Olivetti, G. Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart. J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).
- Okada, S. Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue. Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue. J. Vis. Exp. (20), e914 (2008).
