Summary
chondrocytes कार्टिलेजीनस कोशिकी मैट्रिक्स के biosynthesis यांत्रिक उत्तेजनाओं के आवेदन के द्वारा प्रभावित किया जा सकता है. इस विधि 3 डी constructs और उपास्थिकोशिका चयापचय में परिवर्तन प्रेरित के मूल्यांकन में समझाया chondrocytes गतिशील compressive उपभेदों लगाने की तकनीक का वर्णन है.
Abstract
जोड़ उपास्थि एक सीमित की मरम्मत की क्षमता से ग्रस्त है जब यांत्रिक अपमान या पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के रूप में इस तरह के रोग, अपमानित द्वारा क्षतिग्रस्त. इस कमी में सुधार करने के लिए, कई चिकित्सा हस्तक्षेप विकसित किया गया है. एक ऐसी विधि ऊतक इंजीनियर उपास्थि के साथ क्षतिग्रस्त क्षेत्र को फिर से संगठित करने के लिए है, तथापि, ऊतक इंजीनियर आमतौर पर देशी उपास्थि की जैव रासायनिक गुण और स्थायित्व का अभाव है, लंबे समय तक इसके survivability पूछताछ. यह छोटे फोकल दोष के मरम्मत के लिए उपास्थि ऊतक इंजीनियरिंग के आवेदन की सीमा है, आसपास प्रत्यारोपित सामग्री की रक्षा के ऊतक पर निर्भर है. विकसित ऊतक के गुणों में सुधार, यांत्रिक उत्तेजना कार्टिलेजीनस बाह्य मैट्रिक्स के संश्लेषण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऊतक इंजीनियर के परिणामी यांत्रिक गुणों को बढ़ाने के लिए उपयोग एक लोकप्रिय तरीका है. यांत्रिक उत्तेजना ऊतक बलों लागू होता है vivo में उन अनुभवी अनुरूप constructs. यहआधार है कि यांत्रिक पर्यावरण, भाग में, और देशी ऊतक 1,2 के विकास और रखरखाव को नियंत्रित पर आधारित है. उपास्थि ऊतक इंजीनियरिंग में यांत्रिक उत्तेजना का सबसे अधिक लागू फार्म 1 हर्ट्ज 1,3 की आवृत्ति पर लगभग 5-20% की शारीरिक उपभेदों पर गतिशील संपीड़न है. कई अध्ययनों से गतिशील संपीड़न के प्रभाव की जांच की है और यह उपास्थिकोशिका चयापचय और biosynthesis पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है, अंततः विकसित ऊतक 4-8 के कार्यात्मक संपत्तियों को प्रभावित दिखाया. इस पत्र में, हम यंत्रवत् गतिशील संपीड़न के तहत उपास्थिकोशिका agarose hydrogel constructs को प्रोत्साहित और biosynthesis में जैव रासायनिक और रेडियो आइसोटोप assays के माध्यम से परिवर्तन का विश्लेषण करने की विधि का वर्णन है. इस पद्धति का भी आसानी से यांत्रिक उत्तेजनाओं का एक परिणाम के रूप में सेलुलर प्रतिक्रिया में किसी भी संभावित प्रेरित परिवर्तन का आकलन संशोधित किया जा सकता है.
Protocol
1. प्राथमिक जोड़ chondrocytes का अलगाव
पशु जोड़ों के जोड़दार सतह से 10-15 पूर्ण मोटाई उपास्थि स्लाइस हार्वेस्ट (संयुक्त metacarpal phalangeal skeletally परिपक्व एक स्थानीय abbatoir से प्राप्त गायों के उदाहरण के लिए).
- प्लेस एक 100 मिमी पेट्री डिश और हाम F-12 (w / v) में 0.5% protease के 20 मिलीलीटर में सेते 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में उपास्थि स्लाइस हाम एफ 12 संस्कृति मीडिया में तीन बार कुल्ला, और 0.15% Collagenase के 20 मिलीलीटर के साथ सेते हैं हाम F-12 संस्कृति रातोंरात मीडिया में 37 डिग्री सेल्सियस में
- एक साफ पकवान में 200 जाल स्क्रीन फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर. हाम F-12 के 5 मिलीलीटर के साथ फिल्टर धो और पकवान में जोड़ने. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण. हाम F-12 की 10 मिलीलीटर के साथ पेट्री डिश धो और शंक्वाकार ट्यूब जोड़ें.
- 600-800 आरसीएफ में कमरे के तापमान पर 6-8 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र.
- तैरनेवाला Aspirate वें परेशान नहीं सुनिश्चित करनेई सेल गोली और हाम F-12 संस्कृति मीडिया के 40 मिलीलीटर में फिर से स्थगित कर देते हैं.
- 6-8 मिनट के लिए 600-800 आरसीएफ में ट्यूब अपकेंद्रित्र.
- 3 बार के एक कुल के लिए 1.4 और 1.5 दो बार से अधिक चरणों को दोहराएँ. तीसरी बार के लिए centrifuging से पहले, आंदोलन के माध्यम से गोली resuspend और एक सेल गिनती के लिए 500 μl अशेष भाजक प्राप्त.
- व्यवहार्य एक hemacytometer और एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ Trypan नीले अपवर्जन 9 विधि का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
- तैरनेवाला Aspirate और है हाम F-12 मीडिया के एक मात्रा में गोली फिर से निलंबित करने के लिए वांछित बोने घनत्व डबल (उदाहरण के लिए 20 x 10 6 10 10 6 कोशिकाओं encapsulation के बाद मिलीलीटर / एक्स के एक अंतिम एकाग्रता के लिए कोशिकाओं / मिलीलीटर).
2. उपास्थिकोशिका agarose Hydrogel इनकैप्सुलेशन
- हीट 0.8 छ autoclaved प्रकार सातवीं agarose एक गर्म थाली 120 ° C जब तक भंग करने के लिए सेट पर 20 मिलीलीटर बाँझ 1x पीबीएस (7.4 पीएच) में. एक बार भंग, 60 डिग्री सेल्सियस उच्च तापमान के रूप में गर्मी कम wilमैं सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करते हैं.
- एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, डबल agarose (उदाहरण के लिए एक अंतिम 2% agarose hydrogel के लिए 4% agarose निलंबन) के वांछित एकाग्रता के साथ अच्छी तरह से सेल निलंबन के बराबर मात्रा में मिश्रण. बड़े बुलबुले के रूप में वे सेल व्यवहार्यता को प्रभावित और थकान जीवन का निर्माण कर सकते हैं के निर्माण से बचें.
- एक 60 मिमी व्यास पेट्री डिश में सावधानी अशेष भाजक मिश्रण उपास्थिकोशिका agarose के 10 मिलीग्राम, जबकि बड़े बुलबुले के निर्माण से परहेज.
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए खड़े जब तक gelled चलो.
- के रूप में प्राप्त कई उपास्थिकोशिका agarose hydrogel नमूने के रूप में (20-30 आमतौर पर) की जरूरत एक 4 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग.
- उपाय और प्रतिनिधि एक micrometer का उपयोग कर नमूने (व्यास और ऊंचाई) के भौतिक आयाम रिकॉर्ड. Constructs लगभग 5 मिमी ऊंचाई में हो सकता है, किसी भी एक क्षेत्र है जहां नमूना ऊंचाई विचरण 2% से अधिक था से प्राप्त नमूनों को नकारना चाहिए.
- एक ताजा 60 मिमी पेट्री डिश और पूरक नमूने स्थानांतरणपूरा मीडिया के 10 मिलीलीटर (जैसे 20% है हाम एफ 12 संस्कृति मीडिया में 20 मिमी HEPES, 100 ascorbic छ / मिलीलीटर एसिड, और 2x एंटीबायोटिक दवाओं / antimycotics के साथ भ्रूण गोजातीय सीरम) के साथ.
3. मैकेनिकल और की उत्तेजना chondrocyte agarose Hydrogels Radiolabelling
- संपीड़न रिग के धातु घटकों आटोक्लेव. 70% (रातोंरात) इथेनॉल और पराबैंगनी प्रकाश (कम से कम 15 मिनट के लिए) के साथ प्लास्टिक के घटकों जीवाणुरहित.
- पर गिरने, संदंश का उपयोग करते हुए, एक संस्कृति 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं के भीतर 12 बाँझ प्लास्टिक बनाए रखने के छल्ले (एक आंतरिक निर्माण व्यास से बड़ा व्यास के साथ) (n = 6 नमूने, और नियंत्रण) जगह से constructs रखने.
- संदंश का प्रयोग, ध्यान पेट्री डिश 24-अच्छी तरह से थाली chondrocyte agarose hydrogels हस्तांतरण, हर एक को सुरक्षित बनाए रखने की अंगूठी में.
- पूरा मीडिया के 400 μl (उदाहरण के लिए 20% और हाम एफ 12 20 मिमी HEPES, 100 छ / मिलीलीटर ascorbic एसिड के साथ मीडिया संस्कृति में FBS, स्थानांतरणएंटीबायोटिक दवाओं / antimycotics 2x) अच्छी तरह से प्रत्येक नमूना.
- निष्फल संपीड़न रिग (1 चित्रा) इकट्ठा और सेट शिकंजा के साथ सुरक्षित platens. संस्कृति 24 अच्छी तरह से थाली संपीड़न रिग संलग्न.
- छोड़ दें और फिर से सुरक्षित करने के लिए सेट शिकंजा पट्ट hydrogel संपर्क (शून्य तनाव राज्य) की स्थापना.
- एक मच 1 micromechanical टेस्टिंग सिस्टम में इकट्ठे संपीड़न रिग लोड. पिन लगाने और सेट पेंच के साथ जगह में ताला के माध्यम से ऊर्ध्वाधर चरण के लिए सुरक्षित रिग. रिक्ति जिग निकालें.
- वांछित आयाम (जैसे 10% तनाव आयाम नमूनों की मूल ऊंचाई के आधार पर) पर गतिशील compressive लोड हो रहा है, (1 जैसे हर्ट्ज) लागू आवृत्ति और अवधि या चक्रों की संख्या (उदाहरण के लिए 60 मिनट के लिए समय अंतराल).
- यांत्रिक उत्तेजना के पूरा होने पर, रिक्ति जिग की जगह है, पता लगाने पिन सेट पेंच ढीला और संपीड़न और मच 1 micromechanical परीक्षण प्रणाली से रिग संस्कृति की थाली को हटा दें. Radiolabel वांछित आइसोटोप (जैसे [3 घंटे] प्रोलाइन chondrocyte विशिष्ट कोलेजन संश्लेषण और proteoglycan संश्लेषण के लिए सल्फर [35] के लिए प्रोटीन लेबल) 5 μCi के साथ मीडिया का सप्लीमेंट द्वारा सेल hydrogel constructs.
- 37 में 24 घंटे के लिए radiolabeled constructs सेते डिग्री सेल्सियस, 5% 10 2 सह.
- Radiolabeled hydrogel constructs फसल और 1x पीबीएस (7.4 पीएच) में 3 बार कुल्ला करने के लिए किसी भी अनिगमित आइसोटोप हटा. डाइजेस्ट papain (40/20 मिमी अमोनियम एसीटेट में ग्राम मिलीलीटर, 1 मिमी ethyldiaminetetraacetic और 65 पर 2 मिमी dithiothreitol एसिड ° सी 72 घंटा के लिए) का उपयोग कर नमूने.
- डीएनए PicoGreen डाई परख 11 और निगमित आइसोटोप गतिविधि, डीएनए सामग्री के लिए, सामान्यीकृत β तरल 12,13 के तुरंत बाद papain पाचन गिनती जगमगाहट से सामग्री का उपयोग कर के लिए परख डाइजेस्ट.
नोट: रेडियोधर्मी सामग्री की खरीद और निपटान (अपशिष्ट आइसोटोप और आइटम) कि संपर्क रेडियोधर्मी सामग्री में आया हो सकता है प्रासंगिक संस्थागत (और / या सरकारी) नीतियों और सुरक्षित हैंडलिंग और रेडियोधर्मी पदार्थ के निपटान के लिए प्रक्रिया का पालन करना चाहिए.
4. प्रतिनिधि परिणाम
गोजातीय जोड़दार उपास्थिकोशिका agarose hydrogels constructs (10 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल समझाया कोशिकाओं के साथ 2% agarose) यंत्रवत् 20 से 60 (मिनट या 1200 के लिए +३६०० चक्र के लिए 1 हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर 10% compressive तनाव का एक आयाम पर उत्तेजित थे ) और डीएनए और रेडियो आइसोटोप निगमन द्वारा बाह्य मैट्रिक्स संश्लेषण सामग्री के लिए assayed. डीएनए और बाह्य मैट्रिक्स संश्लेषण एक खुराक पर निर्भर ढंग से प्रभावित किया गया था. डीएनए सामग्री उत्तेजना के 20 या 30 मिनट (पी <0.01) का एक परिणाम के रूप में एक महत्वपूर्ण 35% कमी का प्रदर्शन किया है, जबकि उत्तेजना के 60 मिनट कोई प्रभाव का प्रदर्शन (2 चित्रा). उपास्थि विशिष्ट कोलेजन और proteoglycan संश्लेषण (प्रोलाइन [3] और एच के द्वारा निर्धारित[35 एस] निगमन सल्फर, क्रमशः) उत्तेजना के 20 या 30 मिनट (पी <0.01) जवाब में लगभग 60% की उत्तेजना नहीं नमूदार प्रभाव प्रदर्शन के 60 मिनट (चित्रा 3) के साथ काफी बढ़ जाती है, का प्रदर्शन किया.
उपास्थिकोशिका agarose constructs उत्तेजक के लिए चित्रा 1 कस्टम निर्मित गतिशील संपीड़न रिग के योजनाबद्ध वाम: इकट्ठे रिग अधिकार: व्यक्तिगत घटकों दिखा दृश्य विस्फोट.
Agarose उपास्थिकोशिका - डीएनए सामग्री में चित्रा 2 परिवर्तन यंत्रवत् 1 हर्ट्ज पर 20 से 60 मिनट के लिए एक 10% compressive तनाव आयाम (± SEM n = 6/group मतलब है) के तहत प्रेरित hydrogels.
Chondrocyte agarose के बाह्य मैट्रिक्स संश्लेषण (कोलेजन और proteoglycans) में परिवर्तन चित्रा 3. यंत्रवत् hydrogels 10% compressive तनाव आयाम के तहत 20 से 60 मिनट (± SEM, n = 6/group मतलब) के लिए 1 हर्ट्ज पर उत्तेजित.
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Discussion
सेल वरीय agarose hydrogels नियंत्रित यांत्रिक उत्तेजनाओं को लागू करने के लिए वर्णित विधि उपास्थिकोशिका चयापचय पर गतिशील compressive बलों के प्रभाव में प्रत्यक्ष जांच के लिए अनुमति देता है. अंगूठियां बनाए रखने के साथ संयोजन के रूप में कस्टम परीक्षण रिग का उपयोग constructs के लिए पार्श्व बाधा प्रदान नमूना tipping की संभावित समस्याओं से बचने के लिए. मृत भारित लोड सेट कर्मचारियों द्वारा सुरक्षित platens के उपयोग नमूना ऊंचाई में संभावित मतभेदों के बावजूद constructs के साथ सीधे संपर्क सुनिश्चित करता है. के बाद उत्तेजना radiolabeling उपाय सेलुलर biosynthesis संदूषण के लिए क्षमता को कम कर देता है, एक ही परीक्षण करने के लिए गतिशील यांत्रिक उत्तेजनाओं के कई अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जा रिग के लिए अनुमति देता है. इस विधि से आसानी से हो सकता है के विभिन्न यांत्रिक लोड मोड (जैसे कतरनी 1,4, 1,2 तनाव) के प्रभाव की जांच के लिए या विशिष्ट mechanotransduction जिम्मेदार रास्ते को स्पष्ट करने के लिए अनुकूलित कर सकते हैं.
ove_content "> प्रतिनिधि परिणाम सचित्र है कि लगभग 35% की कोशिका मृत्यु की एक छोटी राशि यांत्रिक को प्रभावित करने का निर्माण 15-17 कोषमयता नहीं उत्तेजना की लंबी अनुप्रयोगों के साथ गतिशील उत्तेजना के आवेदन की वजह से हो सकता है, कोशिकी मैट्रिक्स अणुओं जैवसंश्लेषण. द्वारा निर्धारित रेडियो आइसोटोप निगमन, एक गतिशील संपीड़न अवधि के लिए निर्भर प्रतिक्रिया सचित्र गतिशील compressive लोडिंग के 20 से 30 मिनट की अवधि के लिए आवेदन अब durations लगाया यांत्रिक उत्तेजनाओं को एक desensitization प्रभाव प्रकाश में लाना प्रदर्शित होने के साथ अधिक से अधिक anabolic प्रतिक्रिया में हुई. यांत्रिक के लिए सेलुलर desensitization loading 1,2,5,13 पहले से उल्लेख किया गया है, लेकिन इस घटना के समय निर्भर प्रकृति के लक्षण वर्णन में छोटे से जांच किया गया है, इस जानकारी के लिए इष्टतम उत्तेजना की स्थिति का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ बाह्य मैट्रिक्स के संचय को अधिकतम. unde का निर्माणr दोहराया, या लंबी अवधि के, यांत्रिक उत्तेजना के अनुप्रयोगों.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
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