Summary
심장 핵은 밀도 침강 통해 격리 및 유동세포계측법 의해 cardiomyocyte 핵 파악하고 정렬하는 pericentriolar 소재 1 (PCM-1)에 대한 항체로 immunolabeled있다.
Abstract
대부분의 전략에만 세포질 마커 단백질 1에 의존로 cardiomyocyte 핵의 식별은 조직 섹션에 도전했습니다. 이러한 증식과 apoptosis와 같은 심장 myocytes에서는 드문 행사 심장 myocyte 핵의 정확한 신원은 항상성 및 병리 학적 조건 2의 세포 갱신을 분석해야합니다. 여기서는 pericentriolar 자료 1 (PCM-1)와 후속 유동세포계측법 정렬에 대한 항체가있는 밀도의 침강 및 immunolabeling으로 해부 조직에서 cardiomyocyte 핵을 분리하는 방법을 제공합니다. 이 전략은 신선한 조직 및 냉동 보관 물질에 동일하게 작업의 장점과 높은 처리량 분석 및 절연을 허용합니다. 이렇게하면 이미 biobanks에서 수집한 자료를 공부할 수 있습니다. 이 기술 적용과 종의 광범위한 테스트와 같은 탄소-14 데이트 3 셀 - 사 등 여러 다운 스트림 애플 리케이션에 적합하다CLE 분석 4, thymidine의 analogues의 시각화 (예 : BrdU와 이두) 4, transcriptome 및 epigenetic 분석.
Protocol
1. 심장 핵의 분리
- 1퍼센트 BSA / PBS 코팅 용액의 10 ML과 코트 ultracentrifuge 튜브 (Beckman의 원심 분리기 튜브 # 363664). 튜브를 모자하고 그들 튜브 회전에서 30 분 동안 회전하자. 코팅 용액을 제거하고 원심 분리기 튜브 공기 건조 (마우스 심장 당 하나의 튜브가 다른 종류의 단일 마우스 하트, 번갈아 최대 5 마우스의 마음이나 심장 조직의 1g의 분석에 필요한하게 (예 : 인간) 처리할 수 있습니다 연결한 튜브에서).
- 모두 다음 단계는 얼음에서 수행되어야합니다. 메스 신선한 또는 스냅인 냉동 마우스 심장의 좌심실 해부. 참고,이 프로토콜은 마우스 마음에 최적화되어 있습니다뿐만 아니라 쥐 또는 사람의 마음에 맞게 할 수 있습니다. 또는 다른 종의에서 심장 조직의 1g까지 사용합니다.
- 때론 작은 큐비클로 표본을 트림.
- 용해 완충액의 15 ML 가득한 50 ML 팔콘 튜브에 조직 조각을 전송합니다.
- 를 Homogenize10 초위한 24,000 rpm으로 T-25 울트라 Turrax 프로브 균 질기 (이카)과 심장 조직.
- 30 ML에 용해 버퍼의 동일한 볼륨으로 homogenate를 희석.
- 더욱 조직과 무료 핵 homogenize하는 유리 douncer (40 ML)를 사용합니다. 대형 통관 유봉들과 8 스트로크를 수행합니다.
- 원유 핵는 100 μm의 70 μm의 나일론 메쉬 세포 스트레이너 (BD Biosciences), 연속적으로 분리할 전달합니다.
- 원유 핵은 10 분 700 XG에서 냉장 원심 분리기 (4 ℃)에서 분리 내려 봐.
- 반전 튜브에 의해 신중하게 뜨는을 제거하고 종이 타월로 튜브의 안쪽을 닦으십시오. 핵 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오.
- 원유 핵이 솔루션은 여러 번 최대 pipetting 및 아래쪽으로 자당 버퍼의 5ml에 격리 디졸브. 녹아 펠렛으로 자당 버퍼의 추가 25 ML을 추가합니다.
- 코팅 ultracentrifuge 튜브 (단계 1.1을 참조) 신선한 자당 버퍼의 10 ML을 추가합니다. </ 리>
- 조심스럽게 단계 1.9에서 자당 버퍼에 녹아있는 resuspended 핵 펠렛과 자당 버퍼의 부가 10 ML 입혀라.
- JS13.1 무료 스윙 로터에 그들을 배치하기 전에 원심 분리기 튜브의 균형과 고속 원심 분리기 (Beckman 아벤티 S-25)에 날개를 놓습니다.
- 60 분 동안 4 ° C에서 13,000 XG에 핵 샘플을 봐.
- 스핀이 완료되면 로터에서 신중하게 튜브를 제거하고 반전 튜브에 의해 표면에 뜨는를 버리고 종이 타월로 튜브의 안쪽에서 남아있는 파편을 닦아.
- 핵 저장 버퍼 (NSB 플러스 버퍼)의 1ml에 핵 펠렛를 해산. 참고 : NSB 플러스 DNA를 안정제로 1.5 MM spermine이 포함되어 있습니다.
- cardiomyocyte 핵의 immunostaining 단계 2.1 진행합니다.
2. 유동세포계측법 위해 Immunostaining
- immunostaining에 대한 부정적인 제어를 준비합니다. 핵 샘플 20 μl를 벗어 나누어지는와보세요NSB 플러스 버퍼의 DD 980의 μl.
- immunolabel cardiomyocyte 핵에 1:500의 희석에 핵 샘플로 백신 pericentriolar 소재 한 항체를 (토끼 안티 PCM-1, 아틀라스 항체)를 추가합니다. 단계 2.1 준비 부정적인 컨트롤에 대한 안티 PCM-1 항체와 같은 희석에 isotype 항체를 추가합니다.
- 4 ° C에서 하룻밤 사이에 부정적인 제어 및 샘플 튜브를 품어.
- NSB 플러스 버퍼 (10 분 700 XG에서 냉장 원심 분리기 (4 ℃)에서 튜브를 돌려서. 뜨는 취소하고 NSB 플러스 버퍼의 1 ML에 핵 펠렛를 해산)에 적어도 한 번 이상 부정적인 제어 및 샘플을 씻으십시오.
- 1:1000의 희석에 부정적인 제어 및 샘플 튜브에 안티 - 토끼 형광 이차 항체 (FITC 또는 APC)를 추가합니다.
- 한 H에 대해 4 ° C에서 제외어 제어 및 샘플 튜브를 품어.
- NSB 플러스 버퍼 (10 분 700 XG에 냉장 원심 분리기 (4 ℃)에서 튜브를 다운 스핀과 함께 적어도 한 번 이상 부정적인 제어 및 샘플을 씻으. 뜨는을 무시하고) NSB 플러스 버퍼의 1 ML에 핵 펠렛를 해산.
- 흐름 cytometric 분석과 정렬을 진행합니다.
3. 유동세포계측법
- 당신이 단계 1.1에 설명된대로 정렬 유동세포계측법를 시작하기 전에 1퍼센트 BSA / PBS 용액 코트 핵 컬렉션 튜브 (팔콘 15 ML).
- 샘플 및 30 μm의 셀 스트레이너를 통해 부정적인 제어를 필터링하고 (BD의 유입) 먼저 흐름 cytometer에 부정적인 컨트롤을로드합니다. 전방 산란 (FSC), 전방 산란 펄스 폭 (FS 펄스 폭)와 사이드 분산형 (SSC) (그림 2A와 B)을 바탕으로 핵 및 singlets (단일 핵)을 정의하는 첫 번째와 두 번째 게이트를 정의합니다. 샘플로 얼룩의 DNA (DRAQ5 (1:500)를) 추가하면 처음에 핵 인구를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- immunolabeled 샘플을로드 및 비 cardiomyocyte 핵 (PCM-1-음수)에서 cardiomyocyte 핵 (PCM-1-positve)을 분리하기 위해 세 번째 게이트를 정의합니다. 정렬을 시작합니다(그림 2C와 D).
옵션 : 핵의 DNA 콘텐츠 (ploidy)를 분석하고 핵 (예 : Hoechst 33342 또는 DRAQ5) (그림의 2e)에 얼룩 적절한 DNA를 추가 세포주기 분석을 수행하기 위해서는.
- 유동세포계측법 정렬 후, 얼음 핵을 배치하고 정렬 순도 (그림 3A와 B)를 확인하기 위해 다시 분석합니다.
- 15 분 대한 냉장 원심 분리기 1500 XG에서 수집 튜브의 정렬된 핵을 봐.
- 다운 스트림 응용 프로그램과 호환 버퍼에 핵 펠렛를 해산.
4. 대표 결과
핵의 형태 및 무결성의 DNA 얼룩에 의해 평가 및 현미경 (그림 1)에 의해 시각하실 수 있습니다. 성공적인 PCM-1이 라벨은 epifluorescence 현미경 의해 유동세포계측법 (그림 1 및 그림. 2C와 d)에 의해 평가됩니다. PCM-1-positi같군과 부정적인 집단이 아니라 (그림 2C와 D) 서로 구분해야합니다. murine 좌심실에서 모든 핵의 약 30 %는 (그림 2D) cardiomyocyte 핵 있어야합니다. 순결을 정렬하는 것은 정렬 핵 (그림 3A와 B에게) 다시 분석하여 평가 할 수 있습니다. 두 핵의 인구는 95 %를 초과 정렬 순결이 있어야합니다.
1 그림. PCM-1 cardiomyocyte 핵을 식별합니다. 심장 핵 (가) PCM-1 (B) 및 성인 쥐 심장에서 Nkx2.5 (C)에 대한 항체 물들일 수 있습니다. (D) PCM-1-라벨이 핵은 cardiomyocyte 세포질 (마이 오신 중쇄 (MHC))으로 둘러싸여 있으며, PCM-1 염색법 (스케일 바, 20 μm의 및 10에 의해 cardiomyocyte 핵의 정확한 신원을 문서화, 전사 인자 Nkx2.5를 표현하고 있습니다 μm의 (D, 삽입된 페이지)). (E) DNA와 시각 심장 핵의 분리는 DRAQ5에 얼룩. (F와 G) Cardiomyocyte 핵은 PCM-1 (스케일 바 10 μm의)에 대한 항체로 분류하고 있습니다. 참고 조직 섹션에 myocyte 핵 및 절연 핵 (화살표)에서 PCM-1 epinuclear 염색법 패턴.
그림 2. cardiomyocyte 핵의 흐름 cytometric 정렬. () 심장 핵은 전방 산란 (FSC)와 사이드 분산형 (SSC)에 의해 식별됩니다. (b)는 두 번째 게이트는 FSC와 FS 펄스 폭 5에 하나의 핵을 식별합니다. (C, D) 형광 게이팅은 심장 조직에서 cardiomyocyte 핵의 분리 (PCM-1-양성) 및 비 cardiomyocyte (PCM-1-음수)이 핵 수 있습니다. (마) 마우스 cardiomyocyte이 대부분 (> 80 %) diploid (2N)이며, 오직 작은 부분 집합은 (4N) 6 tetraploid입니다. 참고, 인간 cardiomyocytes는 polyploidy 핵의 높은 주파수 (> 2N) 7,8가 포함되어 있습니다.
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Discussion
cardiomyocyte 핵의 정확한 신원은 myocardium 2,3의 재생 과정의 분석을 위해 매우 중요합니다. 신선한 조직에서 cardiomyocytes를 분리하기위한 종래의 기술은 주로 세포외 기질 단백질의 소화 효소 및 저속 원심 분리에 의한 간질 세포에서 이후의 정화를 기준으로합니다. 배아 줄기 세포 (ESC)에서 생활 cardiomyocytes의 자세한 정화는 같은 SIRPA 9 또는 mitochondrial 염료 10 표면 마커와 immunolabeling하여 수행할 수, 고정 cardiomyocytes 같은 마이 오신 중쇄 (MHC) 또는 같은 핵 단백질로서 세포질 마커에 의해 확인할 수 있습니다 GATA4 또는 Nkx2.5. 그러나, Nkx2.5과 GATA4의 표현은 성숙 cardiomyocytes에 국한되지 않고, 또한 개발 도중 심장 경색 11,12 후에 전구 세포에서 감지가 가능하다. cardiomyocytes을 식별하는 유전자 전략은 가장 높은 특이성하지만, C를 표시annot은 대형 동물 모델이나 사람 1에 적용됩니다. 기존 전략의 한계는 증식, apoptosis와 chimerism 1,13 등 희귀 사건의 부량에 의존 논란이 결론을 이끌어있다. 따라서 성숙한 차별 cardiomyocyte의 핵을 파악하고 정화 정확한 전략을 수립하는 것이 필요가있다.
여기서는 pericentriolar 자료 1 (PCM-1)을 기반으로 정화 기법을 설명합니다. 이전에, 우리는 세 가지 독립적인 핵 마커, PCM-1, 심장 트로포닌 T와 나는 같은 cardiomyocyte 인구를 식별하는 것을 보여줌으로써 우리의 핵 절연의 유효성을 강화. 2,3 정화 인구가 cardiomyocyte 특정 유전자 제품의 높은 농축을 보여줬 등 심장 troponins, 마이 오신 중쇄 단백질과 전사 인자 Nkx2.5과 GATA4 2,3 등.
PCM-1을 기반으로 현재의 프로토콜은, 성공적으로 F를 적용되었습니다혹은 인간 및 마우스 cardiomyocyte 매출 2,4뿐만 아니라 cardiomyocyte transcriptional 프로파일 2의 분석의 분석. 우리는 제시된 전략은 또한 다른 종의에서 cardiomyocytes의 고립 적응 수 있다고 기대하고 있습니다. PCM-1, centrosome 단백질은 그것이 누적 핵 막에 다시 localizes만이 차별화된 myocytes 2,14 (그림 1)에서 불용성 매트릭스를 형성합니다. 유동세포계측법는 apoptosis와 세포주기 재입국 15 cardiomyocytes에서는 드문 이벤트를 계량하는 데 필요한 세포의 높은 숫자의 급속한 편견 분석이 가능합니다. 또한, 염기 analogues는 (예 : BrdU) 기반의 확산 assays는 쉽게 우리의 제시 방법 4를 사용하여 적용할 수 있습니다. 우리의 기술은 단일 cardiomyocyte의 핵 (원자력 ploidy)의 DNA 내용이 중요한 정보를 제공 multinuclear cardiomyocytes 16,17, 분석할 수있다는 장점이 있습니다cardiomyocyte 중복 및 polyploidisation 6-8 구별합니다. 그러나 우리의 전략의 성격으로 인해, cardiomyocyte multinucleation의 특성화는 불가능합니다.
제시된 방법의 추가 응용 프로그램은 epigenetic 염색질의 변화, nucleoproteins, protein-DNA/RNA 상호 작용와 핵 transcriptome 18,19에 초점을 맞춘 연구입니다.
때문에 동결 - 해동 조직의 핵의 안정성, 제시 핵 격리 전략도 biobanks에서 보관된 자료를 활용하는 것이 가능하게, 냉동 조직에 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 유동세포계측법와 도움 마르셀 토로 인정 싶어요. 이 연구는 스웨덴어 심장과 폐 재단, 유럽위원회는 FP7 "CardioCell", 스웨덴어 연구 협의회, AFA 보험 및 ALF에 의해 지원되었다. OB는 도이치 Forschungsgemeinschaft에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Lysis Buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.32 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 2.0 mM EDTA | |||
| 0.5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2. Sucrose buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 2.1 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 1 mM DTT | |||
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.44 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) | |||
| 70 mM KCl | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM spermine | |||
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam | ||
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies | ||
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies | ||
| DRAQ5 | Biostatus | ||
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences | ||
| Glass douncer (40 ml) and pestle "L" | VWR (Wheaton Industries Inc.) | ||
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany | ||
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany | ||
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR | ||
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter | ||
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter | ||
| Influx cytometer | Beckman Coulter | ||
| Tube Rotator | VWR |
References
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