Summary
工程肌肉组织再生医学具有巨大的潜力，作为疾病模型，也可作为肉类的替代来源。在这里，我们描述的工程的肌肉构造，在这种情况下，从小鼠成肌细胞的祖细胞，通过电脉冲刺激。
Abstract
工程的肌肉组织，可用于几个不同的用途，包括用于生产的组织在体外作为一种疾病模型， 如学习压力性溃疡，再生医学和肉类替代1。首次报道的3D肌肉结构已作了很多年前在该领域的先驱，是Vandenburgh和他的同事2,3。在肌肉组织工程取得的进展不仅是广大的生化因子，干细胞和祖细胞知识增益的结果，但研究人员所获得的洞察力，特别是基于物理因素发挥重要作用，在控制细胞的行为，组织的发展。国家的最先进的工程肌肉构造目前包括人口细胞的水凝胶结构。在我们的实验室中，这些通常由鼠成肌细胞的祖细胞，分离出小鼠后肢肌肉或小鼠成肌细胞系C2C12，MIXED与胶原/基底膜的混合物，并镀两个锚固点之间，模仿肌肉韧带。其他细胞可能被视为良好， 例如 ，替代的细胞系，例如L6大鼠成肌细胞4，新生儿肌源性祖细胞5，来自成年肌肉组织从其他物种如人类6甚至诱导式多能性干细胞（iPS细胞）7的细胞。细胞收缩引起的细胞的取向沿长轴的构建体8,9和文化约一个星期后的肌肉祖细胞的分化。此外，应用程序可以增强电刺激分化的过程中，在一定程度上8。由于其有限的尺寸（8×2×0.5 mm）的完整的组织可以使用共焦显微镜分析，监视例如生存能力，分化和细胞对准。根据特定的应用要求的enginee红色的肌肉组织会有所不同， 例如用于再生医学需要向上缩放的组织大小和血管，而作为一个肉替代的词条到其他物种是必要的。
Protocol
1。小鼠成肌细胞的祖细胞或C2C12细胞培养
- 隔离细胞根据最初由谢费尔和他的同事10出版和购买适于由Collins 等人 11和博南等12的协议，并在液氮中存储这些。这需要小鼠， 如之C57B1 / 6。在其他实验室所使用的替代方法， 例如李瑛等人发表在杂志的可视化实验的方法13。对于试剂和设备，被称为第7和第8页上的表。从一个鼠标的肌肉，一般情况下，你会得到足够的细胞冷冻保存在液氮中约20瓶。下一步，我们启动协议解冻的细胞从液氮储存。
- 细胞来自1小瓶放置到一个25cm 2的基质胶（1毫克/毫升）涂覆的组织培养烧瓶中，并加入生长培养基（GM）的组成的（335毫升DMEM培养液，100毫升胎儿鲍文先进E无血清（FBS），50毫升HS，5 ml青霉素/链霉素，5毫升L-谷氨酰胺，5毫升鸡胚提取物（CEE））。
注：涂层在室温2小时，取出Matrigel的愿望。
- 继代培养的细胞约为1:3，每3天。
这意味着：在第3天的通道：一个25厘米2至75cm 2的烧瓶中，在第6天：传代细胞的细胞从一个75cm 2的烧瓶中的两个150厘米2培养瓶中（预镀在未涂覆的烧瓶中，用30分钟）。天9转印1150厘米2烧瓶1三重150厘米2烧瓶中，或者如果不可用三个150厘米2烧瓶（如果需要的话preplate再次取决于细胞的表型）。第12天的细胞是成肌肉结构的播种做好准备。
注： -每三重150厘米2的细胞数，将约4.5×10 6细胞。
- 使用通过LS从不同的隔离，将它们混合播种时，以获得混合的细胞群。
注：如果您选择不与原代细胞，C2C12成肌细胞是一个很好的选择。
2。工程骨骼肌组织
- 准备硅胶水混合的“弹性体”与“固化剂”（10:1）。切+ / - 5毫米见方的段维可牢尼龙搭扣，与一个三角形侧（房子的形状， 图1）。胶入井的6孔培养板中，在约12毫米之间的正方形的空间的维可牢尼龙搭扣。
注： -仅使用软边的魔术贴，面对这一边向上。
- 确保面对对方的屋顶。
- 仅覆盖魔术贴，不扩散硅胶胶在整个井。
- 对于购买电刺激，它是相关的对准结构，在垂直方向上的阱复数吃（沿长轴方向）。
- 发布在真空烘箱中干燥过夜，不加热，主要以除去气泡。由孔中并孵育15分钟加入70％乙醇消毒。用PBS冲洗3倍，并在紫外光下15分钟。卸下所有PBS井和魔术贴和地方的孵化器，直到使用。
- 解冻Matrigel的溶液在冰箱和不久之前作出的3D结构制备的胶原蛋白溶液稀释至所需浓度。用无菌的0.02％的乙酸（最终浓度为3.2毫克/毫升）稀释股票胶原。
注：把一切都放在冰上。
- Trypsinize细胞，重悬在通用汽车和计数。留在孵化器的离心管中的细胞。
- 加入所需量的胶原蛋白原液你想的管（根据表1）的构造的数字，这种胶原溶液中添加0.5M的NaOH直到浅粉结肠r是表示的pH值为7.5。通过移液向上和向下轻轻混匀，并避免形成气泡。然后加入基质胶和非常轻柔但彻底混合。最后，加入GM到胶原/ Matrigel的混合物的（相应的金额见表1）。
注： -在冰上进行每一步！基底膜和胶原蛋白很容易在温度升高凝胶。
- 介意的颜色确实是粉红色的！ pH值的增加也将导致快速的凝胶。
- 胶原蛋白的最终浓度：1.6毫克/毫升。
- 离心所需量的细胞以1,000 rpm离心5分钟，并除去上清液。
注： -根据每构建的细胞的数量需要被调整的细胞的活性。通常情况下，750,000和1,250,000之间的细胞数在于细胞每构造。
- 使用一些凝胶混合物重悬细胞沉淀和细胞转移到剩余的混合物调匀，但不引入气泡。
- 预热孔板的孵化器和吸管0.35 -0.4毫升的细胞凝胶混合成的维可牢尼龙搭扣第一。然后，开始吸取试剂的混合物从附着位点之间的中心并延伸的维可牢尼龙搭扣。最后，使用剩余的凝胶，两者之间的维可牢尼龙搭扣的锚和移液器各地的维可牢尼龙搭扣件，填补了国内空白。
- 如果仔细检查后5-10分钟的凝胶是足够牢固，能够被转移， 即轻轻拍打菜肴和视觉检查，如果凝胶是刚性的。如果是这样，小心地将菜肴的孵化器。通常，它们可以被拾起后10分钟。然后，1-2小时后，轻轻地覆盖每一个凝胶4毫升的温暖GM。
注：处理板时，不要剧烈运动。
- 更换GM分化培养基（生长培养基没有鸡胚提取物）后24小时，并更换新鲜培养基，每2-3天。在第7天，你应该已获得成熟导向的肌纤维，可以评价用染色横纹发展中的稠合的肌纤维。
3。电刺激
- 消毒电极从ionoptix板（见表的试剂和设备），在使用前用70％乙醇，随后干燥的紫外光照射下在安全柜。放置到培养板与构造的电极板，并从培养板和转移到孵化器的盖覆盖。用适当的电缆连接Ionoptix C-佩瑟。
注：旁边的肌肉构造（ 图2）平行放置电极。
- 应用协议如预期的刺激。
注：我们一般使用4 V / CM，6ms的脉冲在频率2Hz。改变培养基刺激过程中，每24小时。
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Representative Results
最终产品将是肌肉如在图3中所示的构造。组织的大小将是约8毫米长，2毫米宽，0.5毫米厚。在分化过程中的电刺激将改变的表达，肌球蛋白重链异构体，但不大大提高的分化的方法，诱导分化培养基8，但也可以应用于电刺激可以肌肉的功能的过程结束时，判断是否，因为将能够充分发展的肌节的肌肉收缩时的电脉冲。
分化和成熟的也可以使用定量PCR来分析基因表达评价和从组织或整装染色的组织样本作出任一节为肌肉成熟标记或横纹的发展（ 例如，α-辅肌动蛋白染色）染色。的肌肉成熟和分化RELA特德基因和肌球蛋白重链的表达包括例如调节因子MyoD，肌细胞生成素，MFR4和MLP和MYH 1，2，4和8 8。已经证明，肌肉组织，其形成确实是肌肉组织，基于基因表达，免疫组织化学染色法和电刺激收缩诱导，以前公布8和与染的成肌细胞前体细胞，C2C12细胞由肌肉组织的横截面图。从本文是显示在图4中。
| 解 | 卷（10肌肉）微升 |
| 胶原蛋白（3.2毫克/毫升，用0.02％乙酸稀释） | 2570（51.3％） |
| 加入NaOH（0.5M） | 10（0.2％） |
| 基底膜 | 430（8.6％） |
| 生长培养基 | 2,000（39.9％） |
| 总 | 5,010（应该足够了足够的溢出和移液损失） |
表1中。生成的组织工程肌细胞和凝胶混合物构造。
图1。切割件的维可牢尼龙搭扣。
图2。拍摄的照片从底部的肌肉构造在一个良好的6孔板中，示出了放置在电极的电极（用白色箭头表示）平行放置的肌肉结构。
图3。一个组织设计了在两片之间的维可牢尼龙搭扣中的6孔培养板的肌肉。
图4。在C2C12细胞（A）和MPC的交叉条纹的典型例子，（B）在工程骨骼肌组织冰冻切片，，非刺激mBAMs的（分化第8天），肌节α-辅肌动蛋白（红色），肌节肌球蛋白（绿色染色。 ）和细胞核（蓝色）。 （AA-AB与BA-BB）放大倍率的盒装的地区（A，B）α-辅肌动蛋白（红色）和肌节肌球蛋白（绿色）。转载许可8。 点击此处查看大图。
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Discussion
肌肉组织工程具有巨大的潜力作为一种疾病模型，药物筛选，在再生医学中的使用和肉类生产。然而，这些应用程序的要求有所不同。我们选择与胶原蛋白和基质胶的组合，因为胶原蛋白可以用于细胞取向和成肌细胞前体细胞，因为需要基底膜衍生的蛋白质的存在下，如在之前的2D研究12确定。此外，纤维蛋白凝胶已在我们的实验室测试，似乎不支持C2C12肌母细胞的祖细胞，胶原蛋白和Matrigel™的混合，尤其是不会导致组织压实14。这里所描述的模型已经被使用在研究压力性溃疡损伤，而使用的细胞系15。对于再生医学中的应用，对人类的卫星细胞的翻译最近已被6,16。另外，作为替代肉类消费量的技术有很大的潜力1。然而，在我们看来，目前的技术需要前进到下一个阶段，以促进其在临床上的使用，以及用于消费。例如，分化左右新生儿阶段停止，并也力生产是比肌肉在体内产生的少得多。另外，虽然可以实现在小鼠，大鼠和人的干细胞的三维结构，隔离，特别是农场动物衍生的肌肉干细胞的分化和成熟，还没有开发那么远1。另外，使用的基底膜和动物衍生的血清需要被省略1。为了进一步在再生医学中的应用，以增加的组织大小，并且需要（neo）的血管和使用灌注生物反应器系统，以克服氧和营养物质的扩散限制。一些初步的血管小结构的研究Ĥ大街在过去的几年9,17,18。
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Disclosures
作者有没有透露。
Acknowledgments
要感谢亚斌吴培养的组织图2给出了，照片是由巴特面包车Overbeeke。 SenterNovem，授予ISO 42022的工作的财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipets | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 - 1,1 mm | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 - 1,6 mm | |
| Pasteur pipet | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
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References
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