Summary
Nel modello animale descritto nel nostro lavoro attuale, purificati anticorpi IgG contro un tratto di 200 aminoacidi (aa 757-967) del collagene VII vengono iniettate più volte in topi che riproducono il fenotipo vesciche così come le caratteristiche del isto-e immunopatologiche caratteristiche per la salute umana epidermolisi bollosa acquisita (EBA)
Abstract
Fenomeni autoimmuni si verificano in individui sani, ma quando auto-tolleranza non riesce, la risposta autoimmune può portare a patologia specifica. Secondo Witebsky postulati, uno dei criteri di diagnosi di una malattia autoimmune, come è la riproduzione della malattia in animali da esperimento dal trasferimento passivo di autoanticorpi. Per epidermolisi bollosa acquisita (EBA), un prototipo di organo-specifica malattia autoimmune della pelle e le mucose, diversi modelli sperimentali sono stati di recente istituzione. Nel modello animale descritto nel nostro lavoro attuale, purificati anticorpi IgG contro un tratto di 200 aminoacidi (aa 757-967) del collagene VII vengono iniettate più volte in topi che riproducono il fenotipo vesciche così come le caratteristiche del isto-e immunopatologiche caratteristiche per la salute umana EBA 1. Conclamata malattia diffusa è visto solitamente 5-6 giorni dopo la prima iniezione e l'estensione della malattia correla con la dose somministrata di collagen VII-IgG specifiche. Il danno tissutale (formazione di bolle) nel sperimentale EBA dipende il reclutamento e l'attivazione di granulociti da parte del tessuto-bound autoanticorpi 2, -4. Pertanto, questo modello consente la dissezione del granulociti-dipendente percorso infiammatorie coinvolte nel danno tissutale autoimmune, come il modello riproduce soltanto la cellula T-indipendente fase della risposta autoimmune efferente. Inoltre, il suo valore è sottolineata da una serie di studi che dimostrano il blister che inducono potenziale di autoanticorpi in vivo e indagare il meccanismo di formazione in blister EBA 1,3, -6. Infine, questo modello agevolerà notevolmente lo sviluppo di nuove terapie anti-infiammatorie in autoanticorpi malattie dovute al. Nel complesso, il passivo modello animale trasferimento di EBA è un modello di malattia accessibile e istruttivo e consentirà ai ricercatori di analizzare non solo patogenesi EBA, ma di rispondere a fondamentali biologicamente e clinicamenteautoimmunità domande essenziali.
Protocol
1. Preparazione di anticorpi patogeni
Nota: Purificazione e concentrazione degli anticorpi deve essere eseguito lo stesso giorno, come anticorpi non devono essere immagazzinati in 0,1 M glicina pH 2,5-3 (tampone di eluizione) per tutta la notte (ON).
Purificazione di affinità di IgG: utilizzare 25 ml di siero di coniglio immune:
- Scongelare il siero di coniglio ON a 4 ° C, mescolare 1:1 con 1xPBS (tampone di corsa) e centrifugare a 1260 xg per 10 min a 20 ° C. Facoltativamente, una fase di filtrazione con filtro di carta può essere incluso dopo centrifugazione nel caso il siero è grasso.
- Nel frattempo, lavare la proteina G matrice colonna riempita con 10 volumi del letto (volume del letto = volume matrice) di 1XPBS (tampone di corsa).
- Applicare il siero diluito e filtrato alla colonna e incubare per 1 ora sulla piattaforma oscillante a temperatura ambiente (RT).
- Raccogliere il flow-through (FT) in un tubo da 50 ml Flacon. Non gettarlo fino alla concentrazionee titolo del IgG purificata è noto.
- Lavare la matrice con 5 volumi di letto 1XPBS e nel frattempo preparare 50 ml provette Falcon per la raccolta della frazione eluita IgG. Pipettare 1 ml di tampone di neutralizzazione pH: 1 M TRIS pH 10 in ciascun tubo (altrimenti la proporzione di 1:20 tampone TRIS rispetto alla quantità di eluato da raccogliere).
- Applicare 100-150 ml tampone di eluizione: 0,1 M glicina pH 2,5-3 alla colonna e raccogliere 50 ml frazione (s). Capovolgere il tubo 2-3x, misurare il pH e aggiungere tampone neutralizzante fino a quando hai raggiunto il pH 7,2-7,4.
- Raccogliere gocce di eluato IgG e con il tampone di eluizione come etalon misurare la densità ottica a 280 nm. Se le OD è <0,1 raccolta stop.
- Rigenerare la matrice proteina G e conservarlo secondo le istruzioni del produttore.
Concentrazione mediante ultrafiltrazione Amicon con tubi:
- Lavare il Amicon Ultra (15 ml / 30kDa) tubi di ultrafiltrazione con 1XPBS mediante centrifugazione 15-20 mina 3220 xg a 4 ° C. Eliminare il FT dal Amicon.
- Riempire i Amicons con 15 ml di eluito frazione IgG e centrifugare per 25-30 min a 3220 xg e 4 ° C, il tempo di centrifugazione dipende sempre dal contenuto proteico dell'eluato.
- Eliminare FT e ripetere fino a ultrafiltrazione non avete frazione eluita a sinistra.
- Lavare il concentrato IgG ampiamente, per due volte, con 1XPBS 25-30 minuti per centrifugazione.
- Raccogliere il "appiccicoso", soluzione giallastra anticorpo dal filtro Amicon in un volume finale di 1,500-2,000 pl di 1XPBS.
- Misura la concentrazione di preparazione IgG utilizzando uno spettrofotometro o NanoDrop:
Conc.. (Mg / ml) = A (280 nm) x fattore di diluizione / 1,4 - Lavare e conservare i Amicons seguendo le istruzioni del produttore.
2. L'iniezione di collagene VII-IgG specifiche in topi
Prima di iniziare la procedura attuale sperimentale, assicurarsi che il pro sperimentaleprotocollo è scritto e tutti i materiali sono preparati per l'esperimento.
- Preparare i fogli di dati per il punteggio malattia, ELISA, immunofluorescenza (IF), l'analisi e la mieloperossidasi (MPO) test 4.
- Etichettare le provette di sangue e di organi, cryomolds nonché istologia di trasformazione e Cassette per inclusione.
- Le soluzioni di anticorpo deve essere preparato fresco o scongelato dalle scorte e caratterizzato per quanto riguarda la loro reattività (titolo da microscopia IF e / o ELISA). La soluzione filtrata sterile anticorpo deve essere diluito in PBS in modo che la dose richiesta per l'iniezione varia tra 250-1000 microlitri. Assicurarsi di avere abbastanza IgG per eseguire l'intero esperimento.
- Preparare fresco anticoagulante: eparina 20 U / ml e 8,7 mg / ml di ketamina / 1,3 mg / ml miscela xilazina per anestesia. Quando sacrificare i topi hanno etichettato i tubi con il 3,7% di formaldeide preparato.
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici (bisturi, forbici, punto fine e Curvforcipes DE) e preparare siringhe (siringhe da insulina, 1 e 2 siringhe ml), aghi, fotocamera digitale e scheda di memoria aggiuntiva.
Nota: Eseguire tutte le procedure sui topi narcotizzata ketamina / xilazina o isoflurano isoflurano è l'opzione preferita per l'anestesia dei controlli della pelle ogni giorno, come topi recuperare in fretta.. Tuttavia, quando si scattano fotografie, 87 mg / kg di ketamina e 13 mg / kg di xilazina di solito è iniettato per via sottocutanea. Per l'eutanasia ketamina / xilazina dosaggio viene aumentato a 130 mg / kg e 20 mg di ketamina / xilazina kg.
- Controllare gli animali già segnalati per la loro condizione di salute generale, la pelle e l'aspetto di pelliccia, li pesare e misurare il loro spessore orecchio (sempre rispettare lo stesso orecchio).
- Registrati valori osservati e dei cambiamenti nella scheda di valutazione clinica.
- Raccogliere 20-30 microlitri (2-3 gocce) sangue dalla vena della coda in una siringa contenente lo stesso volume di anticoagulante.
- Disinfettare la pelliccia epelle utilizzando 80% di etanolo.
- Iniettare la soluzione di anticorpi per via sottocutanea nella schiena utilizzando una siringa da insulina. (Per alcuni siti (ad esempio, le orecchie) solo piccoli volumi (10-50 microlitri) sono realizzabili da iniettare.)
Le iniezioni devono essere ripetute ogni due giorni, 4 volte. Balb / c e C57BL6 topi di peso corporeo di circa 20 g iniziare a sviluppare la malattia 3-4 giorni dopo la prima somministrazione di 400-500 fino a 750 mcg / g di peso corporeo / iniezione autoanticorpi.
Quando si finisce l'esperimento:
- Mettere i topi sotto narcosi profonda, iniettando 130 mg / kg e 20 mg / kg di ketamina / xilazina per via sottocutanea, li exsanguinate dalla vena cava posteriore e tagliare il cuore.
- Raccogliere campioni di tessuti / organi come la pelle: coda, l'orecchio, il sangue e l'esofago e metterli in tubi precedentemente etichettati e PBS o 3,7% di formaldeide riempito.
Quando si ritorna allaboratorio:
- Centrifugare il sangue a 1.200 xg, 10 min a RT per separare il plasma, trasferire il plasma per tubi etichettati e conservare di conseguenza.
- Incorporare il biopsia cutanea in ambiente ottimale Temperatura Tagliare con cryomolds correttamente, etichette, e conservarli a -80 ° C.
- Posizionare i campioni di tessuto destinati istologia nelle formelle etichettati e tenerli nel 3,7% di formaldeide fino inclusione in paraffina.
3. La valutazione clinica della gravità della malattia
I topi devono essere esaminati tutti i giorni per le lesioni della cute e delle mucose ed i risultati devono essere registrati utilizzando i moduli appropriati. I criteri per eutanasia precoce è lesioni cutanee colpiscono oltre il 20% della superficie del corpo e una perdita di peso del 5-10% del peso corporeo totale in tre giorni consecutivi, contando per un punteggio malattia di 5 (Tabella 1).
- Posizionare il mouse sul ventre. Inizia con la zona della testa, vale a dire con la destraorecchio e verificare la presenza di bolle, erosioni, crosta su quello interno, nonché sul lato esterno. Proseguire allo stesso modo con l'orecchio sinistro.
- Gli occhi destro e sinistro sono controllati per i segni di eritema, alopecia, erosioni e / o in crosta.
- Fronte e la zona muso sono spazzolati fino al successivo, continuando con la parte ventrale del muso, labbra e la mucosa della bocca.
- Esaminare la gamba anteriore destra a partire dalla zampa, in movimento verso l'alto, passare alla zampa anteriore sinistra. Stessa procedura con le gambe posteriori destro e sinistro.
- Spennellare con il pelo sul collo e sulla schiena zona con una pinza curva punta fine.
- Accendere il mouse sul dorso e controllare la parte ventrale e ai lati ventrali degli arti allo stesso modo come in precedenza.
- Controllare la coda.
- Scattare foto di parti del corpo in questione, qualora i topi sviluppano la malattia. È necessario prestare attenzione alla qualità e quantità delle immagini.
- Calcolare i punteggi clinici di malattia.
4. Analisi di campioni di pelle e Plasma
- Preparare, archiviare e / o elaborare tutti i tessuti raccolti secondo il piano.
- Tagliare sezioni di tessuto congelato per IF rilevamento di anticorpi di coniglio e mouse componenti del sistema del complemento.
- Analizzare il diverso contenuto di proteine e di enzimi (dosaggio MPO) di tessuti congelati e / o estratti di organi.
- Sezione la paraffina incorporato tessuto e macchia con H & E di visualizzare l'entità del danno tissutale.
- Analizzare il plasma mediante ELISA, immunoblot.
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Representative Results
Il trasferimento passivo di anticorpi antigene specifici risultati in una malattia in piena regola nei topi, che assomigliano a livelli clinici, istologici e immunopatologiche l'EBA umano. Blister, croste, erosioni e alopecia sviluppano sulle orecchie, muso, zampe, gambe, schiena e intorno agli occhi dei topi. I primi segni clinici della malattia probabilmente apparirà sulle orecchie e / o della zona testa. Deposizione di specifiche IgG di coniglio, e il mouse del complemento C3 viene rilevato da diretta IF all'incrocio cutanea epidermica in criosezioni di pelle perilesionale. Nella formazione di vesciche lesionali subepidermiche e infiammatorie infiltrano sono visti da istologia.
Tuttavia, se l'iniezione di collagene VII-patogeni specifici anticorpi viene interrotto, l'attività della malattia diventa gradualmente minore, ed entro alcune settimane le lesioni guariscono. Tuttavia, un certo grado di postinfiammatoria alopecia cicatriziale può persistere indefinitamente.
Caratterizzione del autoantigene ricombinante (e di patogeni IgG)
Murino collagene IgG specifiche si lega alla giunzione dermo-epidermica (Figura 2B). La specificità è valutata mediante immunoblot (Figura 2C, corsie 3, 4 e 7).
Segnare l'attività della malattia
La valutazione clinica della malattia si basa su un sistema di punteggio abbiamo sviluppato (Tabella 1): 0, nessuna lesione, 1, meno dell'1% della superficie della pelle, 2, 1-5% della superficie della pelle, 3, 5 - 10% della superficie della pelle, 4, 10-20% della superficie della pelle è influenzata. IgG contro murino collagene VII induce lesioni cutanee quali eritema, alopecia, bolle, erosioni, croste sulle orecchie, occhi, muso, degli arti e del tronco di topi Balb / c (Figura 3).
L'analisi dei tessuti-bound e di circolazione collagene anticorpi specifici
La deposizione di IgG di coniglio, e il mouse del complemento C3 sono DATECTED nella surgelati, sezioni di tessuto perilesionali (Figura 4D ed E rispettivamente). Le bolle subepidermiche e infiammatorio sono visti in campioni istologici (Figura 4F). Coniglio anticorpi circolanti sono analizzati mediante ELISA (Figura 5). Congelati tessuti e / o estratti di organi vengono analizzati mediante saggi diversi per il loro contenuto di proteine e saggio enzimatico (MPO).
Figura 1. Schema generale della formazione di bolle in vivo indotta dal trasferimento passivo di collagene VII-anticorpi specifici. Conigli sono immunizzati con murino collagene VII e IgG di coniglio viene purificato dal sieri immuni. Successivamente, gli autoanticorpi specifici vengono iniettati per via sottocutanea in topi a seguito di una iniezione / pianificazione sanguinamento. I topi sono stati controllati per condizione di salute generale e segni della malattia ogni giorno.
Figura 2. Caratterizzazione dei patogeni collagene VII-IgG specifiche. Indiretto se l'analisi di sale-split sezioni normali della pelle del mouse incubati con siero pre-immune di coniglio e con murine collagene VII-specifici risultati coniglio siero immune in nessun deposito (A) e della deposizione degli autoanticorpi al dermica epidermica (B), rispettivamente. Gli anticorpi specifici riconoscere l'antigene (s) sono stati allevati contro quando immunoblot con una serie di sovrapposizione di frammenti ricombinanti murine collagene VII viene eseguita (C, corsie 3, 4 e 7).
Figura 3. Valutazione clinica dei topi. IgG di topo collagene VII induce lesioni cutanee come l'alopecia, bolle, erosioni, croste sulle orecchie, occhi, muso, limbs e tronco di topi Balb / c (AD). I topi iniettati con autoanticorpi specifici raggiungere un punteggio di 4, mentre quelli iniettati con NRIgG o Abs contro una proteina indifferente avevano un punteggio pari a 0 (E). Il punteggio clinico è stato calcolato come segue: 0, nessuna lesione, 1, meno dell'1% della superficie della pelle, 2, 1-5% della superficie della pelle, 3, 5-10% della superficie della pelle, 4, 10 - 20% della superficie della pelle è influenzata. La perdita di peso del 5-10% del peso totale del corpo per tre giorni consecutivi conta come un punto in più del punteggio finale.
Figura 4. Risultati istopatologia e immunopatologiche in topi iniettati con collagene VII-IgG specifiche. Deposizione di IgG di coniglio (D), e il mouse complemento C3 (E) è rilevato diretta IF all'incrocio dermica epidermica in criosezioni di pelle perilesionale, in vivo. Nella formazione di vesciche lesionali subepidermiche e inf infiammatoriailtrate è visto da istologia (F). No deposizione di IgG di coniglio (A), mouse complemento C3 (B), né è la formazione di bolle sottoepidermica visto nei controlli (C).
Figura 5. I livelli plasmatici Immunoassay di plasma da topi iniettati con il collagene VII-IgG specifiche. Circolanti di anticorpi di coniglio sono stati misurati con metodo ELISA.
Tabella 1. Della pelle vesciche punteggio foglio di malattia. Clicca qui per ingrandire tavolo .
Sistema di punteggio:
- 0, nessuna lesione;
- 1, meno dell'1% della superficie della pelle;
- 2, 1-5% della superficie della pelle;
- 3, 5-10% della SU pellerfaccia;
- 4, 10-20% della superficie della pelle è influenzata.
Suggerimenti extra quando punteggio:
- La perdita di peso del 5-10% del peso totale del corpo per tre giorni consecutivi conta come un punto in più nel 17 punteggio finale.
- Eritema sulle orecchie, intorno agli occhi sulle zampe sono solo i primi segnali di una reazione immunitaria in atto, se non in coppia con vesciche o alopecia non sono quantificati, appena preso sotto osservazione.
- Segni sulla coda potrebbe essere morso o marchi di lotta, quindi se sono presenti fin dall'inizio il loro peggioramento potrebbe non essere necessariamente a causa della malattia. Considerare attentamente resistere a contarli!
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Discussion
Il trasferimento passivo di anticorpi in animali sperimentali è un approccio importante per dimostrare la patogenicità 7, -12. Modelli animali ottenuti mediante questo metodo, oltre ad essere la prova indiretta per autoimmunità 13, permettono l'indagine della fase efferente del meccanismo patogenetico. Il modello di trasferimento passivo di anticorpi indotta granulociti-dipendente pelle vescicole di epidermolisi bollosa acquisita (EBA) è stato utilizzato per analizzare i meccanismi di danno tissutale nelle dermatosi autoimmuni. È emerso anche, come malattia modello squisitamente istruttivo studiare aspetti fondamentali, biologicamente e clinicamente cruciali di malattie autoimmuni mediata da anticorpi organo-specifiche che vanno ben oltre i limiti di autoimmunità contro collagene VII. Infine, questo modello può essere usato per studiare processi biologici fondamentali e fisiopatologico la biologia membrana basale, attivazione granulociti da immunocomplessi und attivazione del complemento.
Sebbene diverse impostazioni sperimentali, inclusi ex vivo e in modelli animali, sono disponibili per la malattia della pelle autoimmune EBA 14, di gran lunga il più adatto per studiare le vie infiammatorie granulociti-dipendenti è il trasferimento passivo di anticorpi in animali. In contrasto con il modello ex vivo, in cui vengono aggiunti i granulociti alle sezioni di pelle precedentemente incubate con gli autoanticorpi 15, qui l'infiltrazione di leucociti è riprodotta spontaneamente dai topi. Inoltre, se si sceglie di lavorare con anticorpi specifici diretti contro l'antigene in altri organismi, come il coniglio e di capra, si evita il problema della disponibilità limitata sieri dei pazienti e abbiamo anche una migliore possibilità di riprodurre l'attivazione del complemento e il reclutamento di granulociti 16.
Per il successo riproduttivo di granulociti-dipendente vescicole in modalità trasferimento passivol di EBA, è importante essere in grado di segnare adeguatamente i segni della malattia, partendo con eritema ed edema attraverso bolle, erosioni con croste e alopecia. La valutazione dei topi è un processo che deve essere precedentemente appreso. Il punteggio della malattia deve essere effettuata dalla stessa persona, durante tutto l'esperimento e sempre distaccato da un collaboratore o di una persona di aiuto. Lo sviluppo e l'uso di un sistema di punteggio standardizzato per ogni malattia sperimentale è della massima importanza. La scheda di valutazione allegata dovrebbe dare al lettore una visione come dermatosi della pelle sono valutati nei topi.
Quando eseguita, come mostrato nel video, il modello di autoanticorpi indotta vesciche sottoepidermica agevolerà notevolmente la dissezione ulteriormente le vie infiammatorie granulociti-dipendenti attivati da autoanticorpi e con conseguente danno tissutale. Il suo valore nella ricerca medica è sostenuta dalla prospettiva promettente di sviluppare e testare nuove antigene-specifici T e cellule B mirate terapie anti-infiammatorie. Infine, vi aiuterà a rispondere a fondamentali biologicamente e clinicamente autoimmunità domande essenziali.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il supporto da finanziamenti della Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 e BIOS della Facoltà di Medicina dell'Università di Friburgo (a CS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| recombinant antigen | The plasmids encoding for the recombinant forms of murine collagen VII are available from the corresponding author. | ||
| immune rabbit serum | www.eurogentec.com | We had New Zealand White rabbits immunized with 200 μg of antigen, 3 times at 2 week intervals. For this purpose we have used the services of Eurogentec S.A., Belgium. | |
| Protein G agarose | Roche Applied Science | 11243233001 | |
| Balb/c mice | Charles River Laboratories | ||
| OCT compound, Tissue-Tek | Sakura Finetek | 4583 | OCT, optimal cutting temperature |
| Cryomold standard | Sakura Finetek | 4557 | 25 mm × 20 mm × 5 mm |
| Cryomold intermediate | Sakura Finetek | 4566 | 15 mm × 15 mm × 5 mm |
| Uni-Link-Einbettkassette | R. Langenbrinck | 09-0503 | Histology processing and embedding cassettes |
| Spezial-Tatowierfarbe Schwarz | H. Hauptnerund Richard Herberholz GmbH Co. KG | 71492000 | tattooing paste |
| Tatowierzange TZ1 | EBECO E. Becker Co GmbH | tattooing device | |
| Heparin | Carl Roth GmbH Co. | 7692.1 | |
| Formaldehyde 37% | Carl Roth GmbH Co. | 7386 | |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | K2753-1G | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | X1251-1G | |
| sterile PBS | Biochrom | L182-50 | |
| digital camera | Nikon | Coolpix 5400 | |
| Syringe driven filter unit 0.45 μm | Millipore | ||
| Caliper | Mitutoyo 7309 | 1667338 | Farnell (distributor) |
| disease scoring sheet | example enclosed |
References
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