Summary
Dans le modèle animal décrit dans notre travail actuel, purifié des anticorps IgG contre un tronçon de 200 acides aminés (aa 757-967) de collagène VII sont injectés à plusieurs reprises dans des souris reproduisant le phénotype des cloques ainsi que les caractéristiques de l'histo-et immunopathologiques caractéristiques pour la santé humaine l'épidermolyse bulleuse acquise (EBA)
Abstract
Phénomènes auto-immunes surviennent chez des personnes en bonne santé, mais quand la tolérance au soi échoue, la réponse auto-immune peut entraîner une pathologie spécifique. Selon Witebsky postulats, l'un des critères de diagnostic d'une maladie auto-immune est que la reproduction de la maladie chez les animaux de laboratoire par le transfert passif d'autoanticorps. Pour l'épidermolyse bulleuse acquise (EBA), un prototype spécifique d'organe maladie auto-immune de la peau et des muqueuses, plusieurs modèles expérimentaux ont été récemment mis en place. Dans le modèle animal décrit dans notre travail actuel, purifié des anticorps IgG contre un tronçon de 200 acides aminés (aa 757-967) de collagène VII sont injectés à plusieurs reprises dans des souris reproduisant le phénotype des cloques ainsi que les caractéristiques de l'histo-et immunopathologiques caractéristiques pour la santé humaine EBA 1. Véritable maladie répandue est généralement considérée 5-6 jours après la première injection et l'étendue de la maladie est en corrélation avec la dose administrée de la collagen VII IgG spécifiques. Les lésions tissulaires (formation de bulles) dans le groupe expérimental EBA est en fonction sur le recrutement et l'activation des granulocytes par des tissus assortis autoanticorps 2, -4. Par conséquent, ce modèle permet la dissection de la voie de granulocytes-dépendante inflammatoire impliquée dans les lésions tissulaires auto-immunes, comme le modèle ne reproduit que la cellule T-indépendante phase de la réponse auto-immune efférente. De plus, sa valeur est soulignée par un certain nombre d'études démontrant le potentiel blister induisant des anticorps in vivo et étudier le mécanisme de la formation de bulles dans l'EBA 1,3, -6. Enfin, ce modèle va grandement faciliter le développement de nouvelles thérapies anti-inflammatoires dans les maladies provoquées par des auto-anticorps. Dans l'ensemble, le modèle de transfert passif des animaux de l'EBA est un modèle de la maladie accessible et instructif et aidera les chercheurs à analyser non seulement la pathogenèse EBA mais pour répondre fondamentale biologiquement et cliniquementdes questions d'auto-immunité essentielles.
Protocol
1. Préparation de l'anticorps pathogène
Remarque: La purification et la concentration des anticorps doit être effectuée le même jour, que les anticorps ne doivent pas être stockés dans la glycine 0,1 M pH 2,5 à 3 (tampon d'élution) pendant la nuit (ON).
La purification par affinité des IgG: utiliser 25 ml de sérum de lapin immunisé:
- Décongeler le sérum de lapin ON à 4 ° C, le mélanger 1:1 avec 1xPBS (tampon de migration) et centrifuger à 1260 xg pendant 10 min à 20 ° C. Éventuellement, une étape de filtrage avec du papier filtre pourraient être inclus après centrifugation dans le cas où le sérum est gras.
- Pendant ce temps, lavez la protéine G matrice remplie la colonne avec 10 volumes de lit (volume de lit = volume de la matrice) de 1XPBS (tampon de migration).
- Appliquez le sérum dilué et filtré à la colonne et incuber pendant 1 h sur un agitateur oscillant à la température ambiante (RT).
- Recueillir le flux continu (FT) dans un tube de 50 ml Flacon. Ne pas le jeter jusqu'à ce que la concentrationet le titre des IgG purifiée est connue.
- Laver la matrice avec 5 volumes de lit de 1XPBS et en même temps préparer 50 ml tubes Falcon de collecte de la fraction éluée des IgG. Pipette 1 ml de tampon de neutralisation du pH: Tris 1 M pH 10 dans chaque tube (autrement la proportion de 1:20 tampon TRIS par rapport à la quantité d'éluat à collecter).
- Appliquer 100-150 ml de tampon d'élution: 0,1 M de glycine à pH 2,5-3 et reçois la colonne 50 ml fraction (s). Retournez le tube de 2-3x, mesurer le pH et ajouter tampon de neutralisation jusqu'à ce que vous avez atteint le pH 7,2-7,4.
- Recueillir quelques gouttes d'éluat IgG et en utilisant le tampon d'élution comme étalon de mesurer la DO à 280 nm. Si la DO est la collecte <arrêt 0,1.
- Régénérer la matrice protéine G et le stocker en suivant les instructions du fabricant.
Concentration par ultrafiltration Amicon avec des tubes:
- Laver l'Ultra Amicon (15 ml / 30 kDa) des tubes d'ultrafiltration par centrifugation avec 1XPBS 15-20 minà 3220 xg à 4 ° C. Jeter le FT de la Amicon.
- Remplissez les Amicons avec 15 ml d'IgG fraction éluée et centrifuger pendant 25-30 min à 3220 xg et à 4 ° C, le temps de centrifugation dépend toujours de la teneur en protéines de l'éluat.
- Jeter FT et répétez jusqu'à ce ultrafiltration vous n'avez pas de fraction éluée à gauche.
- Laver le concentré d'IgG largement, à deux reprises, avec 1XPBS 25-30 min par centrifugation.
- Recueillir le "collant", solution d'anticorps jaunâtre du filtre Amicon dans un volume final de 1500-2000 ul de 1XPBS.
- Mesure de la concentration préparation d'IgG aide d'un spectrophotomètre ou NanoDrop:
Conc. (Mg / ml) = A (280 nm) x facteur de dilution / 1,4 - Nettoyez et rangez les Amicons en suivant les instructions du fabricant.
2. L'injection de collagène VII IgG spécifiques dans Souris
Avant de commencer la procédure expérimentale réelle, assurez-vous que le pro expérimentaleprotocole est rédigé et tous les matériaux sont préparés pour l'expérience.
- Préparer les feuilles de données pour la notation des maladies, ELISA, immunofluorescence (IF) l'analyse et la myéloperoxydase (MPO) test 4.
- Etiqueter les tubes pour le sang et les organes, cryomolds ainsi que l'histologie traitement et l'incorporation de cassettes.
- Les solutions d'anticorps doivent être préparés frais ou décongelé des stocks et caractérisé à l'égard de leur réactivité (titre par microscopie IF et / ou ELISA). La solution filtrée stérile d'anticorps doit être dilué dans du PBS de façon que la dose requise pour l'injection varie entre 250-1000 pl. Assurez-vous que vous avez assez d'IgG d'effectuer toute l'expérience.
- Préparer une nouvelle anticoagulant: héparine de 20 U / ml et 8,7 mg / ml de kétamine / xylazine 1,3 mélange mg / ml pour l'anesthésie. Lorsque le sacrifice des souris ont marqué les tubes avec du formaldéhyde 3,7% préparée.
- Stériliser les instruments chirurgicaux (scalpel, ciseaux, pointe fine et Curvforcipes ndlr) et de préparer les seringues (seringues à insuline, 1 et 2 seringues ml), aiguilles, appareil photo numérique et une carte mémoire supplémentaire.
Remarque: Effectuez toutes les procédures de kétamine / xylazine ou à l'isoflurane souris narcotized L'isoflurane est l'option préférée anesthésie pour les contrôles quotidiens de la peau, comme des souris de récupérer rapidement.. Toutefois, lorsque vous prenez des photos, 87 mg / kg de kétamine et 13 mg / kg de xylazine est habituellement injecté par voie sous cutanée. Pour l'euthanasie de la dose de kétamine / xylazine est augmentée à 130 mg / kg de kétamine et 20 mg / kg de xylazine.
- Vérifiez les animaux déjà marqués pour leur état de santé général, la peau et l'apparence de la fourrure, les peser et mesurer leur épaisseur de l'oreille (toujours s'en tenir à la même oreille).
- S'inscrire valeurs observées et des changements dans la fiche d'évaluation clinique.
- Recueillir 20-30 ul (2-3 gouttes) le sang de la veine de la queue dans une seringue contenant le même volume d'anticoagulant.
- Désinfecter la fourrure etpeau à l'aide d'éthanol à 80%.
- Injecter la solution d'anticorps voie sous-cutanée dans le dos à l'aide d'une seringue à insuline. (Pour certains sites (par exemple, les oreilles) que de faibles volumes (10-50 pi) sont réalisables à injecter.)
Les injections doivent être répétées tous les deux jours, 4 fois. Balb / c et souris C57BL6 d'un poids d'environ 20 g de commencer à développer la maladie 3-4 jours après la première administration de 400-500 jusqu'à 750 pg / g de poids corporel / injection auto-anticorps.
Lors de la finition de l'expérience:
- Mettez la souris sous narcose profonde en injectant 130 mg / kg et 20 mg / kg de kétamine / xylazine voie sous-cutanée, les être exsangue de la veine cave postérieure et arracher le coeur.
- Recueillir des échantillons de tissus / organes tels que la peau: queue, les oreilles, le sang et l'œsophage et les mettre dans des tubes préalablement marquées et le formaldéhyde, ou 3,7% de PBS remplie.
En revenant à l'laboratoire:
- Centrifuger le sang à 1200 xg, 10 min à température ambiante pour séparer le plasma, transférer le plasma dans des tubes correctement étiquetés et les stocker en conséquence.
- Intégrer la biopsie cutanée en milieu Cut température optimale en utilisant cryomolds, étiqueter correctement, et de les stocker à -80 ° C.
- Placer les échantillons de tissus destinés à l'histologie dans les moules d'enrobage étiquetés et les conserver dans du formol à 3,7% jusqu'à inclusion en paraffine.
3. Évaluation clinique de la gravité de la maladie
Les souris doivent être examinées quotidiennement pour les lésions de la peau et des muqueuses, et les résultats doivent être enregistrés en utilisant les formulaires appropriés. Les critères d'euthanasie précoce les lésions cutanées qui affectent plus de 20% de la surface du corps et une perte de poids de 5-10% du poids total du corps en trois jours consécutifs, comptant pour un score de maladie 5 (Tableau 1).
- Placez la souris sur le ventre. Commencez avec la région de la tête, à savoir le droitoreille et vérifier les ampoules, les érosions, la croûte sur la face interne ainsi que sur le côté extérieur. Continuer de la même façon avec l'oreille gauche.
- Yeux droit et gauche sont contrôlés pour les signes d'érythème, alopécie, des érosions et / ou croûte.
- Le front et la zone de museau sont brossés prochaine, pour continuer avec la partie ventrale du museau, les lèvres et la muqueuse de la bouche.
- Examiner la patte avant droite à partir de la patte, se déplaçant vers le haut; passer à la patte avant gauche. Même procédure avec les jambes droite et gauche de derrière.
- Brosse à travers la fourrure sur le cou et le dos domaine avec une pince courbe à pointe fine.
- Retournez la souris sur le dos et vérifier la partie ventrale ainsi que les côtés ventrales des membres de la même manière que précédemment.
- Vérifiez la queue.
- Prenez des photos de parties du corps sur lesquelles les souris développent une maladie. Une attention particulière doit être accordée à la qualité et la quantité des images.
- Calculer les scores cliniques de la maladie.
4. Analyse des échantillons de peau et Plasma
- Préparer, stocker et / ou de traiter tous les tissus prélevés selon le plan.
- Couper les coupes de tissus congelés pour IF détection des anticorps de lapin et de souris composants du système du complément.
- Analyser le contenu en protéines et enzymes différentes (test FTU) de gelée de tissus et / ou des extraits d'organes.
- Section du tissu inclus en paraffine et colorer avec H & E pour visualiser l'étendue des lésions tissulaires.
- Analyser le plasma par ELISA, immuno-empreinte.
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Representative Results
Le transfert passif d'anticorps spécifiques d'antigènes résultats dans une maladie épanouie chez la souris, ressemblant à des niveaux cliniques, histologiques et immunopathologiques l'ABE humaine. Cloques, de croûtes, des érosions et alopécie se développer sur les oreilles, le museau, les pattes, les jambes, le dos et autour des yeux des souris. Les premiers signes cliniques de la maladie sera très probablement apparaître dans les oreilles et / ou de la zone tête. Le dépôt de spécifique IgG de lapin, la souris et le complément C3 est détecté par IF directe à la jonction dermo épidermique dans cryosections de la peau péri-lésionnelle. En cloques lésionnels sous-épidermiques et infiltrat inflammatoire sont vus par l'histologie.
Toutefois, si l'injection de collagène VII pathogènes des anticorps spécifiques est interrompu, l'activité la maladie devient peu à peu plus bas, et dans quelques semaines, les lésions guérissent. Néanmoins, un certain degré d'alopécie cicatricielle post-inflammatoires peuvent persister indéfiniment.
Characterization de l'auto-antigène recombinant (IgG et de pathogènes)
Murin IgG spécifiques du collagène se lie à la jonction dermo-épidermique (figure 2B). La spécificité est évaluée par immuno-empreinte (figure 2C, pistes 3, 4 et 7).
Notation activité de la maladie
L'évaluation clinique de la maladie est basé sur un système de notation que nous avons développé (tableau 1): 0, pas de lésions; 1, moins de 1% de la surface de la peau; 2, 1-5% de la surface de la peau; 3, 5 - 10% de la surface de la peau; 4, 10-20% de la surface de la peau est touché. IgG murin contre le collagène VII induit des lésions cutanées telles que érythème, alopécie, des ampoules, des érosions, des croûtes sur les oreilles, les yeux, le museau, les membres et le tronc des souris Balb / c (Figure 3).
Analyse de tissus et de circulation liés des anticorps spécifiques du collagène
Dépôt d'IgG de lapin, la souris et le complément C3 sont détectéesTED dans surgelés, des coupes de tissus péri-lésionnelle (figure 4D et E respectivement). Les vésicules sous-épidermiques et l'infiltrat inflammatoire sont vus dans des échantillons histologiques (Figure 4F). Anticorps de lapin en circulation sont analysés par ELISA (figure 5). Congelé tissu et / ou des extraits d'organes sont analysées par différents tests pour leur teneur en protéines et enzymes (dosage MPO).
Figure 1. D'ensemble de la cloques in vivo induite par le transfert passif de collagène VII anticorps spécifiques. Lapins sont immunisés avec murin du collagène VII et IgG de lapin est purifié à partir des sérums immuns. Par la suite, les auto-anticorps spécifiques sont injectées par voie sous cutanée à des souris après une injection / calendrier saignement. Les souris sont en cours de vérification pour l'état de santé général et signes de la maladie quotidiens.
Figure 2. Caractérisation des pathogènes collagène VII-IgG spécifique. Indirecte si l'analyse de sel par division normale coupes de peau de souris incubées avec du sérum de lapin pré-immun et avec murins collagène VII résultats spécifiques de lapin sérum immun à aucun dépôt (A) et le dépôt d'auto-anticorps à l' cutanée épidermique (B), respectivement. Les anticorps spécifiques reconnaissent l'antigène (s) ils ont été élevés contre quand immunoblot avec un ensemble de chevauchement des fragments de collagène recombinant murin VII est effectuée (C, pistes 3, 4 et 7).
Figure 3. L'évaluation clinique de la souris. IgG murin de collagène VII induit des lésions cutanées telles que l'alopécie, des ampoules, des érosions, des croûtes sur les oreilles, les yeux, le museau, limbs et le tronc des souris Balb / c (AD). Souris injectées avec des auto-anticorps spécifiques atteindre un score de 4, alors que les injectées avec NRIgG ou Abs contre une protéine indifférent avaient un score de 0 (E). Le score clinique a été calculée comme suit: 0, pas de lésions; 1, moins de 1% de la surface de la peau; 2, 1-5% de la surface de la peau; 3, 5-10% de la surface de la peau; 4, 10 - 20% de la surface de la peau est touché. La perte de poids de 5-10% du poids total du corps pendant trois jours consécutifs que compte un point de plus dans le score final.
Figure 4. Résultats histo-et immunopathologiques dans des souris injectées avec du collagène VII-IgG spécifique. Dépôt d'IgG de lapin (D), et du complément C3 souris (E) est détecté par IF directe à la jonction dermo épidermique dans cryosections de la peau périlésionnelle, in vivo. En cloques lésionnels sous-épidermiques et inf inflammatoireiltrate est perçue par l'histologie (F). Aucun dépôt d'IgG de lapin (A), la souris C3 du complément (B), ni la formation de cloques sous-épidermique observée chez les témoins (C).
Figure 5. Les concentrations plasmatiques de dosage immunologique de plasma de souris injectées avec du collagène VII IgG spécifiques. D'anticorps circulants de lapin ont été mesurés par ELISA.
Tableau 1. Peau des cloques feuille de pointage maladie. Cliquez ici pour agrandir le tableau .
Système de notation:
- 0, pas de lésions;
- 1, moins de 1% de la surface de la peau;
- 2, 1-5% de la surface de la peau;
- 3, 5-10% de la su la peaurface;
- 4, 10-20% de la surface de la peau est touché.
Des conseils supplémentaires lors de la notation:
- La perte de poids de 5-10% du poids total du corps pendant trois jours consécutifs que compte un point supplémentaire dans les 17 score final.
- Érythème sur les oreilles, autour des yeux sur pattes ne sont que les premiers signes d'une réaction immunitaire continue, si elle n'est pas associée à des ampoules ou alopécie ils ne sont pas quantifiés, vient de prendre sous observation.
- Les marques sur la queue pourrait être bouchée ou des marques de combat, si elles sont présentes dès le début de leur dégradation ne sont pas nécessairement en raison de la maladie. Examiner attentivement surmonter les compter!
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Discussion
Le transfert passif d'anticorps chez des animaux de laboratoire est une approche importante pour démontrer leur pathogénicité 7, -12. Les modèles animaux obtenus grâce à cette méthode, en plus d'être l'une preuve indirecte de l'auto-immunité 13, permettre à l'enquête de la phase efférente du mécanisme pathogène. Le modèle de transfert passif d'anticorps induite par des granulocytes-dépendante la peau des cloques sur l'épidermolyse bulleuse acquise (EBA) a été utilisé pour disséquer les mécanismes de lésions tissulaires dans les dermatoses auto-immunes. Il est apparu également comme une maladie modèle extraordinairement instructif d'étudier fondamentales, biologiquement et cliniquement aspects cruciaux de la médiée par les anticorps spécifiques d'organes maladies auto-immunes qui s'étendent bien au-delà des limites de l'auto-immunité contre le collagène VII. Enfin, ce modèle peut être utilisé pour étudier les processus biologiques fondamentaux et physiopathologiques, y compris la biologie membrane basale, l'activation des granulocytes par des complexes immuns unl'activation du complément d.
Bien que plusieurs paramètres expérimentaux, y compris ex vivo et des modèles animaux, sont disponibles pour la maladie de peau auto-immune EBA 14, de loin la plus appropriée pour étudier les voies de granulocytes-inflammatoires dépendantes est le transfert passif d'anticorps chez les animaux. En contraste avec le modèle ex vivo, où les granulocytes sont ajoutées aux sections peau préalablement incubées avec les 15 auto-anticorps, voici l'infiltration de leucocytes est reproduit spontanément par les souris. En outre, si nous choisissons de travailler avec des anticorps spécifiques dirigés contre l'antigène dans d'autres organismes, comme le lapin et de chèvre, on évite le problème de la disponibilité limitée des patients sérums et nous avons aussi une meilleure chance de se reproduire l'activation du complément et le recrutement des granulocytes 16.
Pour le succès de la reproduction de granulocytes-dépendante cloquage dans le mode de transfert passifl de TSA, il est important d'être en mesure de bien marquer les signes de la maladie, en commençant par un érythème et un oedème par des cloques, des érosions avec des croûtes et alopécie. L'évaluation de la souris est un processus qui doit être appris précédemment. La notation de la maladie doit être effectuée par la même personne, tout au long de l'expérience et toujours secondé par un collaborateur ou une personne de l'aide. Le développement et l'utilisation d'un système de notation normalisé pour chaque maladie expérimentale est de la plus haute importance. La feuille de pointage ci-joint doit donner au lecteur un aperçu de la façon dont les dermatoses cutanées sont évaluées chez la souris.
Quand elle est réalisée, comme indiqué dans la vidéo, le modèle d'auto-anticorps induite cloques sous-épidermique va grandement faciliter la dissection ultérieure des voies dépendantes de granulocytes inflammatoires déclenchées par des auto-anticorps et entraînant des lésions tissulaires. Sa valeur dans la recherche médicale est prise en charge par la perspective prometteuse de développer et de tester de nouveaux antigènes spécifiques T et cellules B ciblées traitements anti-inflammatoires. Enfin, il aidera à répondre fondamentaux biologiquement et cliniquement des questions essentielles d'auto-immunité.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le soutien par des subventions du SI-1281/4-1 Deutsche Forschungsgemeinschaft et ESBIO de la Faculté de médecine de l'Université de Fribourg (pour CS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| recombinant antigen | The plasmids encoding for the recombinant forms of murine collagen VII are available from the corresponding author. | ||
| immune rabbit serum | www.eurogentec.com | We had New Zealand White rabbits immunized with 200 μg of antigen, 3 times at 2 week intervals. For this purpose we have used the services of Eurogentec S.A., Belgium. | |
| Protein G agarose | Roche Applied Science | 11243233001 | |
| Balb/c mice | Charles River Laboratories | ||
| OCT compound, Tissue-Tek | Sakura Finetek | 4583 | OCT, optimal cutting temperature |
| Cryomold standard | Sakura Finetek | 4557 | 25 mm × 20 mm × 5 mm |
| Cryomold intermediate | Sakura Finetek | 4566 | 15 mm × 15 mm × 5 mm |
| Uni-Link-Einbettkassette | R. Langenbrinck | 09-0503 | Histology processing and embedding cassettes |
| Spezial-Tatowierfarbe Schwarz | H. Hauptnerund Richard Herberholz GmbH Co. KG | 71492000 | tattooing paste |
| Tatowierzange TZ1 | EBECO E. Becker Co GmbH | tattooing device | |
| Heparin | Carl Roth GmbH Co. | 7692.1 | |
| Formaldehyde 37% | Carl Roth GmbH Co. | 7386 | |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | K2753-1G | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | X1251-1G | |
| sterile PBS | Biochrom | L182-50 | |
| digital camera | Nikon | Coolpix 5400 | |
| Syringe driven filter unit 0.45 μm | Millipore | ||
| Caliper | Mitutoyo 7309 | 1667338 | Farnell (distributor) |
| disease scoring sheet | example enclosed |
References
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