Summary
기능 T-세포 assays에서 항원의 소스로 사용되는 인체 조직의 추출물을 준비하기위한 간단한 프로토콜은 설명되어 있습니다. 이 방법은 조직 유래 항원에 대한 T 세포 반응을 측정 할 수 있습니다
Abstract
B와 T 세포에 의해 인식 적응 면역 반응의 항원 대상, 대부분은 1 정의되지 않았습니다. 이 면역 질환과 암 2 특히 사실입니다. 우리의 목적은 면역 질병 1 형 당뇨병 1,3,4,5 인간의 T 세포에 의해 인식 항원을 조사하는 것입니다. T 세포에 의해 인식 항원이 발견되지 않는 조직에 대한 인간 T-세포 반응을 분석하기 위해 우리는 기능 assays 6 호환되는 형식으로 인간의 조직에서 단백질 항원을 추출하는 방법을 개발했습니다. 추출 방법은 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포에 독성했다 세제를 포함하는 lysate를 얻을 수 있기 때문에 unpurified 조직 추출물로 이전, T-세포 반응을 측정 할 수 없습니다. 여기 인간의 T 세포에 독성이없는 형식으로 인간의 조직에서 단백질을 추출하기위한 프로토콜을 설명합니다. 조직은 butan-1-안녕, 아세토 니트릴 및 와트의 혼합물에 균질하고 있습니다어 (BAW). 조직 추출물의 단백질 농도는 측정 및 단백질의 알려진 질량은 튜브에 aliquoted 있습니다. 추출 후, 유기 용제는 lyophilization에 의해 제거됩니다. 필요 할 때까지 동결 건조 된 조직 추출물은 저장 될 수 있습니다. 면역 기능, 면역 세포의 정지 assays에 사용하기 위해, 적절한 문화 미디어, 동결 건조 추출물에 직접 추가 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 준비 추출물에 대한 응답으로 PBMC의 시토 킨 생산 및 확산은, 쉽게 측정 하였다. 따라서, 우리의 방법은 T-세포 반응의 분석에서 항원의 소스로 사용할 수있는 인간의 조직 lysates의 급속한 준비를 할 수 있습니다. 이 방법은 이식, 암과 autoimmunity의 조직에 적응 면역 반응의 분석을 용이하게 할 것을 권장합니다.
Protocol
1. 비장 조직을 준비
- 참고 - 모든 인간 자료는 잠재적으로 전염성이 모든 절차는 클래스 II의 층류 내각에서 실시되어야한다로 취급해야합니다. 멸균 가위와 집게를 사용하여, 비장 섹션 (크기 ~ 1~2센티미터)에서 지방과 섬유 조직을 제거하고 가능한 한 바깥 쪽 캡슐 소재의 많은을 잘라.
- 비장 조직의 작은 조각 (1~2센티미터 3) 잘라 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 각각의 조각을 배치합니다.
- 액체 N 2 침수에 의해 조직의 조각을 스냅 - 고정.
- -80에서 저장 ° C. 유사한 프로토콜은 다른 조직 (들)에 적합합니다.
2. 스토리지에 대한 인간의 작은 섬 준비
- CMRL 미디어 문화 섬. 10 ML 원뿔 바닥 관에서 섬을 수집하고 5 분을 위해 1,500 rpm으로 centrifuging하여 PBS로 두 번 씻어. PBS를 넣어하고 종이 타월에 잠시 역 튜브를 삽입하여 잔류 버퍼를 배수한다. 주의하지 말아라섬를 제거합니다.
- -80에서 액체 질소와 매장에서 일단 배수, 재 캡 튜브와 스냅 - 동결 ° C.
3. 추출 준비
- 4에 BAW 믹스 (10:30:60 % V / V) 및 매장 ° C. 준비
- -80 ° C.에서 튜브를 제거 실온에서 해동.
- 조직의 조각을 충당하기 위해 충분한 얼음처럼 차가운 BAW을 추가합니다. 섬 3-5 ML을 사용하십시오. 비장 조직의 경우 조직의 조각의 크기에 따라 10-20 ML을 사용합니다.
- 조직 균질를 조립. 70 % 에탄올 / 물 10-20 ML '을 homogenizing'로 청소하십시오.
- 조직 및 BAW 솔루션 관에 균질 프로브를 삽입 한 후 여러 뿜어의 조직을 균질화. 이후 얼음 양동이에 관세요.
- 철저히 10-20 70 % 에탄올 / 물 ML 후 BAW 버퍼를 homogenizing하여 샘플 사이의 균질를 청소. 이것은 우리 한 후 70 % 에탄올 / 물 samples.Dismantleand 깨끗한 사이의 조직의 교차 오염을 방지5.
- 만 수용성 물질을 포함하는 추출물이 필요한 경우 10 분 동안 RT에서 4,000 rpm으로 균질 조직 추출물을 원심 분리기. 더 많은 원유 추출물가 필요한 경우, 5 분 동안 RT에서 1,000 rpm으로 회전. BAW-불용성 단백질을 추출하기위한 가장 적합한 기술은 단백질의 하류 분석에 따라 달라집니다. 기능 면역의 assays에 사용하기 위해 우리는 우리가 이전에이 잘 6 용납 할 수 발견으로 8 M의 요소에 불용성 일부를 분해하려고 시도하는 것이 좋습니다 것입니다.
- 깨끗한 튜브에 표면에 뜨는 전송과 얼음에 넣어.
- BCA 분석 또는 이와 유사한을 사용하여 추출물의 단백질의 농도를 결정합니다.
4. 건조 추출물을 동결
- 단백질 필수의 질량 (예, 튜브 당 100 μg)에 따라 적절하게 homogenate를 희석하여 표시 5.0 ML 멸균, 매 (12x75 mm) 튜브에 aliquots을 투여. 우리는 자주 100 μg / 튜브를 사용합니다.
- 1을 사용각 튜브의 뚜껑에 3 개의 구멍을 만들 8-20 게이지 멸균 주사기 바늘.
- ~ 10 분에 드라이 아이스 나> 1 시간에 -80 ° C 냉장고에 그들을 배치하여 두 튜브를 고정. -80에서 저장 ° C lyophilizer에 넣어 준비가 될 때까지.
- 냉동 건조기에 전환 (-100 ° C) 평형 할 수 있습니다. 이 약 30 분 정도 소요됩니다.
- 볼륨에 따라 냉동 건조는 3 시간 이내에 완료하지만 우리는 정기적으로 하루 아침에 우리의 샘플을 떠날 수 있습니다.
- 건조 사이클을 완료 한 후, 진공 펌프를 끄고 천천히 챔버로 압력을 수 있습니다. 랙을 제거합니다.
- 멸균 후드에서 튜브에서 구멍 마개를 제거하고 새 (매 352,032)로 교체하십시오.
- -20 ° C.에 상점 튜브 샘플은 문화 미디어, 또는 다른 버퍼에 재구성하고, 함수 또는 생화학 assays에서 사용할 수 있습니다.
5. 대표 결과
그림 1은 단백질의 착색을 보여줍니다젤 비장 및 췌장 고갈 췌장 조직 (acinar 표시)에서 추출물과 인간의 섬을 (라벨 섬) 정화와 함께로드. 결과는 각 조직에 대해 서로 다른 분자량의 단백질의 좋은 표현을 보여줍니다.
인간 T-세포 증식을 자극하는 조직 추출물의 용량은 CFSE 기반 확산 분석 7 (그림 2)를 사용하여 테스트되었습니다. 이 분석에 사용 된 PBMC는 제 1 형 당뇨병과 개인으로부터 격리되었다. 응답의 크기는 항원이없는 5000 CD4 +, CFSE 밝은 세포 당 CFSE 흐린 세포의 수의 비율로 표시됩니다 : 5,000 CD4 당 CFSE 흐린 세포의 +, 세중의 샘플 7 항원과 CFSE 밝은 세포. 결과는 약한를 표시하지만, acinar에 대응 (CD1 = 3.5)와 작은 섬 추출물 (6.8)에 강한 반응 감지, 증식. Inactivated 인플루엔자 바이러스 (CDI = 142.6)이로 포함되어 있습니다긍정적 인 제어 할 수 있습니다.
그림 1. 단백질 젤.
acinar과 작은 섬 추출물에 대한 CFSE 기반의 확산 분석에서 그림 2. 결과. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
우리는 이러한 세제 등 독성 화학 물질에서 자유를 인간의 조직에서 추출을 생성 싶었 기 때문이 프로토콜은 개발되었습니다. 특히 우리는 체외에서 인간의 면역 기능의 assays에서 사용할 수있는 인체 조직의 추출물을 준비하는 데 사용했습니다. 이 프로토콜을 사용하여 준비 추출물은 똑같이 버퍼에 재구성 및 blotting 서쪽이나 액체 크로마토 그래피 등 여러 생화학 분석, 사용할 수 있습니다. 이것은 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 적용이 기법을합니다.
우리의 프로토콜을 사용하여 조직 추출물에 대한 응답은 강력한 없습니다. 우리가 '자기'항원에 대한 답변을 찾고 있기 때문에 이것은 예상됩니다, 우리의 경우에는 작은 섬의 항원에 대한 T 세포 반응을 자주 한 약입니다. 이전에 우리는 인간 CD4 + 재조합 proinsulin 및 글루탐산의 탈 카복실 화 효소 (갓)에 T 세포 응답, 제 1 형 당뇨병의 autoantigens가 우리의 CFSE 기반을 사용하여 검색 할 수 있다는 사실을 발견확산 분석 7,8. 우리는 10 9 합성 펩티드를 사용 재조합 단백질과 관련된 문제를 방지하기 위해 조직 추출물을 사용하도록 선택했습니다.
우리는 정기적으로 우리의 extractions에 단백 분해 효소 억제제를 추가하지 마십시오. 단백 분해 효소 억제제의 존재는 항원 처리와 프리젠 테이션 11 억제하고 결과적으로 T-세포 반응을 억제 할 수 있습니다. 대신 우리는 단백 분해 효소로 인한 저하를 방지하기 위해 얼음 속에서 추출을 수행합니다. 단백질 저하 문제가있는 경우 다른 응용 프로그램에 대한 단백 분해 효소 억제제의 포함이 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 호주 국립 보건 의학 연구위원회 (NHMRC # 559007) 및 아동 당뇨병 연구 재단 (JDRF 4-2006-1025)와 빅토리아 정부의 운영 인프라 계획의 보조금에 의해 지원됩니다. 우리는 인간의 조직을 제공하는 톰 Mandel 작은 섬 이식 프로그램 작은 섬 절연 팀의 구성원을 감사드립니다. 인간의 조직이 지역의 윤리적 승인을 수집하여 사용되었다 (세인트 빈센트 병원 HREC-A 011 / 04, 세인트 빈센트의 건강 HREC-A 135 / 08).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
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References
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