Summary
Сердечная ядра изолированы с помощью осаждения и плотность immunolabeled с антителами против pericentriolar материал 1 (PCM-1) определить и сортировать ядер кардиомиоцитов с помощью проточной цитометрии.
Abstract
Идентификация ядер кардиомиоцитов была сложной в срезах тканей большинство стратегий полагаться только на цитоплазматических белков-маркеров 1. Редкие события в кардиомиоциты, таких как пролиферации и апоптозе требуют точной идентификации сердечных миоцитов ядер для анализа клеточного обновления в гомеостаза и при патологических состояниях 2. Здесь мы предлагаем метод, чтобы изолировать ядер кардиомиоцитов из тканей после смерти путем осаждения и плотность immunolabeling с антителами против pericentriolar материала 1 (PCM-1) и последующая сортировка проточной цитометрии. Эта стратегия обеспечивает высокую пропускную способность и анализ изоляцией с преимуществом работы одинаково хорошо на свежем ткани и замороженных архивных материалов. Это позволяет изучать материалы уже собраны в биобанках. Этот метод применим и испытан в широком диапазоне видов и пригодны для нескольких ниже приложений, таких как углерод-14 знакомства 3, клетка-суCLE анализа 4, визуализация тимидина аналогов (например, BrdU и ПИН) 4, транскриптом и эпигенетических анализа.
Protocol
1. Выделение сердечного ядра
- Пальто ультрацентрифуге труб (Beckman пробирок # 363664) с 10 мл 1% BSA / PBS покрытие решение. Закройте трубы, и пусть они вращаются в течение 30 минут в трубке ротатора. Удалите покрытие решение, и пусть пробирок воздух сухой (одна трубка в сердце мыши требуется для анализа одного сердца мыши, поочередно до 5 сердца мыши или 1 г ткани сердца от различных видов (например, человека) может быть обработан в одной трубке).
- Все последующие шаги должны быть выполнены на льду. Проанализируйте левого желудочка из свежих или замороженных оснастки мышь сердца с помощью скальпеля. Обратите внимание, что данный протокол оптимизирован для мыши сердце, но также может быть адаптирована к крысе или человеческое сердце. Кроме того, использовать до 1 г ткани сердца от различных видов.
- Обрежьте образца на маленькие ячейки с помощью скальпеля.
- Передача части ткани в 50 мл Сокол трубки, заполненной 15 мл лизис буфера.
- Однородныйткани сердца с Т-25 Ultra-Turrax зонд гомогенизатор (IKA) на 24 000 оборотов в минуту на 10 секунд.
- Развести гомогената с равным объемом лизис буфера до 30 мл.
- Использование стекла douncer (40 мл) для дальнейшего гомогенизации ткани и свободные ядра. Выполнять восемь ударов с большим пестиком оформления.
- Передайте сырой ядер изоляции через 100 мкм и 70 мкм нейлоновая сетка ячейка фильтр (BD Biosciences), последовательно.
- Спином вниз сырой ядер изолировать в охлажденном центрифуги (4 ° С) при 700 мкг в течение 10 мин.
- Удаляют супернатант тщательно обращения трубки и вытрите трубки с бумажным полотенцем. Будьте осторожны, чтобы не нарушить ядра гранулы.
- Растворите сырой ядер изолировать в 5 мл сахарозы буфера с помощью пипетки раствор несколько раз вверх и вниз. Добавьте еще 25 мл сахарозы буфер растворенных гранул.
- Добавить 10 мл свежеприготовленного сахарозы буфер покрытием труб ультрацентрифуге (см. п. 1.1). </ LI>
- Аккуратно наложить добавляют 10 мл буфера с сахарозой ресуспендированного ядра гранулы растворяются в сахароза буфера, начиная с шага 1.9.
- Баланс пробирок перед помещением их в JS13.1 бесплатно размахивая ротора и поместить ротор в высокоскоростной центрифуге (Beckman Avanti S-25).
- Спин ядра образца при 13000 х г при 4 ° С в течение 60 мин.
- Когда спина завершено, удалить трубы тщательно от ротора и отказаться от супернатант обращения трубы и уничтожить оставшихся обломков от внутренней поверхности трубы с бумажным полотенцем.
- Растворите гранулы ядер в 1 мл буфера хранения ядра (NSB плюс буфер). Примечание: NSB также содержит 1,5 мМ спермина как ДНК-стабилизатор.
- Перейдите к шагу 2.1, иммунной ядер кардиомиоцитов.
2. Иммуноокрашивание для проточной цитометрии
- Подготовка отрицательного контроля для иммунной. Возьмите аликвоту 20 мкл из ядер образца идд 980 мкл NSB плюс буфера.
- Добавить анти-pericentriolar материала 1 антител (кролик анти-PCM-1, Атлас антитела) с ядрами образца в разведении 1:500 до immunolabel ядер кардиомиоцитов. Добавить изотипа антител в том же разведении как анти-PCM-1 антитела к отрицательным контролем, подготовленный в шаге 2.1.
- Инкубируйте отрицательного контроля и пробирку при 4 ° С в течение ночи.
- Вымойте отрицательного контроля и образцов по крайней мере, один раз с NSB плюс буфер (спин вниз трубы в охлажденном центрифуги (4 ° С) при 700 мкг в течение 10 минут. Удалить супернатант и растворить ядер гранул в 1 мл NSB плюс буфер).
- Добавить анти-кролик люминесцентные вторичными антителами (FITC или APC) для отрицательного контроля и пробирку в разведении 1:1000.
- Инкубируйте отрицательного контроля и пробирку при 4 ° С в течение 1 часа.
- Вымойте отрицательного контроля и образцов по крайней мере, один раз с NSB плюс буфер (спин вниз трубы в охлажденном центрифуги (4 ° С) при 700 мкг в течение 10 минут. Удалить супернатант и растворить ядер гранул в 1 мл NSB плюс буфер).
- Приступить к проточной цитометрии и сортировки.
3. Проточной цитометрии
- Пальто ядер коллекции труб (Falcon 15 мл) с 1% BSA / PBS решение, прежде чем начать проточной цитометрии сортировки, как описано в пункте 1.1.
- Фильтр образца и отрицательного контроля через 30 мкм фильтр клетки и загрузить сначала отрицательного контроля в проточной цитометрии (BD приток). Определение первых и вторых ворот для определения ядер и фуфайки (одного ядра), основанный на рассеяние вперед (FSC), длительность импульса вперед разброс (FS ширины импульса) и боковых рассеяния (SSC) (рис. 2, б). Добавление ДНК пятна (DRAQ5 (1:500)) в образце может помочь выявить ядер населения на начальном этапе.
- Загрузите immunolabeled образца и определить третьи ворота, чтобы изолировать ядер кардиомиоцитов (PCM-1-positve) от не-ядер кардиомиоцитов (PCM-1-отрицательный). Начать сортировку(Рис. 2, г).
Дополнительно: Для того, чтобы проанализировать содержание ядерной ДНК (плоидности) и проводить анализ клеточного цикла добавить соответствующие ДНК пятна с ядрами (например, Hoechst 33342 или DRAQ5) (рис. 2д).
- После того, как поток сортировки цитометрии, поместите ядер на льду и повторный анализ, чтобы определить чистоту сортировки (рис. 3а, б).
- Спином вниз отсортированы ядер в коллекции труб в 1500 мкг в охлажденном центрифуги в течение 15 мин.
- Растворите гранулы ядер в буфере совместим с приложением вниз по течению.
4. Представитель Результаты
Морфология ядра и целостности могут быть оценены с помощью ДНК пятна и визуализированы с помощью микроскопа (рис. 1). Успешное PCM-1 маркировка может быть оценена эпифлуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии (рис. 1 и рис. 2в, г). PCM-1-positiве и отрицательные население должно быть хорошо отделены друг от друга (рис. 2, г). В мышиной левого желудочка около 30% всех ядер должно быть ядер кардиомиоцитов (рис. 2). Сортировка чистоты могут быть оценены путем повторного анализа отсортированы ядер (рис. 3а, б). Оба ядра популяции должны сортировки чистотой более 95%.
Рисунок 1. PCM-1 определяет ядер кардиомиоцитов. Сердечная ядер (а) окрашивали антителами к PCM-1 (б) и Nkx2.5 (с) во взрослом сердце мыши. (Г) PCM-1-меченых ядер кардиомиоцитов окружении цитоплазмы (тяжелой цепи миозина (MHC)) и выразить транскрипционный фактор Nkx2.5, документально точной идентификации ядер кардиомиоцитов на PCM-1 окрашивания (масштаб баров 20 мкм и 10 мкм (г, вставка)). (Е) Сердечная изолятов ядер визуализированы с ДНК пятна DRAQ5. (Е, ж) Cardiomyocyte ядер, меченных антител против PCM-1 (линейки 10 мкм). Обратите внимание, что шаблон epinuclear окрашивания PCM-1 в ядрах миоцитов в тканях раздел и в изолированных ядрах (стрелки).
Рисунок 2. Проточной цитометрии сортировка ядер кардиомиоцитов. (А) Сердечная ядер определяются вперед рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC). (Б) вторые ворота определяет единый ядер FSC и FS длительность импульса 5. (C, D) Флуоресцентные стробирования позволяет разделение ядер кардиомиоцитов (PCM-1-положительных) и не кардиомиоцитов (PCM-1-отрицательная) ядер из ткани сердца. (Е) Мышь кардиомиоцитов в основном (> 80%) диплоидный (2п), лишь небольшое подмножество тетраплоидных (4л) 6. Обратите внимание, что человеческие кардиомиоциты содержат более высокой частоте полиплоидии ядер (> 2п) 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Точная идентификация ядер кардиомиоцитов имеет решающее значение для анализа регенеративных процессов в миокарде 2,3. Обычные методы, чтобы изолировать кардиомиоцитов из свежей ткани в основном на основе ферментативного переваривания белки внеклеточного матрикса и последующей очистки от интерстициальных клеток низкой скорости центрифугирования. Дальнейшая очистка живых кардиомиоцитов из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) могут быть выполнены с immunolabeling поверхностных маркеров, таких как Сирпа 9 или митохондриальной красители 10, фиксированный кардиомиоцитов можно определить по цитоплазматических маркеров, таких как тяжелые цепи миозина (МНС) или ядерные белки, такие как GATA4 или Nkx2.5. Тем не менее, выражение Nkx2.5 и GATA4 не ограничивается зрелые кардиомиоциты, но также может быть обнаружен в клетки-предшественники в процессе разработки и после инфаркта миокарда 11,12. Генетические стратегии выявления кардиомиоцитов показать высокий специфику, но вannot применяться в больших моделях животных и человека 1. Ограничения существующих стратегий привело к спорным выводам, опираясь на количественное редких событий, таких как пролиферация, апоптоз и химеризма 1,13. Таким образом, существует необходимость создания четкой стратегии по выявлению и очистке зрелых дифференцированных ядер кардиомиоцитов.
Здесь мы описываем очистки методика, основанная на pericentriolar материала 1 (PCM-1). Ранее мы укрепили наши действия ядер изоляции, показывая, что три независимых ядерных маркеров, PCM-1, сердечного тропонина Т и I, определить же кардиомиоцитов населения. 2,3 населения очищенный показали высокий обогащения кардиомиоцитов конкретных генных продуктов таких как кардиальных тропонинов, миозина тяжелой цепи белка и фактора транскрипции Nkx2.5 и GATA4 2,3.
В настоящее время протокол, основанный на PCM-1, был успешно применен еили анализу человека и мыши кардиомиоцитов оборот 2,4, а также для анализа кардиомиоцитов транскрипционных профилей 2. Мы полагаем, что представленная стратегия также может быть адаптирована к изоляции кардиомиоциты от других видов. PCM-1, центросомы белков, вновь локализуется в ядерной мембране, где он накапливается и образует нерастворимый матрицы только в дифференцированных кардиомиоцитов 2,14 (рис. 1). Проточная цитометрия позволяет быстро непредвзятый анализ большого числа клеток, которые необходимы для количественной редких событий в кардиомиоциты, таких как апоптоз и клеточный цикл возвращения 15. Кроме того, аналоги нуклеотидов (например, BrdU) на основе анализов распространение может быть легко применена, используя наш представлен метод 4. Наш метод имеет то преимущество, что содержание ДНК одного ядра кардиомиоцитов (ядерного плоидности) могут быть проанализированы в многоядерных кардиомиоцитов 16,17, в котором содержится важная информацияразличать кардиомиоцитов дублирования и polyploidisation 6-8. Однако, из-за природы нашей стратегии, характеристики кардиомиоцитов multinucleation не представляется возможным.
Дальнейшее применение представленного метода исследования сосредоточены на эпигенетические изменения хроматина, нуклеопротеидов, protein-DNA/RNA взаимодействия и по ядерной транскриптома 18,19.
Из-за стабильности ядер замерзания талой ткань, представленная стратегия ядер изоляция может быть применен и к замороженной ткани, что позволяет использовать материал из архива биобанках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы выражаем свою признательность Marcelo Торо за помощь с проточной цитометрии. Работа выполнена при поддержке шведского сердца и легких фонда, Комиссии ЕС FP7 "CardioCell" Шведский исследовательский совет, AFA страхования и ALF. Б. был поддержан Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Lysis Buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.32 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 2.0 mM EDTA | |||
| 0.5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2. Sucrose buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 2.1 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 1 mM DTT | |||
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.44 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) | |||
| 70 mM KCl | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM spermine | |||
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam | ||
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies | ||
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies | ||
| DRAQ5 | Biostatus | ||
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences | ||
| Glass douncer (40 ml) and pestle "L" | VWR (Wheaton Industries Inc.) | ||
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany | ||
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany | ||
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR | ||
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter | ||
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter | ||
| Influx cytometer | Beckman Coulter | ||
| Tube Rotator | VWR |
References
- Ang, K. L. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).
- Bergmann, O. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).
- Bergmann, O. Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans. Science. 324, 98-102 (1126).
- Walsh, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation. Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).
- Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts. Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).
- Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).
- Adler, C. P., Friedburg, H. Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age. Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).
- Dubois, N. C. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature. 29, 1011-1018 (2011).
- Hattori, F. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7, 61-66 (2010).
- Fransioli, J. Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium. Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).
- Elliott, D. A. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).
- Laflamme, M. A. Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts. Circulation Research. 90, 634-640 (2002).
- Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation. BMC cell biology. 10, 28 (2009).
- Spoelgen, R. A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain. Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).
- Olivetti, G. Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart. J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).
- Okada, S. Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue. Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue. J. Vis. Exp. (20), e914 (2008).
