Summary
機能的なT細胞アッセイにおける抗原のソースとして使用するヒト組織の抽出物を調製するための単純なプロトコルが記載されている。この方法は、組織由来の抗原に対するT細胞の反応を測定することができる
Abstract
A、BおよびT細胞によって認識される、適応免疫応答の抗原標的の多くは1に定義されていない。これは、自己免疫疾患や癌2に特に当てはまります。私たちの目的は、自己免疫疾患の1型糖尿病1,3,4,5にヒトT細胞により認識される抗原を調べることである。 T細胞によって認識される抗原が同定されていない組織に対してヒトT細胞応答を分析するために、我々は機能的アッセイ6と互換性のあるフォーマットでヒト組織からタンパク質抗原を抽出する手法を開発しました。抽出方法は、ヒト末梢血単核細胞に有毒であった洗剤が含まれていることをライセートをもたらすので、以前は、未精製の組織抽出物に対するT細胞応答を測定することができなかった。ここでは、ヒトT細胞に有毒ではない形式でヒト組織からタンパク質を抽出するためのプロトコルを記述します。組織はブタン-1 - オール、アセトニトリル、ワットの混合物中で均質化されるER（BAW）。組織抽出液中のタンパク質濃度が測定され、タンパク質の既知の質量をチューブに等分されています。抽出後、有機溶媒は凍結乾燥によって除去される。必要になるまで凍結乾燥組織抽出物を保存することができます。免疫機能、免疫細胞の懸濁液のアッセイに使用するためには、適切な培養培地中で、凍結乾燥した抽出液に直接添加することができる。 PBMCによるサイトカイン産生と増殖は、この方法を用いて調製した抽出物に応じて、容易に測定した。したがって、我々の方法は、T細胞応答の解析における抗原のソースとして使用することができ、人間の組織ライセートの急速な製造を可能にする。我々は、この方法は移植、がんや自己免疫の組織への適応免疫応答の解析を容易にするであろうことを示唆している。
Protocol
1。脾臓組織の準備
- 注 - すべての人間の材料は、感染の危険として扱われるべきであり、すべての手続きは、クラスII層流内閣で実施すべきである。滅菌ハサミとピンセットを用いて、脾臓切片（サイズは〜1-2 CM）から脂肪や繊維組織を除去し、可能な限り外側のカプセル材料の限りを切り落とす。
- 脾臓組織の小片（1〜2 cm 3）をカットし、滅菌した50mlファルコンチューブに各ピースを置きます。
- 液体N 2中に浸漬することにより、組織の断片をスナップインの凍結。
- -80℃で保存同様のプロトコルは、他の組織（複数可）に適しています。
2。ストレージ用ヒト膵島の準備
- CMRL培地で培養膵島。 10ミリリットルコニカルチューブに小島を収集し、5分間1,500 rpmで遠心分離することにより、PBSで2回洗浄する。 PBSを捨て、ペーパータオルの上に簡単に反転管を配置することによって、残った液を排水します。ないように注意する膵島を取り除きます。
- 一度-80℃で液体窒素や店舗内にチューブとスナップ凍結℃に再キャップ、排水
3。抽出液を調製
- 4℃のBAWミックス（10:30:60％v / v）およびストアを準備℃に
- -80℃からチューブを取り外し室温で解凍する。
- 組織片をカバーするのに十分な氷のように冷たいBAWを追加します。小島が3-5 mlを使用しています。脾臓組織のための組織片の大きさに応じて10〜20ミリリットルを使用しています。
- 組織ホモジナイザーを組み立てる。 70％エタノール/水の10〜20 mlを "均質化"によって清掃してください。
- 組織とBAW溶液をチューブにホモジナイザーのプローブを配置した後、複数のバーストで組織をホモジナイズする。その後氷バケツにチューブを保持します。
- 徹底的に10から20まで、70％エタノール/ mlの水とその後のBAWバッファを均質化することにより、サンプル間のホモジナイザーを清掃してください。これは、私たちの後に70％エタノール/水でsamples.Dismantleandクリーンとの間の組織の交差汚染を防止電子。
- 唯一の水溶性物質を含有する抽出物が必要な場合は、RTで10分間4,000 rpmで均質化された組織抽出液を遠心分離します。より多くの粗抽出液が必要な場合は、室温で5分間1,000 rpmでスピン。 BAWの不溶性タンパク質を抽出するための最も適切な手法は、タンパク質の下流分析に依存します。機能的な免疫学的ア ッセイで使用するために我々は以前に、これは6忍容性が良好であることが判明しているように、8 M尿素で不溶性画分を溶解しようとお勧めします。
- きれいなチューブに上清移し、氷の上に置いた。
- BCAアッセイまたは類似を使用して抽出液中のタンパク質の濃度を決定する。
4。乾燥抽出物を凍結
- 必要なタンパク質の質量（ すなわち 、チューブあたり100μg）に応じて、それに応じてホモジネートを希釈し、ラベルの付いた5.0ミリリットル滅菌、ファルコン（12x75 mm）のチューブにアリコートを分注する。私たちは頻繁には100μg/チューブを使用してください。
- 1を使用します各チューブのキャップに3つの穴を作るために8から20ゲージ滅菌注射針。
- 〜10分間ドライアイス上または> 1時間-80℃の冷凍庫に入れて、どちらかのチューブを凍結。 -80℃で保存凍結乾燥機を置くために準備ができるまで。
- 凍結乾燥機のスイッチを入れ、（-100℃）で平衡化させます。これは、約30分かかります。
- ボリュームに応じて、凍結乾燥を3時間以内に完了しますが、我々は日常的に一晩私たちのサンプルを残すことができます。
- 乾燥サイクルが完了した後、真空ポンプのスイッチを切り、ゆっくりチャンバに圧力を許す。ラックを取り外します。
- 無菌フードでは、チューブから穴あきキャップを外し、新しいもの（ファルコン352032）と交換してください。
- -20℃で保存して管サンプルは培養培地、または他の緩衝液中で再構成し、機能的または生化学的アッセイに使用することができる。
5。代表的な結果
図1は、タンパク質の染色を示すゲルは脾臓および膵島枯渇膵臓組織（腺房のラベルが付いている）からの抽出物が搭載されており、ヒト膵島（ラベル付き小島）精製した。結果は、各組織ごとに異なる分子量のタンパク質の良い表現を示しています。
ヒトT細胞増殖を刺激する組織抽出物の容量はCFSEベースの増殖アッセイ7（ 図2）を用いて試験した。このアッセイにおいて使用PBMCは1型糖尿病を持つ個体から単離された。応答の大きさは、83.1 5000、CD4 +、CFSE明るい細胞あたりCFSE 薄暗い細胞数の比として表される：5000 CD4当たりCFSE 薄暗い細胞の+、三連の試料7からの抗原を持つ細胞のCFSE 明るい 。結果は、弱者を示すが、腺房に応じて検出可能な、増殖（CD1 = 3.5）および膵島エキス（6.8）への強い応答。不活化インフルエンザウイルス（CDI = 142.6）は次のように含まれていますポジティブコントロール。
図1タンパク質ゲル。
図2房と膵島エキスに対してCFSEベースの増殖アッセイの結果は。 拡大図を表示するにはここをクリック 。
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Discussion
我々はこのような界面活性剤などの有害な化学物質から自由であったヒト組織からの抽出物を生成したかったので、このプロトコルが開発されました。具体的に我々は、in vitroでのヒト免疫機能のアッセイに使用することができるヒト組織の抽出物を調製し、それを使用している。このプロトコルを使用して調製した抽出液を均等に任意のバッファで再構成し、そのようなウェスタンブロッティングや液体クロマトグラフィーなどの多くの生化学的解析に使用できます。これは、多くの下流のアプリケーションにこの技術が適用可能になります。
我々のプロトコルを使用して、組織抽出物への応答は強くありません。我々は"自己"抗原に対する応答を探しているので、これは予想され、我々の場合には膵島抗原に対するT細胞応答は、頻繁に1弱い。以前に我々は、ヒトCD4 +組換えインスリンおよびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）に対するT細胞応答、1型糖尿病の自己抗原は、私たちのCFSEベースを使用して検出することができることが分かった増殖アッセイ7,8。我々は10を9合成ペプチドを用いて、組換えタンパク質に関連する問題を回避するために、組織抽出物を使用することを選択した。
我々は日常的に私たちの抽出にプロテアーゼ阻害剤を追加しないでください。プロテアーゼ阻害剤の存在下では、抗原の処理および提示11を阻害し 、その結果、T細胞応答を阻害する可能性があります。代わりに、私たちは、プロテアーゼ媒介の劣化を防止するための試みで氷の上で抽出を行う。タンパク質分解が問題となる場合、他のアプリケーションのためのプロテアーゼ阻害剤を含めることは有益であるかもしれません。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、オーストラリア国立保健医療研究評議会（NHMRC＃559007）と若年性糖尿病研究財団（JDRF 4-2006-1025）とビクトリア州政府の業務インフラスキームからの補助金によってサポートされています。我々は、ヒト組織を提供するためのトムマンデル膵島移植プログラムの膵島分離チームのメンバーに感謝。ヒトの組織は、ローカル倫理承認（聖ビンセント病院HREC-011/04とセント·ビンセント健康HREC-135/08）で収集され、使用されていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
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References
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