工程骨骼肌组织中的小鼠成肌细胞的内皮祖细胞与应用电刺激

Summary

工程肌肉组织再生医学具有巨大的潜力，作为疾病模型，也可作为肉类的替代来源。在这里，我们描述的工程的肌肉构造，在这种情况下，从小鼠成肌细胞的祖细胞，通过电脉冲刺激。

Abstract

工程的肌肉组织，可用于几个不同的用途，包括用于生产的组织在体外作为一种疾病模型， 如学习压力性溃疡，再生医学和肉类替代^1。首次报道的3D肌肉结构已作了很多年前在该领域的先驱，是Vandenburgh和他的同事^2,3。在肌肉组织工程取得的进展不仅是广大的生化因子，干细胞和祖细胞知识增益的结果，但研究人员所获得的洞察力，特别是基于物理因素发挥重要作用，在控制细胞的行为，组织的发展。国家的最先进的工程肌肉构造目前包括人口细胞的水凝胶结构。在我们的实验室中，这些通常由鼠成肌细胞的祖细胞，分离出小鼠后肢肌肉或小鼠成肌细胞系C2C12，MIXED与胶原/基底膜的混合物，并镀两个锚固点之间，模仿肌肉韧带。其他细胞可能被视为良好， 例如 ，替代的细胞系，例如L6大鼠成肌细胞^4，新生儿肌源性祖细胞^5，来自成年肌肉组织从其他物种如人类⁶甚至诱导式多能性干细胞（iPS细胞^）7的细胞。细胞收缩引起的细胞的取向沿长轴的构建体^8,9和文化约一个星期后的肌肉祖细胞的分化。此外，应用程序可以增强电刺激分化的过程中，在一定程度上^8。由于其有限的尺寸（8×2×0.5 mm）的完整的组织可以使用共焦显微镜分析，监视例如生存能力，分化和细胞对准。根据特定的应用要求的enginee红色的肌肉组织会有所不同， 例如用于再生医学需要向上缩放的组织大小和血管，而作为一个肉替代的词条到其他物种是必要的。

Protocol

1。小鼠成肌细胞的祖细胞或C2C12细胞培养

1. 隔离细胞根据最初由谢费尔和他的同事¹⁰出版和购买适于由Collins 等人 ¹¹和博南等¹²的协议，并在液氮中存储这些。这需要小鼠， 如之C57B1 / 6。在其他实验室所使用的替代方法， 例如李瑛等人发表在杂志的可视化实验的方法^13。对于试剂和设备，被称为第7和第8页上的表。从一个鼠标的肌肉，一般情况下，你会得到足够的细胞冷冻保存在液氮中约20瓶。下一步，我们启动协议解冻的细胞从液氮储存。
2. 细胞来自1小瓶放置到一个25cm ^2的基质胶（1毫克/毫升）涂覆的组织培养烧瓶中，并加入生长培养基（GM）的组成的（335毫升DMEM培养液，100毫升胎儿鲍文先进E无血清（FBS），50毫升HS，5 ml青霉素/链霉素，5毫升L-谷氨酰胺，5毫升鸡胚提取物（CEE））。

注:涂层在室温2小时，取出Matrigel的愿望。

3. 继代培养的细胞约为1:3，每3天。
   这意味着:在第3天的通道:一个25厘米²至75cm ^2的烧瓶中，在第6天:传代细胞的细胞....

Results

最终产品将是肌肉如在图3中所示的构造。组织的大小将是约8毫米长，2毫米宽，0.5毫米厚。在分化过程中的电刺激将改变的表达，肌球蛋白重链异构体，但不大大提高的分化的方法，诱导分化培养基8，但也可以应用于电刺激可以肌肉的功能的过程结束时，判断是否，因为将能够充分​​发展的肌节的肌肉收缩时的电脉冲。

分化和成熟的也可以使用定量PCR来分析基因表达评价和从组织或整装染色的组织样本作出任一节为肌肉成熟标记或横纹的发展（ 例如，α-辅肌动蛋白染色）染色。的肌肉成熟和分化RELA特德基因和肌球蛋白重链的表达包括例如调节因子MyoD，肌细胞生成素，MFR4和MLP和MYH 1，2，4和⁸ 8。已经证明，肌肉组织，其形成确实是肌肉组织，基于基因表达，免疫组织化学染色法和电刺激收缩诱导，以前公布⁸和与染的成肌细胞前体细胞，C2C12细胞由肌肉组织的横截面图。从本文是显示在图4中。

.......

Discussion

肌肉组织工程具有巨大的潜力作为一种疾病​​模型，药物筛选，在再生医学中的使用和肉类生产。然而，这些应用程序的要求有所不同。我们选择与胶原蛋白和基质胶的组合，因为胶原蛋白可以用于细胞取向和成肌细胞前体细胞，因为需要基底膜衍生的蛋白质的存在下，如在之前的2D研究¹²确定。此外，纤维蛋白凝胶已在我们的实验室测试，似乎不支持C2C12肌母细胞的祖细胞，胶原蛋白和Matrigel™的混合，尤其是不会导致组织压实^14。这里所描述的模型已经被使用在研究压力性溃疡损伤，而使用的细胞系^15。对于再生医学中的应用，对人类的卫星细胞的翻译最近已被^6,16。另外，作为替代肉类消费量的技术有很大的潜力^1。然而，在我们看来，目前的技术需要前进到下一个阶段，以促进其在临床上的使用，以及用于消费。例如，分化左右新生儿阶段停止，并也力生产是比肌肉在体内产生的少得多。另外，虽然可以实现在小鼠，大鼠和人的干细胞的三维结构，隔离，特别是农场动物衍生的肌肉干细胞的分化和成熟，还没有开发那么远^1。另外，使用的基底膜和动物衍生的血清需.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论（可选）
Matrigel的生长因子减少	Beckton和Dickinson
DMEM（高糖）*	Gibco公司	42430
先进的DMEM	Gibco公司	12491
马血清	Gibco公司	65050-122
胎牛血清	格雷纳	758075
0.45微米和0.22微米针头式过滤器	Whatmann（Schleicher和Scheull）	10462100
L-谷氨酰胺	Gibco公司	25030024
青霉素/链霉素	Gibco公司	10378016
两性霉素	Gibco公司	15290-018
文化塑胶	格雷纳		包括培养瓶和吸液管
鸡胚提取物	美国生物	C3999
巴斯德吸管*	Hilgenberg		巴氏吸管，收缩，与棉，顶端开口L:230毫米，尖端直径0.9 - 1.1毫米
巴斯德吸管*	Hilgenberg		巴氏吸管，收缩，与棉，顶端开口L:尖端直径230毫米，1,4 - 1,6毫米
巴斯德吸管	VWR	612-1702
I型胶原酶*	西格玛	C0130-16
40微米的细胞过滤*	BD猎鹰	352340
19G针
弹性体	道康宁公司	3097358-1004	硅橡胶MDX 4-4210＃
固化剂	道康宁公司		硅橡胶MDX 4-4210＃
尼龙搭扣	正规商店		您可以在正规的商店购买，只能使用柔软的一面
Ⅰ型胶原，鼠尾	BD Biosciences公司	3544236
C-吴佩慈EP文化步行者	Ionoptix
6孔培养板，电刺激	卡特莱特kton迪金森猎鹰	BD猎鹰＃353846
C-DISH培养皿电极	Ionoptix
			*所需要的隔离的细胞（1.1） ＃在同一个工具包